雪白睡蓮花粗提物對奶牛乳房炎主要致病菌體外抑菌和抗炎作用

劉丹丹，羅 潔，向薇薇，況 玲，賽福丁·阿不拉，侯 宇，買占海，張 偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中常發(fā)且造成經(jīng)濟損失較大的疾病之一，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的威脅[1-2]。奶牛乳房炎發(fā)病原因復(fù)雜，但由細菌感染引起的較為常見，大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌是主要致病菌[3]。從1945年青霉素問世以來，越來越多的抗生素被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于細菌性疾病的預(yù)防和治療，甚至是用于促進畜禽生長。但隨著長時間大量抗生素的濫用，細菌耐藥性增強及畜產(chǎn)品中的藥物殘留等問題的出現(xiàn)，迫切需要毒副作用小、綠色無殘留的天然物質(zhì)替代抗生素。

雪白睡蓮花(Nymphaeacandida)是睡蓮科睡蓮屬水生草本植物，在維吾爾醫(yī)藥中有著悠久的藥用歷史，是維吾爾醫(yī)學(xué)中常用的單方或復(fù)方抗病毒藥的主要成分，也被推薦用于預(yù)防SARS冠狀病毒的藥物[4-5]。雪白睡蓮花有降熱止咳、益心護腦、安神止痛等功效，常用于感冒發(fā)燒、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等病癥的治療，被收錄于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準維吾爾藥分冊》中[6]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)該屬植物具有抗氧化、抑菌抗炎、抗腫瘤、保肝、降血糖等多種生物活性，但國內(nèi)外暫未見有關(guān)雪白睡蓮花粗提物對奶牛乳房炎主要致病菌抑菌效果的報道。為探索雪白睡蓮花粗提物對奶牛乳房炎主要致病菌的體外抑菌和抗炎效果，本研究通過牛津杯法和倍比稀釋法進行抑菌圈、最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)及最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測定，探究雪白睡蓮花粗提物對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌的抑菌效果，采用小鼠耳廓腫脹法探究雪白睡蓮花粗提物的抗炎作用，為臨床預(yù)防和治療乳房炎新藥的開發(fā)及自然資源利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及受試菌株 SPF級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18 g～22 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；奶牛乳房炎主要致病菌大腸埃希氏菌E3(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌9-14(Staphylococcusaureus)、鏈球菌151105(Streptococcusagalactiae)，由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 藥物與試劑 雪白睡蓮花，新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院產(chǎn)品；地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MH(A)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；二甲苯等其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 小型粉碎機，北京興時利和科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；三用恒溫水箱，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；低速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；磁力攪拌器，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；凈化工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；空氣震蕩培養(yǎng)箱，北京桑翌實驗儀器研究所產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；立式高壓蒸氣滅菌鍋，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雪白睡蓮花水提物的制備 取藥材粉末10 g，按料液比1∶10加入蒸餾水，恒溫水浴回流提取2 h，過濾后向殘渣中加入10倍蒸餾水，按上述步驟重復(fù)2次，合并3次濾液，抽濾除雜后減壓濃縮至1 g/mL，滅菌后4℃封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雪白睡蓮花醇提物的制備 稱取藥材粉末10 g，按料液比1∶10加入950 mL/L乙醇，恒溫水浴回流提取2 h，過濾后殘渣中加入10倍950 mL/L乙醇，按上述步驟重復(fù)2次，合并3次濾液，抽濾除雜后減壓濃縮至1 g/mL，滅菌后置4℃封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌液制備 將-20℃保存的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，后接種于瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)至相應(yīng)細菌生長對數(shù)期，挑出典型單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 抑菌圈測定 按照牛津杯法[7]，取4℃保存菌液0.1 mL，均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基中均勻放置5個牛津杯，杯中分別加入雪白睡蓮花水提物、醇提物各0.1 mL，每個藥物重復(fù)3次，以生理鹽水為空白對照組，慶大霉素為陽性對照組。37℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，測量抑菌圈直徑。抑菌效果判定：R≥15 mm為高敏，10 mm≤R<15 mm為中敏，8 mm≤R<10 mm為低敏，R<8 mm為不敏感，-表示無抑菌圈。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定 采用倍比稀釋法進行MIC的測定[8]。在96孔板中每孔加入滅菌肉湯0.1 mL，第1孔中加入濃度0.1 g/mL滅菌受試藥液0.1 mL，吹打混勻后取0.1 mL到第2孔，依次稀釋到第9孔取0.1 mL棄去。第10孔不加藥，第11孔中加受試藥不加細菌，第12孔受試藥和菌液都不加，作為對照。取0.01 mL菌液分別加入到1孔～10孔，混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果，以肉眼觀察未長細菌、溶液未渾濁的最低藥物濃度為MIC值。最低殺菌濃度(MBC)：從所有渾濁的培養(yǎng)物中各取0.05 mL接種于瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，平板上生長的菌落數(shù)小于5個菌落的最低藥物濃度作為MBC[9]。

1.2.6 抗炎試驗

1.2.6.1 實驗動物分組及給藥方案 雄性昆明種小鼠16只，隨機分為雪白睡蓮花水提物組、雪白睡蓮花醇提物組、陽性對照組、空白對照組，每組4只。按分組分別灌胃雪白睡蓮花水提物、雪白睡蓮花醇提物1.37 g/kg，灌胃地塞米松0.02 g/kg，灌胃蒸餾水10 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。給藥劑量按照實驗動物給藥劑量換算,計算方法如下：Y mg/kg=W×X mg/kg。X mg/kg為已知A種動物給藥量，Y mg/kg為欲得B種動物給藥量，W為折算系數(shù)，查找動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表得。

1.2.6.2 耳廓腫脹檢測 給藥7 d后0.5 h，將0.02 mL二甲苯均勻涂抹于小鼠左耳致炎，右耳作為空白對照組，1 h后處死小鼠后剪下雙耳，用8 mm打孔器取耳片，電子天平稱重，觀察雪白睡蓮花粗提物對二甲苯引起的耳廓腫脹度、腫脹率及腫脹抑制率的影響[10]。計算方法如下：

腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量；

腫脹率=[(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)/左耳片質(zhì)量]×100%；

腫脹抑制率=[(空白對照組耳腫脹度-用藥組耳腫脹度)/空白對照組耳腫脹度]×100%。

2 結(jié)果

2.1 抑菌圈測定結(jié)果

由表1可知，雪白睡蓮花提取物對3種致病菌均有一定抑菌作用。金黃色葡萄球菌對雪白睡蓮花水提物高度敏感，抑菌圈直徑達到29.40 mm±0.90 mm；大腸埃希氏菌對雪白睡蓮花醇提物中度敏感，抑菌圈直徑為14.13 mm±0.76 mm，雪白睡蓮花醇提物對金黃色葡萄球菌、鏈球菌的抑菌效果均較強，抑菌圈分別為21.57 mm±0.85 mm和16.42 mm±0.16 mm。表明雪白睡蓮花水提物、醇提物對3種菌抑菌效果差異較大，其中雪白睡蓮花水提物和醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳。

表1 雪白睡蓮花粗提物的抑菌圈測定結(jié)果

2.2 MIC和MBC的測定結(jié)果

由表2可知，雪白睡蓮花水提物對金黃色葡萄球菌的MIC為0.39 mg/mL，MBC為0.78 mg/mL；雪白睡蓮花醇提物對3種致病菌的MIC分別為6.25、0.78、0.78 mg/mL，MBC分別為12.5、1.56、1.56 mg/mL。表明雪白睡蓮花水提物對金黃色葡萄球菌在較低濃度時就有抑制和殺菌作用；雪白睡蓮花醇提物對這3種細菌均有抑制和殺菌作用，其對3種菌的作用效果為：金黃色葡萄球菌=鏈球菌>大腸埃希氏菌。

表2 雪白睡蓮花粗提取物提取物的MIC和MBC結(jié)果

2.3 抗炎試驗結(jié)果

由表3可知，與空白對照組相比，雪白睡蓮花水提物組、醇提物對二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹均有極顯著的抑制效果(P<0.01)，雪白睡蓮花醇提物的抑制率優(yōu)于水提物；與陽性對照組對比，雪白睡蓮花水提物、醇提物抑制率大于陽性對照。表明雪白睡蓮花水提物、醇提物對二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳腫脹均有不同程度的抑制作用。

表3 雪白睡蓮花粗提物抗炎試驗結(jié)果

3 討論

中藥是以自然界的植物、動物和礦物質(zhì)為主的天然物質(zhì)，綠色純天然、成本低廉、易得、種類繁多，具有抗菌消炎、抗病毒、無殘留、毒副作用小、無耐藥性等特點，還有營養(yǎng)機體、增強免疫的作用。王娟等[10]通過二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致小鼠足跖腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加及醋酸致小鼠扭體實驗、熱板試驗?zāi)Ｐ蛯厦人嵛锏目寡祖?zhèn)痛作用進行研究。結(jié)果表明，合萌水提物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。賽福丁·阿不拉等[11]通過體外抑菌和二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹法對小檗果水和醇提物對奶牛乳房炎致病菌抗菌活性及抗炎作用進行了研究。結(jié)果表明，小檗果水和醇提物具有較好的抑菌及抗炎作用。高瑞娟等[12]通過小鼠乳房炎模型進行了蒙藥成分復(fù)方治療效果研究。結(jié)果表明，蒙藥成分復(fù)方能有效治療細菌性乳房炎。

雪白睡蓮花主要產(chǎn)于新疆，在臨床上主要用于治療感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、心悸不安和咽痛等病癥，是炎消迪娜兒糖漿、祖卡木顆粒等抗炎抗病毒維藥復(fù)方的主要成分。據(jù)報道，睡蓮具有多種生物活性，如抗氧化、抗肝炎、抗腫瘤、抗菌等[13]。姑麗巴哈爾·艾木都拉等[14]、麥爾旦·吐爾遜麥麥提等[15]研究發(fā)現(xiàn)，雪白睡蓮中睡蓮酚、isostrictiniin有較好的抗氧化活性，對氧化應(yīng)激性肝損傷、急性化學(xué)性肝損傷具有較好的的保護作用。Duangjai T等[16]研究發(fā)現(xiàn)柔毛齒葉睡蓮雄蕊中的黃酮類化合物有較好的抗氧化活性。Maji A等[17]、Batool R等[18]研究發(fā)現(xiàn)，紅睡蓮葉水提物、白睡蓮乙醇提取物對大腸埃希氏菌、李氏桿菌有一定的抑菌效果，它們具有對抗體內(nèi)細菌感染的潛力。Hossain M A等[19]發(fā)現(xiàn)，瑞蓮提取物能抑制銅綠假單胞菌活性，對革蘭氏陰性菌具有濃度依賴性的抗菌活性，但其體外和體內(nèi)細胞毒性試驗均未觀察到毒性作用。

本試驗通過牛津杯法和倍比稀釋法測定藥材雪白睡蓮花粗提物對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌的抑菌作用。結(jié)果表明，雪白睡蓮花醇提物對3種致病菌均具有抑菌作用，水提物只對金黃色葡萄球菌有效。通過抑菌圈直徑和MIC、MBC分析，雪白睡蓮花水提物和醇提物對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，且水提物抑菌效果優(yōu)于醇提物，抑菌圈直徑分別為29.40 mm±0.90 mm和21.57 mm±0.85 mm，達到高敏，MIC分別為0.39 mg/mL和0.78 mg/mL ，MBC分別為0.78 mg/mL和1.56 mg/mL；醇提物對鏈球菌抑菌效果優(yōu)于大腸埃希氏菌，抑菌圈直徑分別為14.13 mm±0.76 mm和16.42 mm±0.16 mm，大腸埃希氏菌為中度敏感、鏈球菌為高度敏感，MIC分別為6.25 mg/mL和0.78 mg/mL ，MBC分別為12.5 mg/mL和1.56 mg/mL。

通過小鼠耳廓腫脹試驗，探究雪白睡蓮花粗提物的抗炎作用。通過對抗炎試驗結(jié)果的分析表明，雪白睡蓮花粗提物對二甲苯致炎的小鼠耳廓腫脹均有極顯著的抑制效果，并且醇提物抗炎效果明顯優(yōu)于水提物，水提物和醇提物抑制率分別為33.67%和68.49%。證實了雪白睡蓮花有較好的抗菌、抗炎作用。

綜上所述，雪白睡蓮花對奶牛乳房炎主要致病菌有一定的抑菌和抗炎作用，其在預(yù)防治療奶牛乳房炎上具有很大的潛力，可以為開發(fā)治療感染相關(guān)疾病的新天然藥物提供依據(jù)。