布魯氏菌Omp2b優(yōu)勢T-B聯(lián)合抗原表位的免疫應(yīng)答特點研究

李大偉，朱玥潔，霍怡杉,李智偉，江曉明，沙 桐，陳志強，張峰波，丁劍冰

布魯氏菌是一種引起人獸共患傳染病的病原菌，即引起布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)[1-3]，目前已經(jīng)在《中華人民共和國傳染病防治法》把它歸類為乙類傳染病，與我們熟悉的非典、豬流感、炭疽、艾滋病、狂犬病、乙肝等同屬乙類傳染病[4]。用于動物的布病減毒疫苗有兩種，分別是：A19、S2，但是目前廣泛用于布病防控的疫苗也存在一定的缺陷，如不同程度的出現(xiàn)急性布魯氏菌病或副反應(yīng)的癥狀[5]。盡管在布魯氏菌病防治中疫苗免疫起到了非常重要的作用，但目前全球范圍內(nèi)沒有國際上認可的用于人的布病疫苗。Omp2b作為布魯氏菌外膜蛋白的一員，其具有很好的免疫原性，不但可以激發(fā)機體產(chǎn)生細胞免疫而且也可以產(chǎn)生體液免疫，而且可以通過遺傳工程技術(shù)來表達，通過研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌外膜蛋白Omp2b是一種良好的抗原成分。

本研究采用生物信息學分析方法分析了Omp2b蛋白的結(jié)構(gòu)[6-7]，并預(yù)測了T細胞和B細胞的優(yōu)勢表位得到了T-B聯(lián)合抗原表位：196-216區(qū)段，并人工合成肽段，利用合成肽段與布魯氏菌病患者和健康人群的血清進行免疫反應(yīng)，通過分析其誘導(dǎo)的體液及細胞免疫應(yīng)答的效果，研究結(jié)果可為進一步研究布魯氏菌疫苗奠定基礎(chǔ)[8]。

1 材料與方法

1.1 研究對象 羊種布魯氏菌Omp2b(GenBank：AMM72579.1)蛋白氨基酸序列：GenBank中的長度為362 bp的羊種布魯氏菌Omp2b來源于NCBI網(wǎng)站。收集2017年9月至2019年5月就診于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院感染性疾病中心明確診斷為布病且有詳細病歷資料的30名慢性布病患者(患者組)和35名健康人(對照組)參加本研究[9]，每1位患者均簽署知情同意書，且本研究所有實驗均經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理學委員會批準(倫審號：20150225-94)。

1.2 方 法

1.2.1 T和B表位預(yù)測和分析 我們使用SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitope prediction.htm)和IEDB(http://tools.immuneepitope.org/)來預(yù)測OMP2b蛋白的T細胞表位。我們使用HLA-A*1101預(yù)測相應(yīng)的CTL表位，同時選擇HLA-DRB1*0701預(yù)測Th表位。使用 DNAStar軟件和IEDB來預(yù)測OMP2b蛋白的B細胞表位。最后通過比較分析確定Omp2b的T、B細胞表位和T-B聯(lián)合表位。

1.2.2 Omp2b免疫誘導(dǎo)的T細胞免疫應(yīng)答 ELISPOT平板涂有特異性抗人IFN-γ抗體(人IFN-γ試劑盒，Cat#552138，BD，SanDiego，CA，USA)在PBS中以1∶60稀釋過夜，溫度為4～8 ℃。將板用PBS洗滌5次，并用含有10%胎牛血清(FCS)(Sigma)的100 μL RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma Aldrich，St.Louis，UA)在37 ℃封閉1 h。將PBMC懸浮液(2×105)加入ELISPOT板中。PBMC懸浮液(2×105)和5 μg/mL TB結(jié)合的表位肽加入適當?shù)目字?。每個樣品有3個重復(fù)的孔。僅PBMC加培養(yǎng)基作為陰性對照和PBMC加上植物血凝素(PHA)用作陽性對照。將板在37 ℃、5% CO2下孵育19 h。之后，孵育平板用IFN-γ特異性生物素化抗體和鏈霉抗生物素蛋白-HRP。最后，使用ELISPOT自動平板讀數(shù)器(AID Elispot Reader，AID，Germany)計數(shù)IFN-γ特異性斑點形成細胞(SFU)。

1.2.3 Omp2b免疫誘導(dǎo)的特異性抗體應(yīng)答 將合成的T-B聯(lián)合表位(6 μg/mL)包被在碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的微孔板上，然后用5%脫脂乳封閉。加入血清樣品后，將板在37 ℃下孵育60 min。洗滌板后，以1∶1 000的比例加入HRP標記的小鼠抗人IgG(BD)作為二抗，并在室溫下孵育30 min。再次洗滌板后，加入底物溶液，通過酶標儀(PERLONG，DNM-9602，北京，中國)測量OD450和OD620每個孔的值。使用OD值評估 IgG的相對水平。

1.2.4 CTL表位誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶B的分泌 將PBMC懸浮液(2×105)在含有或不含有5 μg/mL肽的CTL表位的96孔板中與含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基一起培養(yǎng)。在37 ℃溫育3 d后，收集細胞培養(yǎng)物上清液。分別通過ELISA測量分泌的穿孔素(人穿孔素ELISA pro試劑盒，3465-1HP-2，Mabtech，Stockholm，Sweden)和顆粒酶B(人顆粒酶B ELISA開發(fā)試劑盒，3485-1H-6，Mabtech，Stockholm，Sweden)。將板用4 μg/mL抗人穿孔素(克隆Pf-80/164)或2 μg/mL粒酶B抗體(克隆GB10)在4 ℃～8 ℃下包被過夜。用PBS洗滌后，用含有0.05%吐溫20(Sigma)和0.1%牛血清白蛋白(Sigma)的PBS封閉1 h。分別添加樣品和標準品。將板在室溫下溫育2 h。用PBS洗滌3次后，加入與抗生物素蛋白結(jié)合的抗孔蛋白抗體(1 μg/mL;克隆Pf-344)或抗顆粒酶B抗體(1 μg/mL;克隆GB11)并在室溫下孵育1 h。洗滌后，加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP并在室溫下溫育1 h。最后，加入TMB并孵育15 min以進行顯色。通過PERLONG DNM-9602在OD450和OD620下測量該板，基于標準曲線確定樣品濃度。

2 結(jié) 果

2.1 T-B聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位檢測 通過生物信息軟件對T細胞表位和B細胞表位的綜合分析最終篩選出T-B細胞聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位是：196-216(EQGGDNDGGYTGTTNYHIDGY)。

2.2 Omp2b免疫誘導(dǎo)的T細胞免疫應(yīng)答 為了測試T-B聯(lián)合表位的免疫原性，將合成的T-B聯(lián)合表位與PBMC共同培養(yǎng)并進行ELISPOT測試。ELISPOT可以在細胞通過顯色反應(yīng)分泌這種可溶性蛋白質(zhì)的相應(yīng)位置顯示清晰可辨的斑點，并且可以在顯微鏡下或通過ELISPOT分析系統(tǒng)直接計數(shù)斑點。表明Omp2b可誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答?；颊弋a(chǎn)生IFN-γ的T細胞高于健康對照組(F=25.413,P<0.01)(圖1和圖2)。

圖1 ELISPOT 檢測結(jié)果

*P<0.05，**P<0.01 SFU：spot forming units

2.3 Omp2b免疫誘導(dǎo)的特異性抗體應(yīng)答 為了評估T-B聯(lián)合表位是否具有產(chǎn)生抗體的能力，進行ELISA(見圖3)。在布病患者中檢測到針對T-B聯(lián)合的Omp2b蛋白表位肽的特異性IgG，但在健康對照組中未檢測到。兩組抗體水平有差異統(tǒng)計學意義(F=13.555,P<0.01)。

*P<0.05，**P<0.01

2.4 CTL表位誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶B的分泌 為了進一步探究CTL表位是否可誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過ELISA方法檢測上清液中的穿孔素和顆粒酶B的濃度(pg/mL)，并與單獨加入PBMC的對照孔進行比較。加入CTL肽段的試驗孔比不加入肽段的對照孔的顆粒酶B和穿孔素的濃度升高(F=13.653，P<0.01)。這些結(jié)果表明，Omp2b蛋白預(yù)測的CTL表位在刺激T細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面是有效的(圖4)。

*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

開發(fā)預(yù)防布魯氏菌病的有效疫苗尤為重要。有效的疫苗受許多因素的影響，包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和位置[10]。對一級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，Omp2b是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，有利于疫苗的構(gòu)建。在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域和無規(guī)卷曲區(qū)域有利于形成表位區(qū)域[11]。

有效的疫苗不僅應(yīng)具有合理的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，還應(yīng)具有有效的T和B細胞表位[12-13]。因此，使用不同的軟件分析了Omp2b的T和B細胞表位。T細胞表位必須能夠加工成與相應(yīng)MHC結(jié)合的肽，然后被TCR識別[14]。T細胞表位分別由CTL和Th細胞識別的MHC I和MHC II分子呈遞。布魯氏菌是一種細胞內(nèi)病原體，細胞免疫在去除致病菌方面起著重要作用[15]。使用SYFPEITHI和IEDB來分析Omp2b的T細胞表位[16-17]。選擇的HLA分子類型為HLA-A*1101和HLA-DRB1*0701，在新疆人群中頻率較高，可用于預(yù)測[18-19]。由B細胞產(chǎn)生的特異性抗體可以有效地識別病原體并引發(fā)隨后的一系列免疫應(yīng)答。因此，B細胞表位在疫苗開發(fā)中起重要作用[20]。利用DNAStar和IEDB軟件進行預(yù)測。將IEDB的表位預(yù)測與親水性、表面可及性和靈活性的結(jié)果相結(jié)合，以排除α-螺旋和β-折疊區(qū)域中的B細胞表位。親水、柔性和表面可及的區(qū)域通常是形成B細胞表位的主要區(qū)域[21]。篩選后，通過生物信息學軟件最終篩選得出了1個Omp2b蛋白的T-B聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位：196～216區(qū)段(EQGGDNDGGYTGTTNYHIDGY)，T-B聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位可被Th和B細胞識別并激活細胞和體液免疫來消除病原體。

使用ELISA檢測患者組和對照組中的特異性抗體，并且在布病患者血清中檢測到了針對T-B聯(lián)合表位肽的特異性抗體。通過研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌的Omp2b可以在布魯氏菌感染后刺激相應(yīng)特異性抗體的產(chǎn)生。同時，從患者組和對照組中分離出PBMC，并使用ELISPOT方法檢測T-B聯(lián)合表位肽誘導(dǎo)Th細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示，Omp2b的表位可以誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)Th細胞的免疫應(yīng)答。

為驗證Omp2b的預(yù)測CTL表位的免疫反應(yīng)性，將CTL表位肽與患者的PBMC共培養(yǎng)，并檢測上清液中的穿孔素和顆粒酶B水平。CTL細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶B發(fā)揮細胞毒作用。結(jié)果顯示，加入CTL表位肽后，培養(yǎng)上清液中的穿孔素和顆粒酶B的水平顯著增加。因此，CTL的優(yōu)勢表位可以促進穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生并誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答。

綜上，通過生物信息學最終篩選出了1個T-B細胞聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位196～216區(qū)段。T-B聯(lián)合優(yōu)勢表位合成的肽段能刺激免疫細胞產(chǎn)生穿孔素、顆粒酶、細胞因子，并能與患者特異性IgG結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性，表明T-B聯(lián)合優(yōu)勢抗原表位能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的細胞和體液免疫應(yīng)答，為進一步研制布魯氏菌疫苗提供了實驗依據(jù)。

利益沖突：無