亞急性烏頭堿中毒小鼠的病理組織學(xué)變化

李 博，張 雨，朱燕麗，孫 璐，黃恩霞，莫重輝，路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

烏頭屬(AconitumL)是一類兼具藥用價值和極強(qiáng)毒性的毛茛科(Ranunculaceae)一年至多年生草本植物。廣布于北半球溫帶地區(qū)，主要分布于亞洲、歐洲、北美洲，其中亞洲分布最廣，尤以我國物種資源最為豐富，主要分布于四川、云南、西藏等西南省區(qū)。烏頭屬種類繁多，全球約有350種，我國有200多種，約76種可供藥用[1-2]，例如白喉烏頭、草烏、川烏、北烏頭、黃花烏頭、鐵棒錘等。隨著氣候變化、過度放牧、不合理開發(fā)等自然和人為因素的影響，草地嚴(yán)重退化，烏頭等毒草迅速大量滋生繁衍，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)牧草的產(chǎn)量進(jìn)一步降低，加重了草原荒漠化，加大了放牧動物毒草中毒的概率[3]。烏頭被各種家畜誤食后均可引起中毒，表現(xiàn)流涎、嘔吐、腹痛、腹瀉，瞳孔散大、呼吸困難、運動中樞和感覺麻痹等特征，最終因心臟麻痹和呼吸衰竭而死亡[4]，可對草原畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。

目前，有關(guān)烏頭的研究主要集中在強(qiáng)心[5]、鎮(zhèn)痛[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗衰老[9]及抗病毒[10]等藥理作用方面，而對其毒理作用方面研究相對較少。已有研究表明，烏頭屬植物含有90多種生物堿[11]，主要有烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，其中以烏頭堿(aconitine)毒性最強(qiáng)，為二萜類生物堿，是烏頭的主要毒性成分[12]。國內(nèi)外學(xué)者有關(guān)烏頭堿的研究主要集中在烏頭堿的神經(jīng)毒性和心臟毒性方面。Zhao Y等[13]發(fā)現(xiàn)烏頭堿能夠顯著觸發(fā)多巴胺釋放、通過氧化應(yīng)激損傷PC12細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)毒性。Peng C等[14]從SD大鼠體內(nèi)獲得皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞并進(jìn)一步研究表明，烏頭堿對大腦具有明顯神經(jīng)毒性作用，其機(jī)制可能是通過抑制Na+-K+-ATP的活性從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，造成大腦形態(tài)和功能的破壞。Sandeep T等[15]報道了人烏頭中毒導(dǎo)致心律不齊和心室震顫的病例。張碩峰等[16]通過動態(tài)觀察烏頭堿的心臟毒性與強(qiáng)心作用發(fā)現(xiàn)，中毒量的烏頭堿能夠?qū)е滦穆蕼p慢、心室震顫，最終死亡，具有明顯的心臟毒性。Gao X T等[17]研究了烏頭堿在H9c2心肌細(xì)胞凋亡中的作用，揭示了烏頭堿通過介導(dǎo)線粒體通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

截至目前，有關(guān)烏頭堿中毒模型研究較少[18-19]，且其在小鼠產(chǎn)生的病理組織學(xué)變化尚不清楚。鑒于此，本研究擬通過復(fù)制小鼠烏頭堿亞急性中毒試驗?zāi)Ｐ?，探討亞急性烏頭堿中毒對小鼠病理組織學(xué)變化的影響，為烏頭堿毒性作用機(jī)制研究及動物烏頭中毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7日齡健康昆明小鼠120只，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%，12 h～12 h晝夜交替。飼養(yǎng)期間給予充足的全價鼠糧和飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器 98.86%烏頭堿，成都曼思特公司產(chǎn)品；甲醛等有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純，四川西隴化工有限公司產(chǎn)品；BL6100電子天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品；精密轉(zhuǎn)輪切片機(jī)，美國AO公司產(chǎn)品；熒光正置顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠亞急性烏頭堿中毒模型的復(fù)制 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為對照組(生理鹽水組)、低劑量組0.14 μmol/L、中劑量組0.28 μmol/L、高劑量組0.56 μmol/L，每組30只。連續(xù)灌胃30 d。

1.2.2 臨床癥狀觀察 每天觀察并記錄各組小鼠的飲食狀況、精神狀態(tài)、行為活動及臨床表現(xiàn)等。

1.2.3 病理組織切片制作及染色觀察 攻毒30 d時，將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、大腦、小腦固定于100 mg/mL甲醛溶液中24 h以上。沖洗組織，隨后修剪成3 mm～5 mm的組織塊，注意腦組織作橫切。然后依次在700、800、850、900、950 mL/L、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中分別進(jìn)行脫水處理50 min。在無水乙醇脫水后，置于無水乙醇與二甲苯混合液中30 min，再依次入純二甲苯Ⅰ、純二甲苯Ⅱ各10 min，置換出脫水劑并使組織呈半透明狀態(tài)。組織透明后，入熔化的石蠟內(nèi)浸蠟2 h后用包埋專用框進(jìn)行組織包埋。將蠟塊固定在切片機(jī)上進(jìn)行切片，單張切片的厚度為3 μm～5 μm，并進(jìn)行展片處理后進(jìn)行染色。在染色缸內(nèi)依次進(jìn)行脫蠟(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15 min)、脫苯(無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、950、900、800、700 mL/L乙醇各1 min)、水洗1 min、染蘇木精1 min后自來水沖洗兩次2 min～3 min，10 mL/L鹽酸乙醇中分化30 s后，浸入常水2 min～3 min。10 mg/mL伊紅染色2 min～3 min，加入蒸餾水快洗3 s～5 s。染色結(jié)束后，再進(jìn)行一次脫水、透明處理，最后在組織切片上滴加1滴～2滴中性樹膠封片劑。

切片制備完成后，利用熒光正置顯微鏡(10×20倍)，觀察主要臟器的病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

對照組小鼠試驗中未見明顯異常。灌胃第3天，低劑量組未見明顯異常，中劑量組及高劑量組均有小鼠出現(xiàn)精神沉郁、發(fā)汗，高劑量組還表現(xiàn)出輕度的皮膚震顫及腹瀉現(xiàn)象。灌胃第5天，高劑量組有小鼠出現(xiàn)嘔吐。灌胃第6天，低劑量組和中劑量組排帶有黏液的軟便。灌胃第15天，高劑量組部分小鼠表現(xiàn)行走不穩(wěn)、步態(tài)左右搖晃等神經(jīng)癥狀。灌胃第20天，高劑量組小鼠除眼瞼水腫，尾部體溫偏低，口鼻、尾部及四肢皮膚發(fā)黑外，還出現(xiàn)頭頸及四肢震顫，共濟(jì)失調(diào)，盲目運動等明顯神經(jīng)癥狀，且伴有間歇性躁動不安。

2.2 病理組織學(xué)變化

2.2.1 腦病理組織學(xué)變化

2.2.1.1 大腦 對照組大腦結(jié)構(gòu)清晰，無明顯變化(圖1A)。低劑量組大腦間質(zhì)無明顯變化(圖1B)。中劑量組病理變化可見部分神經(jīng)細(xì)胞水腫，有輕微噬神經(jīng)現(xiàn)象(圖1C)。高劑量組大腦中部分皮質(zhì)細(xì)胞腫脹、變性、壞死，有明顯的噬神經(jīng)現(xiàn)象。間質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，血管擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞(圖1D)。

2.2.1.2 小腦 對照組小腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)無肉眼可見病理變化(圖1E)。低、中劑量組可見浦肯野細(xì)胞出現(xiàn)輕微空泡變性(圖1F,G)。高劑量組小腦浦肯野細(xì)胞腫脹、變性、壞死，胞漿內(nèi)有數(shù)量不等的空泡，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重(圖1H)。

2.2.2 心臟和肺臟的病理組織學(xué)變化

2.2.2.1 心臟 對照組心肌纖維排列規(guī)則、整齊，間質(zhì)無明顯病理變化(圖2A)。低劑量組未見明顯心肌斷裂、變性(圖2B)。中、高劑量組可見心肌纖維腫脹、壞死、斷裂，呈凝固性壞死。間質(zhì)靜脈血管充血，結(jié)締組織細(xì)胞增生(圖2C和圖2D)。

2.2.2.2 肺臟 對照組肺臟各級小管無明顯病理變化(圖2E)。低劑量組小鼠肺臟輕微淤血，肺臟各級小管比較正常(圖2F)。中劑量組少數(shù)肺泡壁增厚，充血、出血現(xiàn)象較高劑量組輕微，未見上皮脫落(圖2G)。高劑量組可見肺泡壁增厚，肺泡壁相互融合形成腔體，肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤。肺間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有出血現(xiàn)象，細(xì)支氣管上皮有細(xì)胞脫落現(xiàn)象(圖2H)。

2.2.3 肝臟、脾臟和腎臟病理組織學(xué)變化

2.2.3.1 肝臟 對照組肝細(xì)胞索排列整齊，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常(圖3A)。低劑量組中央靜脈輕微充血，肝細(xì)胞質(zhì)少量空泡化(圖3B)。中劑量組中央靜脈充血，肝細(xì)胞索凌亂，肝竇隙內(nèi)有大量枯否氏細(xì)胞。部分肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)顆粒變性、壞死，肝細(xì)胞質(zhì)空泡化(圖3C)。高劑量組匯管區(qū)有血管效應(yīng)，肝細(xì)胞索凌亂，肝竇隙擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞。肝細(xì)胞廣泛性腫脹，出現(xiàn)顆粒變性、壞死，肝細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化(圖3D)。

2.2.3.2 脾臟 對照組脾組織結(jié)構(gòu)致密，無明顯病理學(xué)變化(圖3E)。低劑量組有輕微病變，可見少量巨核細(xì)胞(圖3F)。中劑量組病變較高劑量組輕微，巨核細(xì)胞明顯多于高劑量組(圖3G)。高劑量組脾臟白髓萎縮，脾血竇擴(kuò)張、充滿紅細(xì)胞，脾臟可見大量巨核細(xì)胞；淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，部分淋巴細(xì)胞變性深染、核濃縮(圖3H)。

A～D.依次為對照組、低劑量組(輕微水腫)、中劑量組(輕微噬神經(jīng)現(xiàn)象)和高劑量組大腦(部分皮質(zhì)細(xì)胞腫脹、變性、壞死)；E～H.依次為對照組、低劑量組(輕微神經(jīng)細(xì)胞損傷)、中劑量組(血管套現(xiàn)象)和高劑量組小腦(明顯噬神經(jīng)現(xiàn)象)

2.2.3.3 腎臟 對照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)組織致密(圖3I)。低劑量組腎臟腎小球、腎小管均無明顯變化，但腎間質(zhì)嚴(yán)重充血、出血(圖3J)。中劑量組腎小球無明顯病變，腎小管上皮細(xì)胞胞漿渾濁、顆粒變性、胞核即將消失，腎小管遠(yuǎn)曲小管、近端小管管腔上皮有脫落并有滲出物，間質(zhì)充血、出血現(xiàn)象減輕(圖3K)。高劑量組腎臟中有的腎小球腫脹或固縮，腎小管病變與中劑量組一致。腎小管間質(zhì)充血、出血明顯，尚存的腎小管內(nèi)有管型(圖3L)。

A～D.依次為對照組、低劑量組、中劑量組(心肌纖維腫脹)和高劑量組心臟(心肌纖維斷裂)；E～H.依次為對照組、低劑量組(輕微淤血)、中劑量組(肺泡壁增厚)和高劑量組肺臟(炎性細(xì)胞浸潤)

A～D.依次為對照組、低劑量組(輕微空泡化)、中劑量組(肝細(xì)胞索腫脹變性)和高劑量組肝臟(廣泛空泡化)；E～H.依次為對照組、低劑量組(輕微出血)、中劑量組(巨核細(xì)胞增加)和高劑量組脾臟(嚴(yán)重出血)；I～L.依次為對照組、低劑量組(輕微腫脹)、中劑量組(顆粒變性)和高劑量組腎臟(管型尿)

3 討論

有資料表明，烏頭堿主要表現(xiàn)為心臟毒性，可通過抑制心肌細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運相關(guān)ATP酶活性、電壓門控Na+離子通道開放導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載和離子水平紊亂，或者通過興奮迷走神經(jīng)釋放的乙酰膽堿直接抑制房室結(jié)或興奮異位起搏點，進(jìn)而引起心律失常[20-21]，還可破壞線粒體等細(xì)胞器及心肌細(xì)胞膜，引起心肌細(xì)胞死亡，乙酰膽堿釋放增加可引起大量NO產(chǎn)生，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[22]，造成心臟組織損傷，小鼠表現(xiàn)口鼻、尾尖及四肢末端發(fā)黑，尾尖發(fā)涼等循環(huán)系統(tǒng)癥狀。

此外，烏頭堿在體內(nèi)可通過胃腸道及肝臟代謝[23]，相應(yīng)的代謝產(chǎn)物可在這些器官被吸收通過腎臟隨尿液排出[24]，心臟受損引起的缺血、缺氧加上烏頭堿及其代謝產(chǎn)物的毒性作用，使小鼠消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)器官受損。烏頭堿還可通過影響神經(jīng)細(xì)胞離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)濃度及神經(jīng)細(xì)胞能量代謝，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[25]，影響P-糖蛋白表達(dá)[26]等機(jī)制對中樞神經(jīng)產(chǎn)生毒性作用。本試驗中各攻毒組小鼠均不同程度表現(xiàn)中毒癥狀，尤其是高劑量組小鼠表現(xiàn)大量出汗、腹瀉、嘔吐，并伴有明顯的神經(jīng)癥狀。

在獸醫(yī)臨床上，由于動物疾病種類繁多，發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除臨床癥狀觀察外，對組織器官進(jìn)行病理學(xué)檢查有助于動物疾病的診斷，此外，病理組織學(xué)變化也是藥物毒性對機(jī)體可能產(chǎn)生損傷的重要依據(jù)[27]。劉剛等[28]對兔進(jìn)行灌胃染毒制備急性草烏中毒模型并采集心室肌、肝臟、大腦皮質(zhì)，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)消失；心室肌細(xì)胞水腫，血管充血；肝臟組織可見匯管區(qū)血管效應(yīng)及大量淋巴細(xì)胞浸潤。Ji B L等[29]在研究烏頭堿對人胰腺癌細(xì)胞生長和凋亡的影響時，對腫瘤組織進(jìn)行HE染色并觀察發(fā)現(xiàn)，烏頭堿能抑制胰腺腫瘤組織的生長，且烏頭堿濃度越高，腫瘤生長受抑制越明顯。Prasanta P K等[30]在用硼砂處理烏頭堿進(jìn)行減毒研究中對烏頭堿攻毒組大鼠多種組織器官進(jìn)行病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞且有嚴(yán)重出血，睪丸中精子發(fā)生急劇減少，子宮上皮細(xì)胞脫落。本試驗結(jié)果與前人報道基本一致，同時高劑量組小鼠主要臟器均發(fā)生不同程度的變性、壞死，間質(zhì)組織充血、出血等病理學(xué)變化，相比病變更為嚴(yán)重，這可能與試驗動物品種、攻毒濃度不同等有關(guān)。值得一提的是，本試驗中中劑量組脾臟中巨核細(xì)胞明顯多于高劑量組，表明中劑量烏頭堿可激活并增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫功能，而高劑量組則呈現(xiàn)明顯免疫抑制作用。

本試驗探討了亞急性烏頭堿中毒對小鼠主要臟器的病理組織學(xué)變化的影響，結(jié)果表明不同濃度烏頭堿對小鼠各組織臟器具有明顯毒性作用，其中以心臟和神經(jīng)毒性損傷最為明顯。本試驗結(jié)果可為后續(xù)烏頭堿毒性作用機(jī)制研究及動物烏頭中毒病防治提供理論依據(jù)。