偽結核棒狀桿菌抗體間接ELISA檢測方法的建立及應用

劉 剛，尹 崢，李晨露，徐海玲，王晶晶，張 琪，許信剛，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

羊干酪性淋巴結炎(Caseous lymphadenitis,CLA)又稱羊偽結核病，是一種以偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis，Cp)為病原的慢性傳染病，該病的主要特征是在體表淋巴結部位和內臟出現(xiàn)廣泛膿腫，病羊迅速消瘦，肉用價值和產(chǎn)奶量下降，嚴重者甚至會死亡[1]。該病在奶山羊上的臨床表現(xiàn)形式主要有體表型和內臟型，也有體表和內臟混合出現(xiàn)的混合型，體表型主要在體表淋巴結，如下頜淋巴結、腮腺淋巴結、頸淺淋巴結、腋下淋巴結等部位形成膿包。內臟型主要是在屠宰過程中發(fā)現(xiàn)在內臟(最常見于肺和縱隔淋巴結)形成膿腫且伴隨嚴重的漸行性消瘦，內臟型一般在體表無膿胞癥狀。也有體表型和內臟型共存的羊只，即混合型。由于患病羊只膿腫外部破裂病原體被釋放，破潰的膿腫能夠向外界釋放大量的活菌，從而造成外界環(huán)境污染[2]。細菌通過皮膚傷口和擦傷感染，感染后無論是游離的還是吞噬細胞吞噬的細菌，都會引流進入局部淋巴結引起健康羊只形成膿腫。近年來，中國陜西、貴州、云南、四川等地相繼暴發(fā)該病[3-6]，羊毛、肉類和奶產(chǎn)量減少，CLA對綿羊和山羊產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了嚴重的經(jīng)濟影響?？股貙Ρ静〉闹委熜Ч幻黠@，因為活菌在膿腫內受到保護，膿腫周圍有厚厚的包膜[7-9]。

目前，CLA的診斷主要是根據(jù)其臨床特征和膿腫膿液中Cp的檢測，需要分離病原菌，且主要針對體表型患病羊只，在實際臨床中診斷意義不大[10]。CLA血清學診斷方法主要有菌體凝集抑制試、免疫擴散試驗、間接血凝試驗、ELISA方法，菌體凝集抑制試驗特異性和靈敏度較差，不利于大規(guī)模臨床應用，間接紅細胞凝集試驗抗原制備步驟繁瑣、結果判定容易有主觀誤差。ELISA方法中，常用不同的細菌成分用作固相抗原，如細胞壁抗原、外毒素、重組外毒素等，然而到目前為止，還沒有一種方法能夠將簡單的抗原制備過程與ELISA的特異性優(yōu)勢結合起來。因此，本研究的目的是建立一種易于制備的固相抗原的ELISA方法，該方法適用于篩選大量特異性和敏感性高的血清，從而能夠識別陽性群體和潛在感染個體，對偽結核抗體檢測及血清學調查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和血清 Cp陜西分離株分離鑒定并保存于西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物實驗室[11]。CLA陽性血清選用體格健康無病的奶山羊，每周用Cp菌株接種注射1次，出現(xiàn)注射部位腫脹化膿不予治療，注射2次，在第3周采血并分離的血清即為陽性血清。CLA陰性血清為采自無山羊偽結核病羊場的健康新生羔羊血清。羊布魯氏菌陽性血清、羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清、羊結核陽性血清、羊流產(chǎn)衣原體陽性血清、羊小反芻獸疫陽性血清均由本實驗室保存的試劑盒中的標準陽性血清。423份待檢血清隨機采自陜西省部分地區(qū)不同規(guī)?；躺窖蝠B(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑 96孔酶標板，賽默飛科技公司產(chǎn)品；HRP標記兔抗山羊IgG，上海翊圣生物科技公司產(chǎn)品；BSA，Solarbio公司產(chǎn)品；TMB顯色液，TIANGEN生化科技有限公司產(chǎn)品；Tween-20，天津致遠化學試劑有限公司產(chǎn)品;LB培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限公司產(chǎn)品； 犢牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 全自動酶標分析儀(AMR-100)，杭州奧盛公司產(chǎn)品；高速離心機(H1650-W)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)，上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ELISA包被抗原的制備 將分離鑒定后甘油保菌的Cp菌種接種于50 mL/L犢牛血清營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，恒溫振蕩器220 r/min、37℃的條件下培養(yǎng)24 h后，傳代培養(yǎng)接種于10 mL 50 mL/L犢牛血清營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。3 500 r/min離心5 min，倒掉上清液保留菌體，用PBS重懸菌體后離心洗滌菌體3次，即為所需抗原。經(jīng)70℃水浴熱滅活1 h后4℃保存。

1.2.2 抗原最佳包被濃度及抗體最適稀釋倍數(shù)確定 對滅活后的菌體沉淀，用 0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液重懸做5個濃度的稀釋，在分光光度計下調整使其OD600 nm值分別為0.243、0.141、0.084、0.055、0.017，包被酶標板，100 μL/孔；將偽結核病陽性血清和陰性血清分別用抗體稀釋液倍比稀釋(體積比分別為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)后加入酶標板，100 μL/孔；按常規(guī)間接ELISA法操作，以按照參考文獻[12]的方陣法進行試驗，選擇抗原最佳包被濃度和抗體最適稀釋倍數(shù)。

1.2.3 酶標記二抗最佳工作濃度的確定 包被用抗原、標準血清以及酶標二抗進行正交試驗，酶標二抗稀釋成2個濃度梯度(1∶2 500和1∶5 000)，同時設立空白對照，按步驟進行操作分析數(shù)據(jù)來測定最佳酶標二抗的工作濃度。按ELISA操作步驟進行試驗，對所得數(shù)據(jù)進行分析。以陽性樣品OD450 nm值(P值)在1.0左右，陰性樣品OD450 nm值(N值)在最接近本底值0.04處，且P/N最大時，為最佳血清稀釋濃度。

1.2.4 封閉時間的優(yōu)化 在以上最佳條件篩選的基礎上，加入封閉液，設置3個封閉時間，分別為60、90、120 min，其他步驟同以上步驟，設3個重復，測定OD450 nm值，根據(jù)P/N確定最佳封閉時間。

1.2.5 最佳封閉液確定 分別選擇50 g/L脫脂奶粉、50 mL/L牛血清、10 g/L BSA和50 mL/L山羊血清作為封閉液，封閉2 h，用陰、陽性血清進行ELISA試驗，設3個重復，測定OD450 nm值，根據(jù)P/N確定最佳封閉時間，選擇最佳封閉液。

1.2.7 特異性試驗 利用建立的間接ELISA方法檢測羊布魯氏菌陽性血清、羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清、羊結核陽性血清、羊流產(chǎn)衣原體陽性血清、羊小反芻獸疫陽性血清樣品進行檢測，每個樣品3次重復，同時設立偽結核病陽性標準血清、陰性標準血清和空白對照，評估該方法的特異性。

1.2.8 敏感性試驗 將偽結核病陽性血清分別做1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560倍稀釋，進行ELISA試驗檢測，評價該方法的敏感性。

1.2.9 重復性試驗 按照參考文獻[13]方法，用以上建立的間接ELISA方法對偽結核病強陽性、陽性、弱陽性和陰性羊血清各2份，每份樣品做3孔重復，測其OD450 nm值，進行批內重復性試驗。分別用3次制備的全菌抗原包被酶標板，對上述血清樣品進行3次ELISA檢測，每份樣品重復3孔，測其OD450 nm值，進行批間重復性試驗。

1.2.10 臨床樣本檢測 目前國內尚無商品化試劑盒，因此選用10份經(jīng)細菌分離鑒定偽結核陽性的山羊血清樣品，按照本試驗確定的最佳條件，設置健康山羊，偽結核病陽性血清、偽結核病陰性血清對照，并做空白對照，進行ELISA試驗，統(tǒng)計并分析試驗結果。并且用已建立的ELISA抗體檢測方法對陜西省不同地區(qū)規(guī)?；躺窖蝠B(yǎng)羊場采集的423份血清樣品進行檢測。

2 結果

2.1 抗原、抗體及酶標記二抗最佳工作濃度優(yōu)化結果

ELISA條件優(yōu)化，結果如表1所示。當包被菌體抗原OD600 nm值為0.084，血清1∶400稀釋37℃孵育1 h，二抗1∶5 000稀釋37℃孵育1 h，此時P/N值最大(4.648)，陽性血清OD450 nm值接近1(1.004)。因此，選擇的抗原最佳包被濃度為OD600 nm值為0.084，血清最適稀釋倍數(shù)為1∶400，酶標二抗的最佳工作濃度1∶5 000。

表1 菌體抗原濃度及血清和酶標二抗最佳稀釋濃度的確定

2.2 封閉條件優(yōu)化

結果如表2所示。當封閉液選擇10 g/L BSA，P/N值(4.640)最大且陽性血清OD450 nm≥1.0。

表2 封閉液的確定

2.3 封閉時間優(yōu)化

結果如表3所示。封閉時間不同時，陽性血清與陰性血清比值有差異，說明封閉時間對血清測定值有影響；封閉時間為2 h時，陽性血清測定值接近于1.0，陰性血清測定值、空白對照值最接近本底值(0.04)。因此，確定封閉時間為2 h。

表3 封閉時間的確定

2.4 陰/陽性標準臨界值的確定

表4 陰性/陽性標準臨界值的確定

2.5 特異性試驗結果

利用建立的間接ELISA方法檢測偽結核病陽性血清、偽結核病陰性血清、羊巴氏桿菌陽性血清、羊布魯氏菌陽性血清、羊梭菌陽性血清、羊結核陽性血清、羊流產(chǎn)衣原體陽性血清、羊小反芻獸疫陽性血清和空白對照，結果見圖1，僅偽結核病陽性血清呈陽性，其余均為陰性，表明該方法特異性較強。

2.6 敏感性試驗結果

將偽結核病陽性血清做梯度稀釋后，按照上述優(yōu)化的最佳工作條件，測定其OD450 nm值，測定結果見圖2。結果顯示，當偽結核病陽性血清稀釋度為1∶1 280時其OD450 nm的測定值在0.352之上。表明本研究所建立的ELISA檢測方法敏感性可達到1∶1 280，具有良好的敏感性。

A.CLA+;B.CLA-;C.羊巴氏桿菌;D.羊布魯氏菌;E.羊梭菌;F.羊結核;G.羊小反芻獸疫病毒;H.羊流產(chǎn)衣原體;I.空白

圖2 敏感性試驗結果

2.7 重復性試驗結果

結果如表5 所示，8份血清樣品重復性試驗結果表明，批內OD450 nm值變異系數(shù)在3.9%～8.6%，批間OD450 nm值變異系數(shù)在1.9%～8.7%，均小于10%，說明建立的間接ELISA重復性良好。

表5 重復性試驗結果

2.8 臨床樣品檢測

臨床樣品檢測結果見表6所示，10份經(jīng)分離鑒定陽性的病羊只血清樣品的檢測值均大于0.352，為陽性。健康羊只測值均小于0.352，與羊只實際患病情況一致。說明該檢測方法可有效檢出患病羊只。對423份血清樣品檢測結果見表7顯示，陽性樣本146份，陽性率35%。

表6 臨床樣品檢測結果

表7 3個羊場樣品檢測結果

3 討論

目前，對于患病羊只的檢測方法主要包括病原檢測和血清抗體檢測，有明顯臨床癥狀的體表型的患病羊只，采集病料后分離病原菌即可確診該病。但對于內臟型患病羊只，只有在屠宰后才能發(fā)現(xiàn)內臟的干酪樣化膿灶，因而給病原學診斷帶來很大困難。國內尚無安全有效的疫苗用于偽結核病的預防，因此篩查和清除偽結核棒狀桿菌持續(xù)感染的羊是控制本病傳播流行的重要措施。CLA抗體的存在不僅可作為羊群近期感染CLA的證據(jù)以及判定感染狀況的依據(jù)，也可作為篩查和清除CLA持續(xù)感羊的輔助手段[13]。

本試驗通過熱滅活的菌體作為抗原，用常規(guī)方法進行條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當抗原包被量為OD600 nm值為0.084的菌懸液100 μL/孔，血清以1∶400稀釋，以10 g/L BSA封閉2 h，二抗以1∶5 000稀釋時條件最佳，并進行驗證試驗，在此基礎上建立了檢測CLA抗體的間接ELISA法。采用滅活全菌作為包被抗原，其優(yōu)勢在于包被抗原制備過程簡單，成本不高，適用于基層單位檢測，只需將培養(yǎng)的菌液離心滅活調整濃度即得，且包被抗原穩(wěn)定易保藏，冷凍保藏期可達半年以上。而利用重組蛋白作為包被抗原，所需重組蛋白的表達、純化等過程復雜。另外，全菌作為包被抗原在理論上存在特異性差和非特異性結合增多的缺點，但本研究特異性試驗結果表明，該方法與偽結核病陽性血清、偽結核病陰性血清及其他6種常見細菌和病毒陽性血清無交叉反應，批間、批內試驗變異系數(shù)小，重復性較好；與經(jīng)細菌分離鑒定確定為偽結核陽性的血清反應，其OD450 nm值均高于臨界值0.325，特異性良好，可用于臨床檢測。重復性試驗和敏感性試驗表明，本方法重復性好，敏感性強，臨床樣品檢測陽性符合率高。

使用優(yōu)化建立的間接ELISA方法對部分奶山羊養(yǎng)殖場423份血清樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)羊場Cp抗體陽性率為35%，表明目前CLA在羊場感染情況較嚴重。應用試劑盒對羊群進行抗體篩查使得真正的陰性動物可以留在畜群中，不會有病原菌持續(xù)存在和擴散的風險，大多數(shù)陽性感染動物會被淘汰或從群核心中分離出來，直到隨后的篩選或撲殺進而實現(xiàn)控制、凈化和根除本病的目的。