加味茵陳蒿口服液制備工藝研究

呂一舟，范云鵬*，張艷玲，馬 霞,*，郭振環(huán)，劉永錄，張國祖

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南鄭州 450046；3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 451464)

鴨病毒性肝炎多發(fā)于雛鴨，是由鴨肝炎病毒感染引起的，發(fā)病后肝臟損傷嚴重并且病死率極高，在沒有特效抗病毒藥物治療下嚴重影響鴨場的經(jīng)濟效益[1]。為了促進鴨養(yǎng)殖場穩(wěn)定發(fā)展，減少鴨場病毒性肝炎疾病的發(fā)生，從中獸醫(yī)學角度辨證，該病屬于濕熱之毒內侵導致肝脾不調、下注于腎，選方應以清熱解毒，疏肝利膽為原則[2]。有研究表明，茵陳蒿湯具有抗肝損傷、防治脂肪肝、抗肝纖維化等作用[3-5]，臨床常用于急性病毒性肝炎[6]、黃疸性肝炎和肝內膽汁淤積[7-10]等證屬濕熱內蘊者，在肝病治療領域有著廣闊的應用前景。本試驗結合水禽生理特點，在茵陳蒿湯基礎上進行加味，即茵陳120 g，梔子60 g，大黃45 g，甘草25 g。為了確定科學合理的制備工藝條件，本試驗進行了水提、醇提、水提醇沉3種提取工藝，以浸膏得率和梔子苷含量為指標，并結合實際生產(chǎn)、考慮成本等確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 茵陳、梔子、大黃、甘草，鄭州瑞龍制藥股份有限公司產(chǎn)品；梔子苷對照品，成都曼斯特生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，天津市四友精細化學品有限公司產(chǎn)品；純凈水，娃哈哈股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260)，安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(SYU-3-100D)，鄭州生元儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平(BSA224S)，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2)，上海力辰邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器(SZCL-2)，鄭州科達機械儀器設備有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水真空泵(SHZ-D)，鄭州科達機械儀器設備有限公司產(chǎn)品；低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/10)，鄭州科達機械儀器設備有限公司產(chǎn)品；旋轉蒸發(fā)器(RE-5299)，鄭州科達機械儀器設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水提制備工藝研究

1.2.1.1 吸水率考察 稱取茵陳30 g、梔子15 g、大黃11.25 g、甘草6.25 g，重復3份。加10倍量水浸泡，直至藥材全部浸透為止，濾出未被吸收的水液，稱量吸水后藥材的重量，計算吸水率[11]。

1.2.1.2 水提工藝的正交設計試驗 稱取茵陳30 g、梔子15 g、大黃11.25 g、甘草6.25 g，共9份，按照表1中三因素三水平正交設計試驗進行煎煮，過濾，合并濾液后，常壓濃縮至最小體積，轉移至蒸發(fā)皿內干燥至恒重，制得浸膏，并計算浸膏得率(公式下同)。

浸膏得率

1.2.2 醇提工藝的正交設計試驗 稱取茵陳20 g、梔子10 g、大黃7.5 g、甘草4.17 g，共9份，粗粉碎后按照表2中四因素三水平正交設計試驗進行加熱回流，過濾，合并濾液后，減壓濃縮至小體積，轉移至蒸發(fā)皿內干燥至恒重，制得浸膏，并計算浸膏得率。

表2 醇提工藝的正交設計試驗

1.2.3 水提醇沉工藝的單因素試驗

1.2.3.1醇沉終濃度篩選 取1.2.1中最佳條件的加味茵陳蒿口服液水提液4份進行醇沉，邊加邊攪拌，至乙醇濃度為800、750、700、600 mL/L，置4℃冰箱過夜，48 h后取出，去沉淀取上清，回收乙醇，減壓濃縮至小體積，轉移至蒸發(fā)皿內干燥至恒重，制得浸膏，并計算浸膏得率。

1.2.3.2 醇沉時間的考察 取1.2.1中最佳條件的加味茵陳蒿口服液水提液4份進行醇沉，邊加邊攪拌，至乙醇濃度為750 mL/L，放置4℃冰箱過夜，12、24、36、48 h后取出，去沉淀取上清，回收乙醇，減壓濃縮至小體積，轉移至蒸發(fā)皿內干燥至恒重，制得浸膏，并計算浸膏得率。

1.2.4 加味茵陳蒿口服液中梔子苷含量測定

1.2.4.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-1 mL/L磷酸水 (15∶85)為流動相，檢測波長為 238 nm，流速為1 mL/min，對照品和供試品進樣量10 μL。

1.2.4.2 梔子苷對照品配制 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，濾膜過濾即得。

1.2.4.3 供試品溶液及陰性對照溶液配制 精密稱取上述水提、醇提、水提醇沉工藝制備的浸膏各0.040 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超聲30 min，放冷，定容后搖勻，用有機濾膜過濾，即得。另取缺梔子的陰性對照浸膏同法制成陰性對照溶液。

2 結果

2.1 水提制備工藝研究

2.1.1 吸水率考察 由表3數(shù)據(jù)分析可知，稱取加味茵陳蒿口服液處方藥的1/4重量加水浸泡后，其吸水率為187%～200%，約為2倍吸水量。

表3 水提工藝的吸水率考察

2.1.2 梔子苷專屬性考察 由圖1可看出，梔子苷專屬性好，陰性樣品無干擾。

A.梔子苷標準品；B.供試品處理；C.陰性對照處理A.Geniposide standard；B.Testing sample；C.Negative control

2.1.3 水提工藝正交試驗安排與結果 由表4極差分析結果可知，水提工藝各因素水平對浸膏得率影響依次是C>A>B，即煎煮次數(shù)>料液比>提取時間，浸膏得率最佳的工藝為A3B1C3。影響梔子苷含量因素水平順序為C>B>A，即煎煮次數(shù)>提取時間>料液比，提取梔子苷含量最高的工藝為A1B3C3，其次是A3B1C3。

表4 水提工藝正交試驗安排與結果

通過表5方差分析得出，提取次數(shù)對浸膏得率和梔子苷含量存在極顯著性差異(P<0.01)，其他因素影響小?？紤]到生產(chǎn)中水分揮發(fā)快，故確定料液比為1∶12；經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析得出提取時間對浸膏得率和梔子苷含量影響小，從縮短生產(chǎn)周期和提高經(jīng)濟效益考慮，選取煎煮時間為1 h；煎煮2次與煎煮3次對浸膏得率和梔子苷含量的顯著性差異不明顯(P>0.05)，為降低生產(chǎn)成本選擇煎煮次數(shù)為2次。因此確定的最佳水提工藝條件為：A3B1C2，即補足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次。

表5 水提工藝試驗方差分析

2.2 醇提工藝正交試驗安排與結果

由表6極差分析顯示，影響醇提工藝浸膏得率的水平順序是D>C>A>B，即提取次數(shù)>提取時間>乙醇濃度>料液比，浸膏得率最佳組合為A2B1C2D3；影響梔子苷含量因素水平順序為A>D>B>C，即乙醇濃度>提取次數(shù)>料液比>提取時間，提取梔子苷含量最高為A3B2C1D3。

表6 醇提正交試驗安排與結果

通過表7方差分析可看出提取次數(shù)對浸膏得率影響存在極顯著差異(P<0.01)。由數(shù)據(jù)分析可知，提取2次和提取3次對浸膏得率差異不顯著(P>0.05)，料液比和提取時間對浸膏得率和梔子苷含量影響小，700 mL/L乙醇濃度和800 mL/L乙醇濃度對梔子苷含量影響差異不顯著(P>0.05)，考慮成本和時間問題，確定醇提最佳工藝為：A2B1C1D2，即加8倍量700 mL/L乙醇，加熱回流2次，每次40 min。

表7 醇提工藝試驗方差分析

2.3 水提醇沉工藝的單因素試驗結果

通過最佳水提工藝補足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡半小時，煎煮2次，每次煎煮1 h。合并兩次濾液濃縮，使藥液濃度為含生藥1 g/mL，放冷后進行醇沉工藝單因素試驗。由圖2A可看出醇沉終濃度在700 mL/L時浸膏得率和梔子苷含量最高；圖2B顯示醇沉時間在48 h時梔子苷含量和浸膏得率最高，因此確定醇沉最佳工藝為700 mL/L醇沉終濃度，醇沉48 h。

A.醇沉終濃度單因素試驗；B.醇沉時間單因素試驗A.Single factor test of final concentration of alcohol precipitation; B.Single factor test of alcohol precipitation time

3 討論

中獸醫(yī)理論認為，鴨病毒性肝炎是雛鴨受病毒、濕邪侵擾，脾陽困而運化失，肝風內動，導致病鴨食欲廢絕、排稀糞，嚴重者出現(xiàn)昏迷倒地、角弓反張等癥狀[2]。本方劑以茵陳為主藥，清濕熱，利肝膽；梔子清泄三焦?jié)駸?；大黃蕩滌腸胃淤熱；添加甘草進行加味，甘草補脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，有調和諸藥之功效[12-14]。前三藥均味苦性寒，清熱利濕，使?jié)駨亩闩判?，而甘草味甘，性平，可調和苦寒之性，調節(jié)口味，制成口服液便于臨床使用。

中藥口服液的制備工藝會直接影響其有效成分的含量及后期的臨床使用效果，現(xiàn)代制藥工藝的發(fā)展使很多質控指標得到改進[15]。茵陳作為加味茵陳蒿口服液中的君藥，其有效標識成分是綠原酸。在前期摸索試驗中發(fā)現(xiàn)去除茵陳的陰性對照里也檢出綠原酸，且含量不低，這與楊海玲等[16]研究的不同炮制方法對梔子中綠原酸含量影響相符合，梔子中也含有綠原酸。由于茵陳中的綠原酸在本方劑中不具備專屬性，故選取專屬性好的梔子苷作為衡量指標之一。

水提醇沉單因素試驗不同濃度及不同醇沉時間的藥液在回收乙醇至無醇味補足水量后，4℃放置24 h后都出現(xiàn)了沉淀，且搖之不易散，放置室溫和加熱至40℃以上也不消散，由此可看出加味茵陳蒿口服液水提醇沉工藝不穩(wěn)定，故排除此種工藝在生產(chǎn)中的應用。 影響加味茵陳蒿口服液水提工藝和醇提工藝的首要因素為煎煮(提取)次數(shù)，水提工藝中煎煮2次的浸膏得率范圍在12.3%～18.3%，梔子苷含量在10.51 mg/g～13.96 mg/g之間。醇提工藝中提取2次的浸膏得率范圍在12.7%～14.5%，梔子苷含量在10.74 mg/g～25.88 mg/g之間。從經(jīng)濟成本考慮，按照水提最佳工藝：補足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次的方法提取500 g藥材，所需的用水量為13 L，按照商業(yè)用水價格計算約為1元，能耗價格約為3元，總成本為4元。按照醇提最佳工藝：8倍量700 mL/L乙醇，加熱回流2次，每次40 min的方法提取500 g藥材，所需的無水乙醇量為5.6 L，水量為2.4 L，價格約為56.2元，能耗價格約為5元，總成本在61.2元左右。

結果可見，水提浸膏得率12.3%～18.3%與醇提浸膏得率12.7%～14.5%差別不大。而醇提時梔子苷含量雖然最高為25.88 mg/g，但此時乙醇濃度是800 mL/L，經(jīng)濟成本換算后，以水提工藝最節(jié)約易行。

通過以上試驗研究并結合成本、工時等因素考慮，確定了加味茵陳蒿口服液的最佳制備工藝為水提工藝，即補足2倍吸水量之后加12倍水，浸泡30 min，每次煎煮1 h，煎煮2次。具有成本低、提取效率高、安全方便、操作簡單等優(yōu)點，適合大規(guī)模的生產(chǎn)和應用。