CYP3A5、UGT1A1、UGT2B7基因多態(tài)性與腎移植受者他克莫司血藥濃度的相關(guān)性研究

張七妹，張馨云，鐘詩(shī)龍*

1 三亞市人民醫(yī)院，海南 572000；2 廣東省人民醫(yī)院，廣東510000

鈣調(diào)神經(jīng)蛋白抑制劑他克莫司是腎臟移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)的一線用藥[1]，而其血藥濃度值是否達(dá)標(biāo)，是移植腎長(zhǎng)期存活率的重要影響因素。但他克莫司的治療窗非常窄，血藥濃度過(guò)低可能會(huì)誘發(fā)排斥反應(yīng)，血藥濃度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致毒副反應(yīng)增加[2]。有關(guān)文獻(xiàn)表明，遺傳因素可對(duì)他克莫司血藥濃度產(chǎn)生不同程度的影響，而研究較多的是：CYP3A4 和CYP3A5 以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因ABCB1；其中CYP3A4*18B 與他克莫司血藥濃度顯著相關(guān)[3]，而CYP3A4*22 在亞洲人群中突變率較低，CYP3A4*1B[4，5]與ABCB1[6，7]對(duì)他克莫司的影響尚存爭(zhēng)議。目前公認(rèn)CYP3A5 是參與他克莫司代謝的重要酶系，其影響是較為明確的：CYP3A5*3 在第3 內(nèi)含子引起（6986A→G）突變，使得CYP3A5 純合子（*3/*3）的人不表達(dá)CYP3A5[8]，從而影響他克莫司體內(nèi)代謝，導(dǎo)致不表達(dá)該酶的患者血藥濃度升高。因而臨床藥物基因組學(xué)實(shí)施聯(lián)盟（CPIC）指南推薦腎移植受者根據(jù)CYP3A5 基因型調(diào)整他克莫司的初始給藥劑量[9]。

然而，以上與他克莫司血藥濃度相關(guān)的遺傳因素研究皆集中在I 相代謝酶系和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）存在于許多脊椎動(dòng)物中，是重要的II 相代謝酶之一。人類的UGT 超家族根據(jù)核苷酸序列的相似性分為兩個(gè)家族：UGT1A 和UGT2[10]、UGT1A和UGT2 都參與了許多藥物的代謝[11]，但其基因結(jié)構(gòu)存在明顯的差別,有研究顯示[12，13]，他克莫司代謝過(guò)程會(huì)受UGT 酶影響。但對(duì)于Ⅱ相代謝酶與他克莫司的血藥濃度相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)外非常有限。因此本研究主要針對(duì)CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT2B7*3、UGT1A1*28、UGT2B7*2 基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度之間的相關(guān)性進(jìn)行了探索，以便為腎移植術(shù)后個(gè)體化給藥，提供更多用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品、試劑

西門子Viva-E 儀器（Siemens Healthcare Diagnostics Inc），Real -Time Fluorescent Quantitative Applied B-biosystems VIVA7（Life technologies，美國(guó)）；Applied B-biosystems VIVA7Emit?2000 他克莫司（型號(hào)：8R109UL）定標(biāo)液；Emit?2000 他克莫司（型號(hào)：8R109UL）檢測(cè)試劑；Emit?2000 他克莫司（型號(hào)：8R109UL）預(yù)處理試劑。血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，目錄號(hào)：DP304-03），TIANtough 基因分型PCR 試劑盒2×TaqMan?Universal PCR Master Mix（均為天根生化科技北京有限公司）。

1.2 研究對(duì)象

本研究納入124 例2006 年9 月至2014 年9月在廣東省人民醫(yī)院首次進(jìn)行腎移植手術(shù)的患者，其中男性85 例（占68.5%），女性39 例（占31.5%），全部為漢族；年齡為（42.31±1.27）歲，無(wú)兒童患者，體重（62.7±10.4）kg。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

術(shù)后均采用他克莫司（Astellas Ireland Co.，Ltd，日本）+霉酚酸酯（上海羅氏制藥）+潑尼松（浙江仙琚制藥）三聯(lián)免疫抑制療法：其中他克莫司0.1～0.12 mg·（kg·d）-1，每天2 次，再根據(jù)血藥濃度作劑量調(diào)整；霉酚酸酯0.5～2.0 g·d-1，每天2 次，之后根據(jù)血藥濃度調(diào)整劑量；潑尼松片60～20 mg·d-1。

排除范圍：發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者；合并急性感染患者；多器官移植患者；肝功能異常患者；合并使用腎毒性藥物（如兩性霉素B 等）的患者；合用可能對(duì)他克莫司代謝有影響的藥物[如酮康唑（CYP3A 酶抑制劑）、利福平（CYP3A 酶誘導(dǎo)劑）]的患者；妊娠和哺乳期婦女以及接受過(guò)鼠單克隆抗體診斷或治療的患者。

1.4 他克莫司濃度檢測(cè)

患者規(guī)律服用同一劑量他克莫司并連續(xù)7 天以上，采集清晨服藥前（即末次給藥后12 h）的靜脈血2 mL，置于EDTA 抗凝真空管，全血樣本、定標(biāo)液和質(zhì)控應(yīng)用甲醇和Emit?2000 他克莫司樣本以前處理試劑進(jìn)行前處理，再將處理后的樣本離心，最后取上清液，部分使用Emit?2000 他克莫司檢測(cè)試劑（酶放大免疫測(cè)定法）進(jìn)行測(cè)定。

1.5 基因型檢測(cè)

先采取吸附柱離心提取法提取血樣中DNA，使得所有樣品DNA OD260/280 在1.7～1.9，以達(dá)到純度要求。再采用TaqMan-MGB 探針?lè)▽?duì)提取的DNA 進(jìn)行基因分型。采用Primer5.0 軟件和Beacon Designer 7.91 Demo分別設(shè)計(jì)CYP3A5*3、UGT1A1*28、UGT1A1*6、UGT2B7*2、UGT2B7*3五個(gè)基因型，SNP 的引物和TaqMan 探針見表1。

表1 各基因型引物及探針序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M±Q 表示。以計(jì)數(shù)法計(jì)算各個(gè)基因型的等位基因頻率，再根據(jù)Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律規(guī)則，即（p+q）2=1，即p2+2pq+q2=1 來(lái)計(jì)算各個(gè)基因型的理論頻數(shù)，然后采用卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)各等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，P＞0.05 認(rèn)為研究對(duì)象具體群體代表性；采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)法分析基因型等與他克莫司血藥濃度的相關(guān)性，P﹤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 他克莫司血藥濃度分布

在納入的124 例患者中，測(cè)得他克莫司血藥濃度為（7.07±2.54）ng·mL-1。其中血藥濃度低于5ng·mL-1的有27 例（占比21.8%），血藥濃度高于10ng·mL-1的有11 例（占比8.9%），其中1 例高于20ng·mL-1。

2.2 等位基因與基因頻率分布

分別對(duì)124 例腎移植受者的5 個(gè)SNPs 進(jìn)行分型檢測(cè)，經(jīng)計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)，CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT1A1*28、UGT2B7*2、UGT2B7*3 的突變頻率分別為66.9%、12.1%、15.7%、71.4%、59.7%?；蛐图暗任换蝾l率見表2，經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)分析，其中CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT1A1*28、UGT2B7*2四個(gè)基因型結(jié)果顯示P＞0.05，基因頻率達(dá)到遺傳平衡，表明研究資料具有群體代表性。而UGT2B7*3 顯示P＜0.05，不符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，可能與所選群體為疾病群體以及基因突變有關(guān)。

2.3 基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度的相關(guān)性分析

按不同位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分組，以Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)比較5 個(gè)SNPs 與他克莫司血藥濃度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT2B7*3 基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度存在相關(guān)性（見表2），而UGT1A1*28、UGT2B7*2 基因多態(tài)性與其血藥濃度不相關(guān)，說(shuō)明他克莫司血藥濃度不受UGT1A1*28、UGT2B7*2 基因多態(tài)性影響，而可能與CYP3A5*3、UGT1A1*6、UGT2B7*3 基因多態(tài)性有關(guān)。

表2 5 個(gè)SNPs 的多態(tài)性與他克莫司血藥濃度的相關(guān)性

3 討論

他克莫司是腎移植受者抑制急性排斥反應(yīng)的重要藥物。大量藥物基因組學(xué)研究顯示，他克莫司的代謝及血藥濃度與Ⅰ相代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)；但I(xiàn)I 相代謝酶與其血藥濃度的相關(guān)性研究非常有限。本研究旨在探索Ⅱ相代謝酶UGT1A1*6、UGT1A1*26、UGT2B7*3 和UGT2B7*2 以 及I相代謝酶CYP3A5*3 與他克莫司血藥濃度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CYP3A5*3 是影響他克莫司血藥濃度的最相關(guān)因素（P 值為0.001），與前人研究結(jié)果一致[14]，可能是目前最有效的他克莫司給藥劑量預(yù)測(cè)指標(biāo)。CYP3A 是人體內(nèi)藥物代謝的重要酶系，可參與45%～60%的臨床藥物代謝[15]；但是并不是唯一的代謝酶系，并不能解釋所有的變異情況。

有研究顯示[16]，在亞洲人群中，UGT1A1*6（G71R）基因變異頻率較高（12%），且為東亞人群特有基因變異。UGT1A1*6 位于第1 外顯子，可使UGT1A1 代謝功能降低。秦天等[17]研究提示，除經(jīng)典藥物代謝基因CYP3A5 外，UGT1A1 也可能對(duì)他克莫司的代謝產(chǎn)生影響作用。UGT2B7 主要表達(dá)于肝臟，底物廣泛，其中UGT2B7*2（802C＞T）由于其發(fā)現(xiàn)最早、研究較深，卻也最有爭(zhēng)議[18-20]，而日本發(fā)現(xiàn)UGT2B7*3（211T＞C，A71S）位于底物結(jié)合域，是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的位于此結(jié)構(gòu)域的基因變異，提示可能有功能意義。本研結(jié)果顯示，UGT1A1*6 和UGT2B7*3 與他克莫司血藥濃度有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P 值分別為0.022 和0.014），可能是未來(lái)他克莫司血藥濃度遺傳因素相關(guān)研究的新的突破口。

在本研究中，UGT2B7*3 的基因型GG/GT/TT為27.4%/25.8%/47.8%，等位基因G 和T 的頻率分別為40.3%和59.7%，與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)查得的0.852和0.148 不一致，不符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，可能因?yàn)楸狙芯考{入人群為疾病群體，且不能排除基因突變等因素，因此存在群體代表范圍的局限性，后期仍需擴(kuò)大樣本量、拓寬研究范圍（如群體藥代動(dòng)力學(xué)的相關(guān)研究等）作深入研究。