單糧和多糧型白酒發(fā)酵過(guò)程的成分差異分析

閆 涵，范文來(lái)，徐 巖

（教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

釀酒原料是決定白酒產(chǎn)量和質(zhì)量的物質(zhì)基礎(chǔ)，不同品種的原料賦予酒體不同的風(fēng)格[1]。在微生物的作用下，原料中的基質(zhì)組分經(jīng)過(guò)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)。此外，原料本身具有的微量成分也會(huì)對(duì)酒體風(fēng)味產(chǎn)生重要影響[2-3]。通常情況下，使用單一原料釀酒（單糧型白酒）時(shí)，原料多采用高粱或大米（米香型等）；使用多種糧食釀酒（多糧型白酒）時(shí)，大部分以高粱為主，并輔以大米、小麥、糯米、玉米等原料[4]。由于原料品種及配比的差異，單、多糧型白酒具有不同的風(fēng)味特征[5]。

目前，關(guān)于不同原料釀造白酒的差異性研究多集中于微生物代謝[6-7]、生產(chǎn)工藝[8]和原酒風(fēng)味成分[9-11]等方面，而針對(duì)白酒在發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的研究較少。鑒于此，本研究通過(guò)跟蹤單糧和多糧釀造的馥合香型白酒（兼具濃香、醬香和芝麻香）在發(fā)酵過(guò)程中酒醅的揮發(fā)性成分變化，比較不同原料釀造的白酒酒醅在發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分生成量的差異，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，找出關(guān)鍵差異化合物，確定不同原料對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程的影響，為白酒生產(chǎn)過(guò)程的品質(zhì)調(diào)控提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以單糧或多糧為原料生產(chǎn)的馥合香型酒醅由安徽金種子酒業(yè)股份有限公司提供。馥合香型酒醅堆積發(fā)酵期3 d，入池發(fā)酵期60 d，分別取堆積發(fā)酵第0、1、2、3天和入池發(fā)酵第1、5、10、15、20、30、40、50、60天的樣品。酒醅取樣時(shí)，選取4 個(gè)實(shí)驗(yàn)窖池，同一發(fā)酵車(chē)間正常發(fā)酵的4 個(gè)窖池作為平行對(duì)照。分別取窖池上、中、下層中心處的酒醅，等量混合均勻，封口袋密封保存后于-20 ℃冷凍保藏。

氫氧化鈉、無(wú)水葡萄糖、濃鹽酸、五水硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、無(wú)水乙醚、無(wú)水氯化鈣、氯化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、內(nèi)標(biāo)丙酸辛酯、叔戊酸和86 種化合物標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 6890N-MSD 5975氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、DB-FFAP柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；自動(dòng)進(jìn)樣器（MPS2） 德國(guó)Gerstel公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）萃取頭美國(guó)Supelco公司；Organomation N-EVAP氮吹儀美國(guó)Organomation公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 德國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中淀粉和還原糖的測(cè)定

參考T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》[12]，對(duì)酒醅中淀粉和還原糖進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 HS-SPME結(jié)合GC-MS測(cè)定揮發(fā)性化合物

參考高文俊[13]的方法，稱(chēng)取10 g酒醅樣品，加入1%無(wú)水CaCl2和20 mL煮沸過(guò)的超純水混勻，于4 ℃冰箱內(nèi)浸泡過(guò)夜。冰水浴超聲30 min，在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液。

吸取8 mL上清液置于20 mL頂空瓶中，加3 g NaCl和內(nèi)標(biāo)丙酸辛酯（終質(zhì)量濃度86.68 μg/L），密封后進(jìn)行HS-SPME-GC-MS分析[13]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制不同質(zhì)量濃度梯度各化合物的標(biāo)準(zhǔn)液，取每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)液8 mL進(jìn)行HS-SPME-GC-MS分析。采用選擇離子法，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）結(jié)合GC-MS定量揮發(fā)性酸類(lèi)化合物

由于HS-SPME方法中使用的三相萃取頭對(duì)強(qiáng)極性揮發(fā)性脂肪酸類(lèi)化合物的萃取效果不佳，所以采用LLMEGC-MS測(cè)定揮發(fā)性酸類(lèi)化合物[14]。酒醅的預(yù)處理方法與1.3.2節(jié)相同。

吸取18 mL上清液，加入6 g NaCl、內(nèi)標(biāo)叔戊酸（終質(zhì)量濃度3 406 μg/L）和1.5 mL重蒸乙醚，振蕩萃取3 min，靜置分層后吸取上層有機(jī)相于2 mL離心管中，于4 ℃、12 000 r/min離心3 min去乳化。吸取1 mL有機(jī)相于2 mL氣相小瓶中，氮吹濃縮至250 μL。取1 μL進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS分析條件與1.3.2節(jié)相同。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制不同質(zhì)量濃度梯度酸類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)液，取每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)液18 mL進(jìn)行LLME-GC-MS分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法與1.3.2節(jié)相同。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用SIMCA-P+（v13.0）進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糧和多糧型白酒在發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性化合物含量差異分析

采用LLME-GC-MS和HS-SPME-GC-MS方法在單糧和多糧釀造的馥合香型白酒酒醅中共鑒定出86 種揮發(fā)性化合物，其中酯類(lèi)34 種，酸類(lèi)9 種，醇類(lèi)8 種，醛酮類(lèi)4 種，呋喃類(lèi)4 種，內(nèi)酯類(lèi)2 種，芳香族12 種，酚類(lèi)7 種，含氮化合物4 種，以及含硫化合物2 種。

不同原料釀造的酒醅在發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性化合物的生成量相差不大。與發(fā)酵前酒醅中含有的揮發(fā)性化合物總量相比，單糧酒醅中揮發(fā)性化合物總量增加3.09 g/kg，多糧酒醅中揮發(fā)性化合物總量增加3.03 g/kg，單糧酒醅中的揮發(fā)性化合物總生成量比多糧酒醅高1.94%（表1）。

表1 不同原料釀造白酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性化合物增量的比較Table 1 Comparison of volatile compounds increments during liquor fermentation from single and multiple grains

相比多糧酒醅，單糧酒醅在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了更多的酚類(lèi)和酸類(lèi)化合物。酚類(lèi)化合物具有一定的抗菌和抗氧化活性[15]，但多是白酒中的異嗅物質(zhì)[16]，主要來(lái)源于原料中木質(zhì)素的降解[17]。酚類(lèi)化合物在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過(guò)程中含量分別增加3.71 mg/kg和2.4 mg/kg，單糧酒醅中酚類(lèi)化合物含量比多糧酒醅多產(chǎn)生了35.31%。通常，單一高粱原料中酚類(lèi)化合物的含量顯著高于其他釀酒原料，且在發(fā)酵和蒸餾過(guò)程中，微生物可以將原料中的谷物酚類(lèi)物質(zhì)分解成揮發(fā)性的酚類(lèi)物質(zhì)，部分谷物酚類(lèi)物質(zhì)也會(huì)殘留在酒醅當(dāng)中[18]，進(jìn)一步解釋了單糧酒醅在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生更多酚類(lèi)物質(zhì)的原因。酸類(lèi)化合物不僅是白酒中重要的呈香、呈味物質(zhì)，同時(shí)也影響著微生物的生長(zhǎng)代謝[19-21]。原料和酒曲中糖在微生物的作用下分解產(chǎn)生大量有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)[19]。酸類(lèi)在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過(guò)程中含量分別增加了1.39 g/kg和1.0 g/kg，單糧酒醅比多糧酒醅多產(chǎn)生了28.06%酸，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似[22]。

多糧酒醅在發(fā)酵過(guò)程中較單糧酒醅產(chǎn)生更多的醇類(lèi)和含氮化合物。醇類(lèi)化合物主要來(lái)源于糖和氨基酸的降解[23]，是兩種酒醅在發(fā)酵過(guò)程中生成量差異最大的一類(lèi)化合物。在發(fā)酵過(guò)程中，單糧和多糧酒醅中醇類(lèi)化合物含量分別增加2.89 mg/kg和12.83 mg/kg，多糧酒醅中醇類(lèi)含量比單糧酒醅多產(chǎn)生了3.44 倍。其中含量差異較大的化合物為2-甲基丙醇和3-甲基丁醇，均在多糧酒醅發(fā)酵過(guò)程中生成量較高。含氮化合物也是兩種酒醅發(fā)酵過(guò)程中生成量差異較大的一類(lèi)化合物，本研究共檢測(cè)到4 種含氮化合物，包括3 種吡嗪類(lèi)物質(zhì)和2-乙?；量?，均在多糧酒醅中含量較高。含氮化合物在單糧酒醅中含量增加0.35 mg/kg，在多糧酒醅中含量增加0.96 mg/kg，多糧酒醅中含氮化合物的含量比單糧酒醅多產(chǎn)生了174%；研究發(fā)現(xiàn)多糧酒醅中雜環(huán)化合物的種類(lèi)和含量較高，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果類(lèi)似[6,17]。

雖然單糧和多糧釀造的白酒酒醅中檢測(cè)到化合物種類(lèi)基本相同，產(chǎn)生的化合物總量相差不大，但是各類(lèi)化合物在發(fā)酵過(guò)程中的生成量存在一定差異。這可能是由于不同的原料品種具有不同的化學(xué)成分組成以及有差異的微生物群落結(jié)構(gòu)[6-7]，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝生長(zhǎng)環(huán)境存在一定的差別，進(jìn)而影響到酒醅中揮發(fā)性成分的生成。

2.2 單糧和多糧型白酒在發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵差異化合物

為了找出單糧和多糧釀造的白酒在發(fā)酵過(guò)程中可能存在的關(guān)鍵差異化合物，應(yīng)用OPLS-DA模型分別對(duì)兩種酒醅中檢測(cè)到的86 種揮發(fā)性化合物在發(fā)酵過(guò)程中的增量進(jìn)行分析（圖1）。該模型能將兩種酒醅明顯區(qū)分開(kāi)，模型解釋率和模型預(yù)測(cè)能力Q2分別為0.508、0.973、0.505，其中接近于1且Q2＞0.5，說(shuō)明模型質(zhì)量較好。根據(jù)OPLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（VIP＞1.0）篩選出潛在的差異化合物，然后對(duì)其進(jìn)行ANOVA，將其中具有顯著性差異的化合物（P＜0.05）認(rèn)為是單糧和多糧釀造白酒酒醅中的關(guān)鍵差異化合物。

圖1 不同原料釀造白酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性化合物增量的OPLS-DA得分圖Fig. 1 OPLS-DA score plot for volatile compound increments during liquor fermentation from single and multiple grains

通過(guò)OPLS-DA發(fā)現(xiàn)，單糧和多糧釀造白酒酒醅在發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵差異化合物有6 種，其中包括兩種酯類(lèi)物質(zhì)，分別為乙酸己酯和肉豆蔻酸乙酯；兩種芳香族類(lèi)物質(zhì)，分別為苯乙醛和苯甲醇；以及兩種含氮化合物，分別為6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪。各化合物在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過(guò)程中的增量變化如表2所示，除苯乙醛以外，其他的關(guān)鍵差異化合物均在多糧酒醅發(fā)酵過(guò)程中的生成量較高。

表2 發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵差異化合物增量的比較Table 2 Comparison of the contents of key differential compounds during the fermentation process

研究發(fā)現(xiàn)，單糧釀造有利于酒醅中苯乙醛含量的累積。苯乙醛是白酒中重要的香氣化合物，具有玫瑰花香，主要由原料中的苯丙氨酸脫氨基和羰基產(chǎn)生，可在還原酶作用下被還原為苯乙醇[23]。單糧和多糧酒醅中苯乙醛含量分別增加183.09 μg/kg和54.04 μg/kg。單糧酒醅中苯乙醛含量比多糧酒醅多產(chǎn)生了70.48%。這主要是由于高粱中所含的蛋白質(zhì)含量高于多種糧食混合的蛋白質(zhì)含量[24]，且高粱具有較高含量的苯丙氨酸，苯丙氨酸可以在氨基酸轉(zhuǎn)氨酶作用下生成更多的苯乙醛等物質(zhì)[25]，使得單糧酒醅中苯乙醛生成量更高。該研究結(jié)果與前期關(guān)于濃香型白酒釀造體系中苯乙醛含量差異研究結(jié)論具有一致性[26]。

多糧釀造有利于酒醅中乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的生成。其中，6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪均屬于吡嗪類(lèi)物質(zhì)，在多糧酒醅中的生成量分別比單糧酒醅高164%和539%。本研究還檢測(cè)到了2,3,5,6-四甲基吡嗪，其在單糧和多糧酒醅發(fā)酵過(guò)程中含量分別增加11.75 μg/kg和16.05 μg/kg，多糧酒醅比單糧酒醅多產(chǎn)生了36.58%。多糧酒醅在發(fā)酵過(guò)程中吡嗪類(lèi)物質(zhì)總含量增加了591.9 μg/kg，顯著高于單糧酒醅（P＜0.05）。吡嗪類(lèi)物質(zhì)是白酒中特有的風(fēng)味成分，具有烘烤和堅(jiān)果香氣[21,23]。Fan Wenlai等[17,27]對(duì)洋河大曲、五糧液、劍南春等濃香型白酒中的香氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相比于洋河大曲（單糧型白酒），五糧液和劍南春等多糧型白酒中可能含有更多的吡嗪；Tan等[6]研究發(fā)現(xiàn)單糧酒醅中吡嗪類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量均低于多糧混合酒醅，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類(lèi)似。這些結(jié)果表明，多糧酒醅在發(fā)酵過(guò)程中生成更高含量的吡嗪類(lèi)化合物，這可能是多糧酒醅不同于單糧酒醅的典型特征。

白酒中的吡嗪類(lèi)化合物主要來(lái)源于微生物的代謝反應(yīng)，通常產(chǎn)生于堆積發(fā)酵、入池發(fā)酵和蒸餾過(guò)程[28]。其生物合成途徑可分為2 個(gè)階段：第1階段是通過(guò)枯草芽孢桿菌糖代謝和氨基酸轉(zhuǎn)化過(guò)程積累代謝產(chǎn)物乙偶姻和氨，第2階段是代謝產(chǎn)物乙偶姻與發(fā)酵環(huán)境中的氨發(fā)生非酶促反應(yīng)生成吡嗪類(lèi)化合物[28-29]。相比于單一高粱發(fā)酵，多種糧食的混合提高了白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中淀粉和還原糖的含量（圖2），使酒醅中葡萄糖含量增加，可能促進(jìn)了吡嗪類(lèi)物質(zhì)的前體乙偶姻的生成從而提高了吡嗪類(lèi)物質(zhì)的含量[30]，因此在釀造過(guò)程中使用多糧為原料更有利于酒醅中吡嗪類(lèi)化合物的生成。另外，吡嗪類(lèi)物質(zhì)是醬香型和芝麻香型白酒的重要香氣成分[31]，對(duì)于兼具濃香-醬香-芝麻香的馥合香型等香型白酒而言，酒醅中吡嗪類(lèi)物質(zhì)含量較高可能對(duì)白酒整體風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)。

圖2 不同原料品種酒醅中淀粉（a）和還原糖（b）含量變化Fig. 2 Changes in starch (a) and reducing sugar (b) contents of two fermented grains during fermentation

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME-GC-MS和LLME-GC-MS的方法，在單糧和多糧馥合香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的酒醅中共檢測(cè)到86 種化合物。雖然單糧和多糧釀造的白酒酒醅中檢測(cè)到化合物種類(lèi)相同，產(chǎn)生的化合物總量相差不大，但是各類(lèi)化合物在發(fā)酵過(guò)程中的生成量存在一定差異。單糧發(fā)酵有利于酚類(lèi)和酸類(lèi)化合物生成，而多糧發(fā)酵有利于醇類(lèi)和含氮化合物的生成。采用OPLS-DA篩選出單糧和多糧釀造白酒酒醅中的關(guān)鍵差異化合物，發(fā)現(xiàn)單糧有利于苯乙醛的生成；而多糧有利于乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的生成。綜合分析發(fā)現(xiàn)，多糧酒醅在發(fā)酵過(guò)程中生成更高含量的吡嗪類(lèi)化合物，這可能是多糧酒醅不同于單糧酒醅的典型特征。本研究分析了單糧和多糧型白酒在發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性組分形成的差異，確定不同原料對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程的影響，對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化白酒發(fā)酵生產(chǎn)工藝、揭示白酒發(fā)酵機(jī)理具有一定指導(dǎo)意義。