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    禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染雛雞血液T細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞因子含量變化

    2021-08-31 09:39:16張國(guó)勍高海婷劉超男高雪麗呂曉萍鄭世民
    關(guān)鍵詞:免疫抑制雛雞比值

    張國(guó)勍,邊 洋,高海婷,劉超男,高雪麗,呂曉萍,鄭世民

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

    家禽的腫瘤性疾病,依據(jù)性質(zhì)可分為傳染性腫瘤性疾病和非傳染性腫瘤性疾病,其中非傳染性腫瘤由于通常呈散發(fā)性,其僅影響動(dòng)物福利,并不會(huì)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重大影響,而由致瘤病毒引起的傳染性腫瘤性疾病由于傳播廣泛,且多數(shù)可引發(fā)家禽的免疫抑制,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的影響十分顯著,所以對(duì)禽類致瘤病毒致病機(jī)制的研究有重要的科學(xué)理論和生產(chǎn)實(shí)際意義。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis,RE)是由逆轉(zhuǎn)錄病毒網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染引起的家禽和野禽的一種免疫抑制性、腫瘤性病毒性傳染病。REV分為完全復(fù)制型和不完全復(fù)制型兩種,完全復(fù)制型REV在實(shí)驗(yàn)室主要在雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)增殖并保持毒力,不完全復(fù)制型T株病毒經(jīng)體內(nèi)傳代或在感染的造血細(xì)胞中培養(yǎng)仍可保持其致瘤性,但在雞胚成纖維細(xì)胞上傳代則很快喪失致瘤性[1]。REV感染引發(fā)雛雞矮小病綜合征,其特征是:患禽不但體型矮小,而且法氏囊和胸腺等免疫器官萎縮,網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生,周圍神經(jīng)腫大、腸胃炎、貧血及肝脾細(xì)胞壞死,免疫功能下降。羽毛異常在接種了被REV污染疫苗的雞群中常常見到[2]。 REV感染還可在法氏囊和其他器官中誘發(fā)慢性淋巴樣腫瘤,這些腫瘤是B細(xì)胞起源的,由myc癌基因插入激活引起。還有經(jīng)試驗(yàn)誘導(dǎo)了T細(xì)胞來源的非囊性淋巴瘤,潛伏期短至6周,涉及胸腺、肝臟、心臟和脾臟。REV既可通過與感染雞和火雞接觸水平傳播,也可通過感染耐受禽的卵垂直傳播[3]。急性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤由攜帶v-rel癌基因的REV缺陷T株引起,REV-T株最初從患有白血病的火雞中分離獲得。當(dāng)REV-T株侵入到雛雞體內(nèi)時(shí),其能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的快速增殖,并在1周~3周內(nèi)導(dǎo)致雛雞死亡。有研究表明,切除胸腺的雛雞感染REV后病死率明顯升高,說明細(xì)胞免疫在REV感染時(shí)起到了重要的保護(hù)作用[2]。REV感染雛雞的免疫抑制程度呈年齡相關(guān)性,其中7日齡內(nèi)被病毒感染雛雞的免疫抑制最為嚴(yán)重,REV感染引起的免疫抑制還會(huì)使雛雞易于感染其他致病微生物,或增強(qiáng)其他致病微生物的致病性[4]。REV易于與其他病毒混合感染,并可污染其他禽病疫苗而進(jìn)行傳播[5],故對(duì)于REV的防控較為困難。REV感染后,受感染動(dòng)物常常呈現(xiàn)亞臨診癥狀,不易被獸醫(yī)工作者和養(yǎng)殖者發(fā)現(xiàn),所以加強(qiáng)對(duì)REV免疫致病機(jī)制的研究,對(duì)于防控REV傳播和感染至關(guān)重要。本研究通過檢測(cè)REV感染SPF雛雞后1 d~21 d,外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化,以及免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量變化,探討REV感染對(duì)SPF雛雞外周血液細(xì)胞免疫的抑制作用,為研究REV的免疫致病機(jī)制和獸醫(yī)臨診防控該病提供一定的科學(xué)試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡SPF混合雛雞60只,購自哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.1.2 REV毒株 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織増生癥病毒(REV-T株),購自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC No.CACCAV107)。

    1.1.3 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液,灝洋生物制品科技有限公司產(chǎn)品;RPMI 1640 及胎牛血清,Gibco公司產(chǎn)品;TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10的ELISA 試劑盒,南京金益柏生物科技有限公司產(chǎn)品;Mouse Anti-Chicken CD4+-FITC-抗熒光染料、Mouse Anti-Chicken CD8+-PE -抗熒光染料,美國(guó) Southern Biotech 公司產(chǎn)品。

    1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀(ELx808),美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀(BD Aira Ⅱ),美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 1日齡SPF雛雞60只,隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)和REV感染組(Ⅰ組),每組各30只。Ⅰ組雛雞經(jīng)腹腔感染REV稀釋液(TCID50為10-462/0.1 mL)0.4 mL/只;C組雛雞以同樣方法給予等量滅菌PBS后,分別嚴(yán)格遵守SPF條件進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。

    1.2.2 待檢材料采取及處理 兩組SPF雛雞分別于病毒感染后第1、3、7、14、21天,每組隨機(jī)選取6只雛雞分別稱重并記錄后,進(jìn)行心臟采血。其中3只雛雞血液用于分離血清,分裝后置-80℃保存,用于IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10含量檢測(cè)。另3只雛雞血液用于提取其外周血淋巴細(xì)胞,檢測(cè)血液CD4+和CD8+亞型T淋巴細(xì)胞數(shù)量及2種亞型細(xì)胞數(shù)量比值的變化。

    1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

    1.2.3.1 REV感染雛雞外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量及CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化 取分離好的淋巴細(xì)胞(2×106個(gè)/mL)50 μL,每個(gè)樣品中分別加入2 μL鼠抗雞CD4+-FITC和鼠抗雞CD8+-PE熒光抗體,冰上孵育30 min;孵育結(jié)束后加入1 mL PBS,4℃低溫離心機(jī)以1 000 r/min離心兩次,每次10 min。 最終加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定外周血中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量所占有效細(xì)胞數(shù)量的百分比,并計(jì)算CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值。

    1.2.3.2 REV 感染雛雞外周血IL-2、IL-4、IL-10 及 IFN-γ含量檢測(cè) 將待測(cè)血清樣品取出,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,最后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)段進(jìn)行OD值檢測(cè)。

    1.2.4 數(shù)據(jù)處理分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件處理,t檢驗(yàn)分析組間差異,P<0.01為差異極顯著(**),P<0.05為差異顯著(*)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組雛雞不同時(shí)間點(diǎn)血液CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量及其比值變化

    2.1.1 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化 結(jié)果見圖1和圖2。Ⅰ組雛雞血液CD4+T淋巴細(xì)胞在第1天~第21天時(shí),數(shù)量均顯著低于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01);CD8+T淋巴細(xì)胞在第7天時(shí),數(shù)量明顯增加(P<0.01),但其余時(shí)間點(diǎn)數(shù)量均顯著低于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01)。

    圖1 各組雛雞血液CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化

    圖2 各組雛雞血液CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化

    2.1.2 CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化 結(jié)果見圖3。與C組雛雞相比較,Ⅰ組雛雞血液CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值在第3天顯著增加(P<0.05),在第7和第14天顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),其余差異不顯著(P>0.05)。

    圖3 各組雛雞血液CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化

    2.2 各組雛雞血清免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量變化

    2.2.1 血清IFN-γ和IL-2含量變化 結(jié)果見圖4和圖5。與C組雛雞相比,Ⅰ組雛雞血清IFN-γ在第7天時(shí)含量極顯著升高(P<0.01),第3天和第14天時(shí)含量極顯著降低(P<0.01),其余被檢時(shí)間點(diǎn)雖然Ⅰ組雛雞低于相應(yīng)對(duì)照雛雞,但差異不顯著(P>0.05);血清IL-2在第1、3、7、14天時(shí)含量顯著或極顯著減少(P<0.05或P<0.01),第21天差異不明顯(P>0.05)。

    圖4 各組雛雞血清IFN-γ含量變化

    圖5 各組雛雞血清IL-2含量變化

    2.2.2 血清IL-4和IL-10含量變化 結(jié)果見圖6和圖7。Ⅰ組雛雞血清IL-4在第1天~第14天時(shí)含量均不同程度的高于對(duì)照雛雞,其中在第3和第7天與對(duì)照比較差異極顯著(P<0.01),其余差異不顯著(P>0.05);Ⅰ組雛雞血清IL-10在第1天~第14天時(shí)含量均不同程度高于對(duì)照雛雞,其中第3天~第14天與對(duì)照比較差異顯著(P<0.05),第21天時(shí)含量略低于對(duì)照雛雞,但差異不顯著(P>0.05)。

    圖6 各組雛雞血清IL-4含量變化

    圖7 各組雛雞血清IL-10含量變化

    3 討論

    T淋巴細(xì)胞在抵抗病原感染中,具有非常重要的作用,當(dāng)機(jī)體的免疫功能異常(抑制或增強(qiáng))時(shí),T淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量和比例會(huì)發(fā)生明顯變化,從而降低或提升機(jī)體的抗感染能力。綜合目前已有的研究資料,雖然對(duì)雞T淋巴細(xì)胞的MHC限制性、CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞群體功能的研究尚未透徹,但已有大量證據(jù)表明,在哺乳動(dòng)物研究中確立的概念也適用于雞。例如,雞感染傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)后,其MHC限制性CD8+T淋巴細(xì)胞被鑒定為效應(yīng)細(xì)胞[6]。另外,在REV感染靶細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究中,也證明細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有MHC限制性,且為CD8+T淋巴細(xì)胞;在利用單克隆抗體對(duì)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞系進(jìn)行功能分析后發(fā)現(xiàn),上述2個(gè)細(xì)胞群體都參與了對(duì)REV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[7];對(duì)攜帶MDV基因的REV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的分析,也為雞T淋巴細(xì)胞的MHC限制性提供了有力證據(jù)[8]。本試驗(yàn)研究對(duì)象是效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞,即CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞,其中CD4+T淋巴細(xì)胞可分為Th1和Th2等不同亞型,通過分泌可執(zhí)行各自功能的細(xì)胞因子,調(diào)控機(jī)體的免疫功能,分別參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng);CD8+T淋巴細(xì)胞主要通過細(xì)胞毒作用發(fā)揮其細(xì)胞免疫功能,殺傷細(xì)胞內(nèi)感染微生物的靶細(xì)胞[9-10]。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量多少在一定范圍內(nèi)可反應(yīng)其免疫調(diào)節(jié)能力的強(qiáng)弱; CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的增減代表其細(xì)胞免疫能力的高低,故通過檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量,并計(jì)算兩者的比值變化,可判斷機(jī)體的免疫功能的變化狀況。有研究發(fā)現(xiàn),傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)感染雛雞后,其血液CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著降低,REV感染雛雞主要免疫器官的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量也呈現(xiàn)一定程度的降低,說明IBDV和REV感染雛雞后,都是通過減少機(jī)體CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量,產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng),最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),REV感染SPF雛雞血液CD4+T淋巴細(xì)胞在整個(gè)試驗(yàn)期間均明顯低于對(duì)照雛雞,CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量除病毒感染后第7天外,而CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值呈現(xiàn)出先明顯升高然后顯著降低的變化,表明REV感染使雛雞血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少,造成雛雞細(xì)胞免疫水平降低,免疫功能紊亂。其中,第7天時(shí)感染組雛雞CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量異常增加,可能是由于REV感染初期,雛雞免疫系統(tǒng)受抑制較小,其胸腺仍可發(fā)揮正常的免疫功能,在REV感染刺激后,大量CD8+T淋巴細(xì)胞在胸腺中分化成熟并進(jìn)入血液,以加強(qiáng)自身的免疫能力,本試驗(yàn)結(jié)果中血清IFN-γ含量在第7天時(shí)也顯著高于對(duì)照雛雞,與該結(jié)果相符,但隨著感染的持續(xù),REV造成的免疫抑制增強(qiáng),故CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少。一般情況下,CD4+/CD8+值代表動(dòng)物機(jī)體免疫功能的情況,若其比值過高,表明動(dòng)物機(jī)體免疫功能增強(qiáng),而其比值過低,則表明機(jī)體發(fā)生了免疫抑制,本實(shí)驗(yàn)中CD4+/CD8+值呈現(xiàn)先升高后降低,可能是由于REV感染雛雞初期,免疫抑制效應(yīng)不強(qiáng),僅作為病原體激活了機(jī)體的免疫應(yīng)答,而感染中后期REV感染的免疫抑制作用增強(qiáng),導(dǎo)致雛雞發(fā)生了免疫抑制,故CD4+/CD8+值在中后期降低。

    雞的IL-2基因位于第4號(hào)染色體上[13],雞體內(nèi)高表達(dá)IL-2時(shí),其外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加,且已被證實(shí)是由于細(xì)胞增殖所引起,故IL-2是影響雞T淋巴細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn),REV感染動(dòng)物后可通過降低雛雞免疫細(xì)胞IL-2R表達(dá),引起雛雞免疫抑制[16-17],本研究中REV感染雛雞外周血中IL-2含量從病毒感染后第1天~第14天均低于對(duì)照雛雞,表明REV通過減少IL-2含量使T淋巴細(xì)胞增殖能力減弱,從而造成雛雞免疫功能降低。有研究表明,對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體起主要作用的細(xì)胞因子是IFN-γ,對(duì)細(xì)胞外病原體起主要作用的細(xì)胞因子是IL-4和IL-13,例如,雞對(duì)NDV和IBDV的免疫反應(yīng)中IFN-γ起主要作用,對(duì)蛔蟲病的免疫反應(yīng)則IL-4和IL-13起主要作用[18],故認(rèn)為IFN-γ不但是Th1控制免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性標(biāo)志細(xì)胞因子,而且也是控制細(xì)胞內(nèi)病原體感染的關(guān)鍵因子,IL-10在雞體內(nèi)的功能十分保守,僅作為一種抗炎細(xì)胞因子,下調(diào)了IFN-γ的作用[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn),REV感染SPF雛雞外周血液IFN-γ除第7天外,其余被檢時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照雛雞,說明REV感染抑制了IFN-γ表達(dá)以發(fā)揮減少巨噬細(xì)胞活化、抑制T淋巴細(xì)胞分化等免疫抑制作用[22]。李廣興等[23]研究也表明,REV感染可造成雛雞胸腺和脾臟IL-2以IFN-γ含量降低。但劉丹華等[24]研究發(fā)現(xiàn),REV感染雛雞局部黏膜免疫組織IL-2和IFN-γ含量在病毒感染過程中均高于對(duì)照雛雞,本試驗(yàn)血清中上述兩種因子檢測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)與其有所不同,分析產(chǎn)生該差異的原因,可能是由于REV感染引起的免疫抑制并未波及其局部黏膜免疫組織。IL-4可提高B細(xì)胞MHC Ⅱ類抗原的表達(dá),增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的抗原提呈能力,促進(jìn)機(jī)體體液免疫水平,但同時(shí)也可抑制IL-1和TNF-α等的產(chǎn)生,抑制了細(xì)胞免疫水平,降低了機(jī)體對(duì)病毒等生物性致病因素的抵抗能力。本試驗(yàn)中REV感染SPF雛雞外周血液中IL-4和IL-10含量在病毒感染后第1天~第14天均不同程度高于對(duì)照雛雞,表明REV感染可抑制雛雞細(xì)胞免疫功能。綜上所述,REV可減少雛雞血液各類型T淋巴細(xì)胞數(shù)量,顯著降低雛雞外周血細(xì)胞免疫水平和免疫調(diào)節(jié)能力,同時(shí)減少其免疫效應(yīng)因子含量,增加其免疫抑制因子含量,造成雛雞的免疫抑制。

    REV感染可減少SPF雛雞血液IFN-γ和IL-2等免疫增強(qiáng)因子,增加IL-4和IL-10等免疫抑制因子含量,降低雛雞外周血液CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量,上述病理改變與REV感染雛雞免疫抑制的發(fā)生密切相關(guān)。

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