HPLC一測(cè)多評(píng)法測(cè)定蓽鈴胃痛顆粒中8種成分的含量*

楊 光，陳淑敏，馬靈珍

1 鄭州頤和醫(yī)院 藥學(xué)部，鄭州 450047；2 亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，亳州236800

蓽鈴胃痛顆粒由吳茱萸、醋香附、醋延胡索、蓽澄茄、黃連、海螺蛸等11 味中藥加工而成，臨床上主要用于對(duì)氣滯血瘀以及慢性胃炎引起的胃脘疼痛的治療[1]。蓽鈴胃痛顆粒收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[1]，在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道[2，3]中，僅對(duì)黃連所含鹽酸小檗堿進(jìn)行了定量測(cè)定，而鹽酸小檗堿來(lái)源廣泛，黃連、黃柏、三棵針等多種植物中均含有，此作為蓽鈴胃痛顆粒定量控制指標(biāo)專屬性不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)按照中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，采用HPLC-QAMS 法對(duì)蓽鈴胃痛顆粒中醋延胡索所含活性成分延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，吳茱萸所含代表性成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿，醋香附所含特征成分香附烯酮、圓柚酮和-香附酮含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為提升蓽鈴胃痛顆粒質(zhì)控方法提供支持。

1 儀器與藥品、試劑

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特斯公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；SB25-12DT 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

蓽鈴胃痛顆粒（規(guī)格：每袋裝5 g，批號(hào)：19061923、19102122、19110422）來(lái)源于揚(yáng)子江藥業(yè)。

對(duì)照品：吳茱萸堿（純度：99.6%，批號(hào)110802-201710）、吳茱萸次堿（純度99.7%，批號(hào)110801-201608）、α-香附酮（純度99.4%，批號(hào)110748-202016）、延胡索乙素（純度99.8%，批號(hào)110726-201819）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；香附烯酮（純度95.5%，批號(hào)18051522）購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；圓柚酮（純度：97.4%，批號(hào)PRF8072622）、去氫紫堇堿（純度：97.8%，批號(hào)PRF8062141）、紫堇堿（純度：98.0%，批號(hào)PRF10052142）均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。

乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品貯備液分別精密稱取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿對(duì)照品適量，用70%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.198、0.254、1.978、0.152、0.696、0.804、0.638、0.416 mg·mL-1混合對(duì)照品貯備液。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別用70%乙醇定容至20 mL，制成6 個(gè)系列濃度的線性考察用混標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ，取混標(biāo)溶液Ⅳ作為混合對(duì)照品溶液（吳茱萸堿9.9 μg·mL-1、吳茱萸次堿12.7 μg·mL-1、香附烯酮98.9 μg·mL-1、圓柚酮7.6 μg·mL-1、α-香附酮34.8 μg·mL-1、延胡索乙素40.2 μg·mL-1、去氫紫堇堿31.9 μg·mL-1、紫堇堿20.8 μg·mL-1）。

2.1.3 蓽鈴胃痛顆粒樣品溶液取蓽鈴胃痛顆粒內(nèi)容物適量，研成細(xì)粉，取約2.0 g，稱定，置25 mL量瓶中，加70%乙醇20 mL，超聲處理30 min，放置室溫后用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得蓽鈴胃痛顆粒樣品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液按蓽鈴胃痛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]項(xiàng)下的處方和制法分別制備缺吳茱萸、缺醋香附和缺醋延胡索的陰性樣品，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9.0 min，32.0%A；9.0～16.0 min，32.0%A→48.0%A；16.0～27.0 min，48.0%A→65.0%A；27.0～43.0 min，65.0%A→82.0%A；43.0～50.0 min，82.0%A→32.0%A）；流速：0.9 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm（0～16.0 min 檢測(cè)吳茱萸堿、吳茱萸次堿）[1，4]、242 nm（16.0～27.0 min 檢測(cè)香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮）[5，6]和280 nm（27.0～50.0 min 檢測(cè)延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿）[7，8]；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 專屬性考察

精密吸取“2.1.2～2.1.4”項(xiàng)下溶液各10 μL，依法進(jìn)樣檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，蓽鈴胃痛顆粒樣品溶液色譜圖中8 種成分色譜峰峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按各目標(biāo)化合物色譜峰計(jì)均≥4000。陰性樣品對(duì)蓽鈴胃痛顆粒中8 個(gè)成分的定量測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 8 種成分專屬性HPLC 色譜圖

2.4 線性關(guān)系制備

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下6 個(gè)系列濃度混標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，依法進(jìn)樣測(cè)定8 種成分的峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物峰面積（Y，mAU·min）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰面積，上述8 種成分峰面積的RSD 分別為1.11%、1.07%、0.58%、1.20%、0.82%、0.79%、0.93%和0.99%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批蓽鈴胃痛顆粒樣品（批號(hào)：19061923）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份樣品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰面積，并采用外標(biāo)法計(jì)算其含量，結(jié)果上述8 種成分含量的RSD 分別為1.74%、1.69%、0.95%、1.87%、1.52%、1.44%、1.36%和1.59%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1.3”項(xiàng)下方法臨用新配一份蓽鈴胃痛顆粒（批號(hào)：19061923）樣品溶液，于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣檢測(cè)吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰面積，樣品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定，上述8 種成分峰面積的RSD分別為1.08%、1.10%、0.55%、1.17%、0.79%、0.81%、0.95%和1.01%（n=6）。

2.8 回收率試驗(yàn)

取8 種成分含量已知的同一批蓽鈴胃痛顆粒（批號(hào)：19061923）內(nèi)容物適量，每份約1.0 g，共9份，精密稱定，分別置于25 mL 量瓶中，按《中國(guó)藥典》2015 年版四部要求，精密加入按照目標(biāo)化合物含量另行配制的混合對(duì)照品溶液（吳茱萸堿0.114mg·mL-1、吳茱萸次堿0.156 mg·mL-1、香附烯酮1.212 mg·mL-1、圓柚酮0.094mg·mL-1、α-香附酮0.368 mg·mL-1、延胡索乙素0.412 mg·mL-1、去氫紫堇堿0.326 mg·mL-1、紫堇堿0.248 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成加樣樣品溶液，依法測(cè)定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算各目標(biāo)化合物含量，結(jié)果上述8 種成分平均加樣回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為98.74%（1.13%）、99.62%（0.87%）、100.01%（1.06%）、96.91%（1.17%）、99.35%（1.23%）、98.67%（1.32%）、97.60%（0.94%）和98.42%（0.79%）。

2.9 校正因子（f）的測(cè)定

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的混標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ各適量，依法進(jìn)樣測(cè)定8 種成分的峰面積，以延胡索乙素對(duì)照品為參照，按f 計(jì)算公式：fR/S=fR/fS=（AS×cR）/（AR×cS）（其中AS代表內(nèi)參物峰面積，cR代表其他目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，AR代表其他目標(biāo)化合物峰面積，cS代表內(nèi)參物質(zhì)量濃度）分別計(jì)算得內(nèi)參物與吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、去氫紫堇堿和紫堇堿的平均校正因子為2.4155、1.8333、1.5623、3.1722、1.1284、1.2690 和1.5194，RSD 分別為0.94%、1.76%、0.77%、1.62%、1.05%、1.65%和1.27%。

2.10 f 耐用性考察

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定8 種成分的峰面積，對(duì)比考察儀器（Waters 2695 型、Agilent 1200 型高效液相色譜儀）、色譜柱（Agilent Eclipse C18、Topsil C18、Benetnach C18）、柱溫（28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）和流速（0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL·min-1）對(duì)f 的影響，結(jié)果不同儀器、色譜柱條件下吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、去氫紫堇堿和紫堇堿的平均f 分別為 2.4174、1.8221、1.5584、3.1662、1.1239、1.2655 和1.5143，RSD為0.78%～1.66%；不同柱溫條件下，各成分平均f分別為2.4146、1.8351、1.5629、3.1742、1.1313、1.2751 和1.5254，RSD 為0.63%～1.71%；不同流速條件下，各成分平均f 分別為2.4172、1.8380、1.5661、3.1731、1.1318、1.2741 和1.5243，RSD 為0.87%～1.68%。

2.11 目標(biāo)化合物色譜峰的定位

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄8 種成分色譜峰的保留時(shí)間，以延胡索乙素對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S 峰，采用相對(duì)保留時(shí)間法（即各待測(cè)目標(biāo)化合物與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值）對(duì)待測(cè)目標(biāo)化合物色譜峰進(jìn)行定位，對(duì)比考察上述2 種色譜儀、3 種色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、去氫紫堇堿和紫堇堿的平均相對(duì)保留時(shí)間分別為0.3559、0.4419、0.5920、0.6414、0.7758、1.1094 和1.2930，RSD 分別為1.77%、1.46%、0.84%、0.76%、0.96%、1.08%和0.59%。

2.12 蓽鈴胃痛顆粒一測(cè)多評(píng)（QAMS）法與外標(biāo)法（ESM）含量測(cè)定結(jié)果比較

取3 個(gè)批次蓽鈴胃痛顆粒樣品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液（每個(gè)批次平行3 份），依法測(cè)定8 種成分的峰面積，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算含量，結(jié)果兩方法測(cè)定含量差別不大。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)中醫(yī)配伍理論，參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取君藥之一醋延胡索所含活性成分延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，臣藥之一吳茱萸所含代表性成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿，佐藥之一醋香附所含特征成分香附烯酮、圓柚酮和-香附酮為定量測(cè)定目標(biāo)化合物，為全面評(píng)價(jià)蓽鈴胃痛顆粒的整體質(zhì)量提供參考依據(jù)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相選擇中，參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)甲醇-水[5，6]、乙腈-0.1%冰醋酸溶液[7]和乙腈-0.1%磷酸溶液[4，8]流動(dòng)相體系進(jìn)行了對(duì)比考察，以8 種成分的分離效果為主要指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)色譜圖基線不平穩(wěn)，影響檢測(cè)結(jié)果；乙腈-0.1%冰醋酸流動(dòng)相系統(tǒng)吳茱萸堿和吳茱萸次堿分離效果不佳；乙腈-0.1%磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)目標(biāo)化合物分離效果較好，最終確定“2.2”項(xiàng)下的流動(dòng)相系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-QAMS 法對(duì)蓽鈴胃痛顆粒中8 種成分含量同時(shí)測(cè)定，建立了該品多指標(biāo)化合物質(zhì)量控制模式，該方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，降低了檢驗(yàn)成本，為全面評(píng)價(jià)蓽鈴胃痛顆粒的整體質(zhì)量、確保臨床用藥穩(wěn)定可靠提供了實(shí)驗(yàn)支持。