海洋無(wú)脊椎動(dòng)物大防御素的研究進(jìn)展

許艷紅，閔 軍，周洪磊，張 怡，劉 衛(wèi)，胡曉珂,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所， 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003；3.福建省洋澤海洋生物科技有限公司，福建 福州 350600）

抗菌肽是動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌等生物產(chǎn)生的一類(lèi)具有生物學(xué)活性的物質(zhì)總稱(chēng)，包括陽(yáng)離子抗菌肽、陰離子抗菌肽和其他類(lèi)型抗菌肽?？咕牟粌H具有抗菌、抗病毒、抗真菌等多種生物活性，還具有廣泛的免疫和非免疫功能[1]，是抗生素的天然替代品之一。在臨床、醫(yī)藥、禽畜養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品等行業(yè)都有良好的應(yīng)用前景。

防御素是一類(lèi)富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，廣泛存在于植物、動(dòng)物、真菌等多細(xì)胞真核生物中[2]。大防御素作為防御素的超家族成員，目前主要發(fā)現(xiàn)于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中[3]。大防御素最早從節(jié)肢動(dòng)物鱟（Tachypleus tridentatus）的顆粒血細(xì)胞中分離出來(lái)[4]，隨后在雙殼貝類(lèi)、頭索動(dòng)物文昌魚(yú)中相繼被鑒定[5-8]。大防御素成熟肽含有兩個(gè)串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域，分別為高度疏水性N端結(jié)構(gòu)域和陽(yáng)離子類(lèi)β-防御素C端結(jié)構(gòu)域[3-4]。其中，N端結(jié)構(gòu)域與其他防御素沒(méi)有任何同源性，被認(rèn)為是大防御素的標(biāo)志[9]， 而C端結(jié)構(gòu)域與脊椎動(dòng)物β-防御素在結(jié)構(gòu)和功能上相似，因此普遍認(rèn)為β-防御素是大防御素進(jìn)化而來(lái)的[3,10]。大防御素的兩個(gè)功能域抗菌活性不同，N端結(jié)構(gòu)域主要抗革蘭氏陽(yáng)性菌，C端結(jié)構(gòu)域主要抗革蘭氏陰性菌[4]，在菌存在的條件下，牡蠣（Crassostrea gigas）大防御素Cg-BigDef1的N端結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)大防御素組裝納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)誘捕病原菌的能力可為新型藥物的開(kāi)發(fā)提供參考[3]。目前，大防御素在生物體內(nèi)合成量少，化學(xué)合成成本高，導(dǎo)致大防御素的應(yīng)用開(kāi)發(fā)緩慢。本文將從來(lái)源與分布、分子結(jié)構(gòu)與遺傳進(jìn)化、組織表達(dá)與調(diào)控、作用機(jī)理等方面對(duì)大防御素的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，并展望大防御素在水產(chǎn)養(yǎng)殖和育種、水產(chǎn)源食品安全、基因工程和抗菌藥物研發(fā)等方面的應(yīng)用潛力，以期為大防御素的應(yīng)用提供參考。

1 大防御素的來(lái)源與分布

目前大防御素蛋白主要發(fā)現(xiàn)于軟體動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物鱟、頭索動(dòng)物文昌魚(yú)中，都屬于兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物。根據(jù)兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物的分類(lèi)，對(duì)大防御素的分布進(jìn)行了動(dòng)物門(mén)、綱上的定位（圖1）。根據(jù)18S rRNA序列比對(duì)結(jié)果將兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物進(jìn)行遺傳學(xué)分類(lèi)，分為原口動(dòng)物和后口動(dòng)物，原口動(dòng)物按照“蛻皮假說(shuō)”包括冠輪動(dòng)物總門(mén)和蛻皮動(dòng)物總門(mén)[11-12]，由圖1可知，大防御素在蛻皮動(dòng)物總門(mén)中的分布十分狹窄，僅在節(jié)肢動(dòng)物鱟中發(fā)現(xiàn)有大防御素。 盡管節(jié)肢動(dòng)物昆蟲(chóng)綱、蛛形綱、甲殼綱中動(dòng)物數(shù)量龐大，但仍未發(fā)現(xiàn)有大防御素的蹤跡。

圖1 大防御素在動(dòng)物類(lèi)群中的分布[9]Fig.1 Distribution of big defensins in animal groups[9]

大防御素在冠輪動(dòng)物中分布廣泛，軟體動(dòng)物中幾乎所有的雙殼綱貝類(lèi)均發(fā)現(xiàn)有大防御素，包括牡蠣[6]、貽貝[5]、 扇貝[7,13-15]、蛤[16]、魁蚶[17]等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，特別地，還包括淡水生物三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[18]。目前，盡管大防御素主要在軟體動(dòng)物門(mén)的雙殼綱中被報(bào)道，但Gerdol等[9]從后生動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程出發(fā)，根據(jù)目前大防御素的物種分布，發(fā)現(xiàn)大防御素在軟體動(dòng)物中的分布并不局限于雙殼綱類(lèi)，預(yù)測(cè)在腹足綱（Gastropoda）、頭足綱（Cephalopoda）動(dòng)物，以及冠輪動(dòng)物總門(mén)中的環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)（Annelida）、帚蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)（Phoronida）、苔蘚動(dòng)物門(mén)（Bryozoa）動(dòng)物中也含有大防御素基因。目前，在頭足綱動(dòng)物章魚(yú)、魷魚(yú)以及腕足動(dòng)物門(mén)舌形貝（Lingula unguis）的基因組中識(shí)別出了大防御素蛋白的基因序列，但基因是否能表達(dá)還有待進(jìn)一步的鑒定。此外，大防御素在后口動(dòng)物中也存在，但是其分布非常狹窄，僅限于頭索動(dòng)物亞門(mén)文昌魚(yú)屬（Branchiostoma）[8]。 綜上，大防御素在物種中的分布是分散的，可能是由于某些物種中存在大防御素基因的丟失，而在另外一些物種中得以選擇性地保留。

2 大防御素的分子結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)與進(jìn)化關(guān)系

根據(jù)脊椎動(dòng)物防御素的結(jié)構(gòu)和6 個(gè)保守的半胱氨酸的配對(duì)模式可將其分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素。α-防御素是最早被報(bào)道的防御素，最先分離于兔巨噬細(xì)胞[19]，目前在人、馬、兔、鼠等少數(shù)哺乳動(dòng)物的中性粒細(xì)胞和腸壁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[2]。α-防御素通常由29～35 個(gè)氨基酸殘基組成，6 個(gè)保守的半胱氨酸的配對(duì)方式為Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。研究發(fā)現(xiàn)α-防御素的基因起源于β-防御素基因[20]。β-防御素是最古老的脊椎動(dòng)物防御素類(lèi)型，分布極其廣泛，從魚(yú)類(lèi)這種低等脊椎動(dòng)物到鳥(niǎo)類(lèi)再到哺乳類(lèi)動(dòng)物中均有大量的β-防御素發(fā)現(xiàn)。β-防御素通常由36～45 個(gè)氨基酸組成，6 個(gè)保守的半胱氨酸的配對(duì)方式為Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6[10]。β-防御素的功能廣泛，除具有廣譜抗菌活性外，在動(dòng)物體內(nèi)還可作為先天免疫和獲得性免疫的溝通橋梁，作為免疫調(diào)節(jié)劑提高機(jī)體的免疫能力[21]。θ-防御素存在于恒河猴、狒狒等非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，分布極其窄[22]。θ-防御素是由兩個(gè)截短的α-防御素組成的環(huán)狀二聚體多肽，含有18 個(gè)氨基酸殘基[23-24]，6 個(gè)保守的半胱氨酸的配對(duì)方式為Cys1-Cys6、Cys2-Cys5、Cys3-Cys4[2]。θ-防御素基因是由α-防御素基因進(jìn)化而來(lái)的[25]。雖然無(wú)脊椎動(dòng)物大防御素分子中也同樣含有3 個(gè)保守的二硫鍵，而且其二硫鍵的連接方式與脊椎動(dòng)物β-防御素相同，然而，大防御素從防御素中獨(dú)立分支出來(lái)，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有別于脊椎動(dòng)物防御素。動(dòng)物防御素的分布、大小、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及進(jìn)化關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物防御素的分布、氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及進(jìn)化關(guān)系Table 1 Distribution, amino acid sequences, structural characteristics and evolutionary relationships of animal defensins

2.1 大防御素的基因結(jié)構(gòu)

根據(jù)序列和物種的不同，大防御素基因結(jié)構(gòu)也有所區(qū)別，但是大多數(shù)貝類(lèi)和文昌魚(yú)的大防御素基因都含有3 個(gè)外顯子[9]。牡蠣大防御素是一個(gè)多序列家族，包含Cg-BigDef1、Cg-BigDef2、Cg-BigDef3基因簇。Cg-BigDef3具有一個(gè)典型大防御素基因結(jié)構(gòu)，含有3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，第一個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄部分5′非編碼區(qū)序列，第2個(gè)外顯子編碼部分5′非編碼區(qū)序列、信號(hào)肽、前肽序列以及成熟肽的N端結(jié)構(gòu)域，第3個(gè)外顯子編碼富含半胱氨酸的C端類(lèi)β-防御素結(jié)構(gòu)域和部分3′非編碼區(qū)序列（圖2）。大防御素基因結(jié)構(gòu)也有一些特殊性，如Cg-BigDef1和Cg-BigDef2的基因組結(jié)構(gòu)相似，只含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，這與三者的表達(dá)類(lèi)型相一致，即Cg-BigDef3為組成型表達(dá)，Cg-BigDef1和Cg-BigDef2為誘導(dǎo)型表達(dá)，說(shuō)明Cg-BigDef3僅編碼部分5′非編碼區(qū)序列的外顯子對(duì)于蛋白的表達(dá)具有重要作用[6]，同時(shí)也說(shuō)明含有3 個(gè)外顯子的大防御素基因結(jié)構(gòu)更原始。蝦夷扇貝My-BigDef基因是由4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子組成，也含有一個(gè)僅編碼5′非編碼區(qū)的外顯子[13]，并且其成熟肽N端的編碼在第2個(gè)和第3個(gè)外顯子之間隔開(kāi)。顯示出大防御素基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，暗示了大防御素在不同物種中的遺傳機(jī)制不同[9]。然而，從圖2中可以看出這些大防御素基因結(jié)構(gòu)雖然存在差異，但是C端結(jié)構(gòu)域均是由單一的外顯子編碼，顯示出保守區(qū)域的保守表達(dá)。

圖2 幾種大防御素基因結(jié)構(gòu)示意圖[6,13,29]Fig.2 Gene architecture of big defensins[6,13,29]

2.2 大防御素的蛋白結(jié)構(gòu)

大防御素在生物體內(nèi)首先是以前體的形式存在，包括信號(hào)肽、前域、成熟肽3 個(gè)部分[13,18]（圖3）。在抗菌肽中，前域普遍存在，例如鱟素[32]、貽貝肽[33]、地中海貽貝類(lèi)防御素肽[34]和貽貝素[35]等。前域的作用可能是將分子導(dǎo)向儲(chǔ)存在它們的特定顆粒中，阻斷對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，亦或是穩(wěn)定蛋白水解過(guò)程中前體的構(gòu)象[36]。但前域與大防御素的儲(chǔ)存、成熟的相關(guān)性還不明確。大防御素是一種分泌肽，信號(hào)肽的存在有利于肽的分泌。大防御素成熟肽的獲得首先是信號(hào)肽酶切除信號(hào)肽，然后類(lèi)KeΧ-2的蛋白酶識(shí)別Arg-Χ（n）-Arg/Lys-Ary位點(diǎn)并進(jìn)行切割，酶切后，得到含有79～94 個(gè)氨基酸殘基的成熟肽[10]。這種情況在脊椎動(dòng)物β-防御素中也有發(fā)現(xiàn)[21]。

圖3 大防御素氨基酸序列的多重比對(duì)[3,5]Fig.3 Multiple sequence alignment of big defensin peptides[3,5]

2.2.1 大防御素的初級(jí)結(jié)構(gòu)

大防御素的初級(jí)結(jié)構(gòu)分為結(jié)構(gòu)殘基和功能殘基。結(jié)構(gòu)殘基與高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及生物利用度緊密相關(guān)，這類(lèi)氨基酸殘基高度保守。功能殘基則主要是指一些電荷性、疏水性氨基酸殘基[30]。大防御素的最典型結(jié)構(gòu)殘基是6 個(gè)保守的半胱氨酸殘基，參與形成3 個(gè)分子內(nèi)二硫鍵（圖3）。二硫鍵的存在使大防御的結(jié)構(gòu)更加緊密，保證高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，有利于更好地發(fā)揮抗菌活性。大防御素成熟肽N端含有大量的疏水性氨基酸殘基，使N端結(jié)構(gòu)域高度疏水，與大防御素鹽離子穩(wěn)定性 相關(guān)[3,37]。大防御素的C端含有陽(yáng)離子氨基酸殘基，使C端具有功能性，對(duì)革蘭氏陰性菌有更強(qiáng)的抗性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，功能域中所帶的電荷與生物活性有很強(qiáng)的相關(guān)性，電荷的增加與活性的提高有關(guān)。且通常有一個(gè)最佳的活性電荷數(shù)，超過(guò)或低于這個(gè)值越多，活性越低[38]。鱟大防御素Tt-BigDef由于既有親水性又有疏水性的特點(diǎn)，是一種兩親性分子[39]。目前，研究已證明兩親性特征是多種抗菌肽殺菌活性所必需的結(jié)構(gòu)特征之一[38]。說(shuō)明大防御素發(fā)揮抗菌作用時(shí)，2 個(gè)結(jié)構(gòu)域均有參與，Loth等[3]證明二者具有協(xié)同作用。然而，牡蠣大防御素Cg-BigDef1與鱟大防御素Tt-BigDef不同，其具有疏水性。Cg-BigDef1、Tt-BigDef中連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)大小不同（圖3），進(jìn)而導(dǎo)致兩結(jié)構(gòu)域在空間構(gòu)象中的方向不同，致使兩者存在理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的差異，而具體的原因有待進(jìn)一步研究。

2.2.2 大防御素的高級(jí)結(jié)構(gòu)大防御素的高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究包括二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)， 而三級(jí)結(jié)構(gòu)僅限于鱟大防御素Tt-BigDef和牡蠣大防御素Cg-BigDef1（圖4），鱟大防御素Tt-BigDef的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)為N端含有平行的兩股β-折疊片，與兩個(gè)α-1,2-螺旋連接形成β1-α1-α2-β2模式（圖3），形成核心具有疏水性的球形結(jié)構(gòu)（高度疏水性N端結(jié)構(gòu)域）； C-端含有4 條反向平行的β-折疊片，形成β3-β4-β5-α3-β6模式，3 個(gè)二硫鍵分別連接β3-β6、β4-α3、β4-β5環(huán)與β6，得到由二硫鍵穩(wěn)定的C端結(jié)構(gòu)（陽(yáng)離子類(lèi)β-防御素C端結(jié)構(gòu)域）（圖3）[37]。Loth等[3]采用自然化學(xué)連接法合成了牡蠣大防御素Cg-BigDef1以及兩個(gè)分離的功能域，完整的Cg-BigDef1具有與鱟大防御素相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有6 個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)和3 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。如圖4所示的鱟大防御素和牡蠣大防御素的空間結(jié)構(gòu)，二者二級(jí)結(jié)構(gòu)相同，但空間構(gòu)象中兩功能域的方向不同，可能是連接區(qū)的柔性不同導(dǎo)致的。

圖4 鱟大防御素Tt- BigDef（A）和牡蠣大防御素Cg-BigDef1（B）的空間結(jié)構(gòu)[9,37]Fig.4 3D structures of Tt-BigDef (A) and Cg-BigDef1 (B)[9,37]

2.3 大防御素的基本性質(zhì)

大防御素作為防御素的超家族成員，具有保守的半胱氨酸序列，有良好的pH值和熱穩(wěn)定性[40]，且水溶性較好，能耐受飼料加工過(guò)程中的高溫高壓等劇烈條件[41]。哺乳動(dòng)物β-防御素抗菌活性嚴(yán)重受到鹽離子濃度影響[42-43]， 大防御素由于具有兩種功能域，而具有鹽離子穩(wěn)定性。Loth等[3]比較大防御素與β-防御素時(shí)，發(fā)現(xiàn)大防御素較β-防御素多一個(gè)N端疏水性結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域?qū)Υ蠓烙氐柠}離子穩(wěn)定性具有重要作用。牡蠣大防御素Cg-BigDef1在300 mmol/L和400 mmol/L NaCl的高鹽濃度下仍能保持較強(qiáng)的抗菌活性，主要在于大防御素的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的共價(jià)結(jié)合[3]。

2.4 大防御素的進(jìn)化分析

大防御素的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）顯示大防御素在同一物種如貽貝（Mytilus galloprovincialis）中發(fā)生了變異，且這些變異都是單源的（氨基酸序列相似性為49.59%～81.03%），可能是串聯(lián)重復(fù)基因和同源基因置換后快速分子多樣化的結(jié)果[9]。貽貝大防御素與牡蠣大防御素（相似性為48.18%～59.95%）被歸為同一單源分支，二者的親緣關(guān)系較其他物種高，與扇貝屬的大防御素親緣關(guān)系（相似性為34.19%～38.05%）最遠(yuǎn)。貽貝和扇貝屬大防御素種內(nèi)多樣性要大于種間多樣性。目前，大防御素的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)只能解釋部分大防御素的進(jìn)化問(wèn)題，更加詳細(xì)的信息還需要結(jié)合更多大防御素的 基因組結(jié)構(gòu)、基因變異以及物種分布鑒定知識(shí)才能了解。Gerdol等[9]將大防御素基因在物種中的分布與后生動(dòng)物的物種進(jìn)化樹(shù)結(jié)合進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出大防御素基因出現(xiàn)在兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物的祖先中，但是目前還并未在兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物進(jìn)化祖先中發(fā)現(xiàn)大防御素的同源物，對(duì)大防御素的鑒定仍需進(jìn)一步展開(kāi)。

圖5 大防御素的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[5-6,9]Fig.5 Phylogenetic tree of big defensins[5-6,9]

大防御素C端結(jié)構(gòu)域與β-防御素在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。一般認(rèn)為在系統(tǒng)發(fā)育上進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的物種之間分子具有結(jié)構(gòu)相似性，分為兩種：一種是分子結(jié)構(gòu)和功能的趨同進(jìn)化；另一種是兩種結(jié)構(gòu)和功能相近的分子具有遺傳進(jìn)化的關(guān)系。目前，關(guān)于大防御素與哺乳動(dòng)物β-防御素的關(guān)系，學(xué)者更傾向于后一種。大防御素在原口動(dòng)物和后口動(dòng)物（文昌魚(yú)）中均有存在（圖1），而后口動(dòng)物中頭索動(dòng)物、尾索動(dòng)物和脊椎動(dòng)物都是由古老的脊索動(dòng)物進(jìn)化而來(lái)的，頭索動(dòng)物文昌魚(yú)是無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化為脊椎動(dòng)物過(guò)程中的過(guò)渡生物，文昌魚(yú)中大防御素的發(fā)現(xiàn)讓學(xué)者更容易相信無(wú)脊椎動(dòng)物大防御素與脊椎動(dòng)物防御素之間在進(jìn)化上具有一定的相關(guān)性。Zhu Shunyi等[10]基于基因水平上的分析，發(fā)現(xiàn)這兩種防御素基因高度保守區(qū)域均含有一個(gè)保守的相位1內(nèi)含子（處于密碼子內(nèi)的第一和第二核苷酸之間），均在C端結(jié)構(gòu)域的5′端，猜想脊椎動(dòng)物β-防御素基因是由大防御素基因經(jīng)過(guò)外顯子重排或外顯子內(nèi)含子化進(jìn)化而來(lái)的。進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的基因在結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子相位上的保守，可以認(rèn)為這些基因具有共同的起源[44]。Gerdol等[9]認(rèn)為大防御與脊椎動(dòng)物β-防御素具有共同的起源，并且大防御素在不同物種中是采用不同的遺傳機(jī)制進(jìn)行進(jìn)化的。

而對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物大防御素和脊椎動(dòng)物的α-防御素、β-防御素、θ-防御素（圖6）的系統(tǒng)發(fā)育分析并沒(méi)有表現(xiàn)出脊椎動(dòng)物防御素是由大防御素進(jìn)化的關(guān)系，其中的原因可能是大防御素在無(wú)脊椎動(dòng)物物種的分布少且分散，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不夠全面，亦或是這種方法的可靠程度不足以說(shuō)明問(wèn)題。

圖6 動(dòng)物防御素和大防御素的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[5-6,29]Fig.6 Phylogenetic tree of big defensins and defensins[5-6,29]

3 大防御素的組織表達(dá)與調(diào)控

3.1 大防御素的組織表達(dá)多態(tài)性

大防御素作為無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)因子，在不同物種中的組織表達(dá)模式不同，呈現(xiàn)出多態(tài)性的特點(diǎn)（表2）。首先，大防御素在組織中的表達(dá)具有多樣性。在同一屬的物種中，大防御素在不同組織中的表達(dá)情況不同，如蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）大防御素基因My-BigDef在血液中的相對(duì)表達(dá)量最低，在外套膜中的相對(duì)表達(dá)量最高，消化腺肝胰臟和閉殼肌中相對(duì)表達(dá)量較高，外套膜可能是My-BigDef的重要合成器官[13]。海灣扇貝（Argopecten irradians）大防御素基因Ai-BigDef主要在血細(xì)胞中表達(dá)，在鰓中也有微量表達(dá)，但是在其他檢測(cè)組中幾乎不表達(dá)[14]。而同一物種中大防御素基因的變異型在組織中的表達(dá)情況也不相同，如貽貝中現(xiàn)已報(bào)道了6 種大防御素基因簇，其中My-BigDef1和My-BigDef3分別在消化腺和鰓中的相對(duì)表達(dá)量最高，在其余組織中均無(wú)法檢出，而My-BigDef2/6主要在外套膜中表達(dá)，但在消化腺和肌肉中也有少量表達(dá)[5]。另外，大防御素在不同物種中具有組織表達(dá)特異性，如牡蠣大防御素基因Cg-BigDef家族對(duì)血細(xì)胞具有特異性[6]，貽貝、魁蚶大防御素基因的主要表達(dá)組織為消化腺[5,17]，櫛孔扇貝（Mimachlamys nobili）、紫扇貝（Argopecten_purpuratus）大防御素基因Cn-BigDef、Ap-BigDef1主要 在外套膜中表達(dá)[7,15]。某些大防御素基因不在血細(xì)胞中表達(dá)而特異性地在組織中表達(dá)，說(shuō)明該大防御素可能是在組織上皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，也可能是與維持局部組織表面的菌群穩(wěn)態(tài)有關(guān)[45]。

表2 大防御素基因在軟體動(dòng)物不同組織中的組成型表達(dá)Table 2 Constitutive expression profiles of big defensin genes in different tissues of bivalve mollusks

3.2 大防御素的表達(dá)調(diào)控

3.2.1 大防御素在菌刺激下的組織表達(dá)響應(yīng)多樣性

在同一物種中，根據(jù)菌刺激下做出的響應(yīng)不同，大防御素基因分為組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)類(lèi)型。如弧菌（Vibrio）刺激前，牡蠣的3 個(gè)大防御素基因簇中Cg-BigDef1、Cg-BigDef2表達(dá)量很低，而在弧菌刺激后，Cg-BigDef1、Cg-BigDef2的表達(dá)量顯著上調(diào)，其表達(dá)受到弧菌刺激的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，屬于誘導(dǎo)型表達(dá)類(lèi)型。而Cg-BigDef3在感染前后表達(dá)量無(wú)明顯變化，表達(dá)不受菌感染的影響，屬于組成型表達(dá)類(lèi)型[6]。這說(shuō)明牡蠣中存在一個(gè)基本的免疫因子儲(chǔ)存過(guò)程以及應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，機(jī)體受到菌感染時(shí)，免疫系統(tǒng)能及時(shí)發(fā)揮作用，抵制病原體的侵害。蝦夷扇貝大防御素基因My-BigDef在血細(xì)胞中組成型表達(dá)量最低，而鰻弧菌（Vibrio anguillarum）刺激24 h后，血液中大防御素的表達(dá)量急劇升高，達(dá)到組成型表達(dá)量的十幾倍，菌刺激強(qiáng)烈誘導(dǎo)了蝦夷扇貝血細(xì)胞中大防御素基因的表達(dá)[13]。然而，對(duì)于紫扇貝來(lái)說(shuō)，血細(xì)胞中大防御素基因Ap-BigDef1不受菌刺激調(diào)控[7]。

在軟體動(dòng)物中，菌刺激下，大防御素基因的表達(dá)量會(huì)有一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，菲律賓蛤蜊（Venerupis philippinarum）大防御素基因Vp-BigDef、紫扇貝大防御素基因Ap-BigDef1、魁蚶大防御素基因Sb-BigDef1、海灣扇貝大防御素基因Ai-BigDef表達(dá)量開(kāi)始會(huì)隨著菌刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上調(diào)，一定時(shí)間表達(dá)量達(dá)到峰值[7,14,16-17]，而櫛孔扇貝大防御素基因Cn-BigDef、三角帆蚌大防御素基因Hc-BigDef隨著菌刺激表達(dá)的時(shí)序變化而不同，在達(dá)到峰值之前，會(huì)有表達(dá)量顯著降低的情況，之后再顯著上調(diào)[15,18]，可能的解釋是：1）表達(dá)大防御素的細(xì)胞會(huì)向感染部位聚集，導(dǎo)致其他組織中細(xì)胞減少致使大防御素的表達(dá)量下降，而細(xì)胞減少誘導(dǎo)了細(xì)胞的增殖，進(jìn)而引起后續(xù)大防御素表達(dá)量的增加；2）表達(dá)大防御素的細(xì)胞被激活后會(huì)先分泌出已合成的大防御素成熟肽，因此導(dǎo)致了大防御素基因轉(zhuǎn)錄的減少[46]。目前，關(guān)于環(huán)境刺激對(duì)大防御素的影響僅限于菌刺激，而其他環(huán)境刺激的影響也需要進(jìn)行研究，以便有利于更好地理解大防御素在宿主中的功能。

3.2.2 大防御素的表達(dá)受NF-κB/Rel信號(hào)通路調(diào)控

大防御素表達(dá)不僅要受到外界環(huán)境因子的調(diào)控，而在宿主中的表達(dá)還受到宿主內(nèi)因子的影響。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，大防御素等抗菌肽基因的表達(dá)要受到核因子（nuclear facter，NF）-κB/Rel信號(hào)通路調(diào)控。NF-κB/Rel家族是由NF-κB1（p50和它的前體p105）、NF-κB2（p52和它的前體p100）、RelA（p65）、c-Rel和RelB組成。NF-κB抑制劑是與NF-κB/Rel家族相互作用的重要物質(zhì)之一，在很大程度上，NF-κB/Rel信號(hào)通路的激活依賴(lài)于NF-κB抑制劑蛋白的大量降解，因此，NF-κB抑制劑被作為NF-κB/Rel信號(hào)通路的主要控制成分，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控中起到了關(guān)鍵作用[47]。Oyanedel等[48]在扇貝中發(fā)現(xiàn)了編碼NF-κB抑制劑的基因，采用RNA干擾技術(shù)抑制NF-κB的抑制劑表達(dá)，發(fā)現(xiàn)扇貝大防御素的表達(dá)顯著上調(diào)，且對(duì)照組中編碼NF-κB抑制劑基因在扇貝的所有組織中均能表達(dá)，而扇貝大防御素基因Ap-BigDef1在所有組織中也均有表達(dá)，說(shuō)明大防御的表達(dá)受到NF-κB/Rel信號(hào)通路的調(diào)控。牡蠣中Rel基因的發(fā)現(xiàn)為大防御素受NF-κB/Rel信號(hào)通路調(diào)控提供了新的證據(jù)。Li Yinan等[49]對(duì)牡蠣進(jìn)行菌刺激發(fā)現(xiàn)Rel基因的表達(dá)會(huì)增加，而通過(guò)干擾Rel基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)大防御素基因CgBigDef1的表達(dá)會(huì)減少。因此，通過(guò)對(duì)大防御素等抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控的研究有利于更好地理解菌刺激下機(jī)體產(chǎn)生的不同免疫響應(yīng)的分子機(jī)制。

4 大防御素的作用機(jī)理

目前，大多數(shù)抗菌肽主要是與細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生相互作用在膜上成孔或形成離子通道等來(lái)增加膜的滲透性，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏以及跨膜電勢(shì)的瓦解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[50-51]。而雙功能域的大防御素表現(xiàn)出不同于一般抗菌肽的抗菌機(jī)制。研究顯示，大防御素可能有兩種不同的抗菌過(guò)程：一種是鱟大防御素Tt-BigDef類(lèi)型的抗菌作用，即大防御素在發(fā)揮抗菌作用時(shí)，N端結(jié)構(gòu)域插入到細(xì)菌細(xì)胞膜中引起膜穿孔導(dǎo)致細(xì)胞死亡[37]，強(qiáng)調(diào)了N端結(jié)構(gòu)域的直接抗菌作用；另一種是牡蠣大防御素Cg-BigDef1類(lèi)型的抗菌作用，其抗菌作用是在菌的刺激下，N端結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)大防御素自組裝成的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)誘捕細(xì)菌進(jìn)而將其殺死[3]。大防御素形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力也被稱(chēng)為肽聚合能力，N端結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是這類(lèi)大防御素發(fā)生肽聚合的重要驅(qū)動(dòng)力，肽聚合使大防御素與細(xì)菌充分接觸，而真正發(fā)揮殺菌活性的是C端結(jié)構(gòu)域[9]，強(qiáng)調(diào)了N端結(jié)構(gòu)域的輔助作用。通過(guò)對(duì)上述牡蠣大防御素Cg-BigDef1和鱟大防御素Tt-BigDef結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)的比較概述，猜想可能是連接區(qū)長(zhǎng)度的不同、空間結(jié)構(gòu)中方向的不同共同導(dǎo)致了兩者表面性質(zhì)的差異，進(jìn)而影響了抗菌作用。紫扇貝大防御素Ap-BigDef N端同樣具有肽聚合能力[52]，而Ap-BigDef兩結(jié)構(gòu)域間的連接區(qū)的長(zhǎng)度與鱟大防御素接近，表明連接區(qū)的長(zhǎng)度不是大防御素抗菌機(jī)制不同的直接原因，而空間構(gòu)象對(duì)抗菌機(jī)制的影響有待進(jìn)一步探討和研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)大防御素自組裝成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還必須要有細(xì)菌的參與[3]，可能是細(xì)菌中的某種物質(zhì)或結(jié)構(gòu)觸發(fā)其構(gòu)象的改變進(jìn)而導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，鱟大防御素Tt-BigDef在膠束溶液中N端空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變[37]，但其是否能形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)還有待研究。因此，大防御素抗菌機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

5 大防御素的應(yīng)用潛力

5.1 抗菌耐藥性的應(yīng)用

由于抗生素的長(zhǎng)期使用與濫用對(duì)耐藥基因型細(xì)菌產(chǎn)生了選擇壓力，加速了耐藥型細(xì)菌的進(jìn)化，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的廣泛傳播與擴(kuò)散，對(duì)于動(dòng)物和人細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療是一種巨大的隱患。相較于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽藥效學(xué)和抗菌機(jī)制在預(yù)防耐藥性進(jìn)化方面顯示出巨大優(yōu)勢(shì)。目前，已有超過(guò)3 100 種天然抗菌肽在大量的植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)[53]，具有巨大的應(yīng)用前景。牡蠣大防御素Cg-BigDef1對(duì)臨床、環(huán)境分離的菌株以及對(duì)抗生素具有多重耐藥性的菌株均有抗性，其通過(guò)形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)誘捕病原菌來(lái)達(dá)到殺菌的目的，不會(huì)加速細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化，且對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)免疫源性、無(wú)抗性[9]，有望應(yīng)用于哺乳動(dòng)物中多重耐藥菌的感染治療，有作為抗生素替代品的巨大潛力。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)不同抗菌肽之間具有抗菌協(xié)同作用[54]，抗菌肽的協(xié)同作用可以減少耐藥性基因進(jìn)化的機(jī)率[55]，特別是那些可以感染多種動(dòng)物的病原菌，宿主會(huì)大量表達(dá)多種抗菌肽，在這些抗菌肽的協(xié)同作用下通過(guò)殺死病原菌來(lái)保障宿主的健康。因此，應(yīng)進(jìn)行大防御素與傳統(tǒng)的抗生素結(jié)合使用研究，利用不同抗菌物質(zhì)的協(xié)同抗菌作用來(lái)應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題。梁正敏等[56]研究發(fā)現(xiàn)牛中性粒細(xì)胞β-防御素5可協(xié)助利福平發(fā)揮更強(qiáng)的牛分支桿菌抗性，說(shuō)明防御素與抗生素的聯(lián)合使用具有巨大的應(yīng)用潛力。

5.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖和育種、水產(chǎn)源食品安全中的應(yīng)用

5.2.1 抗菌劑和疾病診斷

2008年，有研究發(fā)現(xiàn)β-防御素有對(duì)創(chuàng)傷感染和肺部感染疾病診斷的潛力[57]。而大防御素是無(wú)脊椎海洋動(dòng)物先天免疫中的重要效應(yīng)因子，當(dāng)機(jī)體受到病原菌感染時(shí)，不同組織中的大防御素基因的表達(dá)顯著上調(diào)，因此大防御素可作為海洋養(yǎng)殖軟體動(dòng)物疾病診斷的依據(jù)。大防御素具有廣譜抗菌活性，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物抵抗病原菌感染具有重要作用，可作為抗菌劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中以防止病原菌的感染。目前研究顯示，大防御素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抗性，特別地，大防御素Cg-BigDef1是少數(shù)對(duì)水產(chǎn)致病性弧菌表現(xiàn)出顯著抗性的抗菌肽[3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的抗菌活性不僅具有廣度，而且對(duì)于某些特定菌株還具有特異性[58]。因此，從基因、蛋白等水平上研究大防御素的抗菌特異性對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義，能夠防止殺害養(yǎng)殖動(dòng)物中的有益菌群，且能從解決外患和防止內(nèi)憂入手更好地達(dá)到防止動(dòng)物病原感染的目的。

5.2.2 作為評(píng)估宿主免疫能力標(biāo)志物的潛力

研究發(fā)現(xiàn)，物種特異性的抗菌肽能反映宿主的病原抗菌能力[59]。大防御素為海洋無(wú)脊椎動(dòng)物所特有的抗菌肽，可通過(guò)作為評(píng)估宿主免疫系統(tǒng)能力強(qiáng)弱的標(biāo)志物來(lái)篩選含有大防御素的牡蠣、扇貝等優(yōu)良養(yǎng)殖物種親本，以促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的遺傳改良。吳彪等[60]通過(guò)測(cè)定魁蚶不同發(fā)育時(shí)期大防御素的mRNA和蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)母源性大防御素能夠通過(guò)卵細(xì)胞傳遞給子代，并在卵子受精后被逐漸消耗。此外，牡蠣和貽貝中大防御素基因表現(xiàn)出很高的序列多態(tài)性和表達(dá)多態(tài)性，Schmitt等[61]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)免疫相關(guān)基因的表達(dá)多態(tài)性和序列多態(tài)性可以區(qū)分夏季死亡率高時(shí)的高生存率個(gè)體和低生存率個(gè)體，因此可以通過(guò)測(cè)定養(yǎng)殖物種在菌刺激時(shí)大防御素的表達(dá)情況來(lái)進(jìn)行優(yōu)良品種的篩選。并且研究顯示大防御素基因在牡蠣中會(huì)發(fā)生存在缺失變異[62]，這是同一物種在基因水平上的個(gè)體差異，因此，大防御素可應(yīng)用于更易適應(yīng)環(huán)境、生物與非生物壓力的品種篩選。這些研究提示，可以通過(guò)了解先天免疫因子大防御素在子代中的表達(dá)規(guī)律，并結(jié)合母源免疫開(kāi)發(fā)提高宿主體內(nèi)自身免疫因子含量的方法，來(lái)有效增強(qiáng)子代的免疫抵抗力，為科學(xué)制定提高養(yǎng)殖動(dòng)物早期成活率的策略提供理論依據(jù)，進(jìn)而促進(jìn)魁蚶、牡蠣、扇貝等苗種繁育產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

5.2.3 水產(chǎn)品安全

大防御素來(lái)源于水產(chǎn)源生物的先天免疫系統(tǒng)，研究顯示化學(xué)合成和重組表達(dá)的大防御素對(duì)食品常見(jiàn)致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）甚至是耐多重藥物的金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抗性[3,52]，蛤蜊大防御素對(duì)魚(yú)類(lèi)腐敗致病菌惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）具有很強(qiáng)的抗性[16]，將其應(yīng)用于水產(chǎn)生物中，有利于保證水產(chǎn)食品源的衛(wèi)生安全性和進(jìn)行水產(chǎn)食品的防腐。

5.3 新型藥物開(kāi)發(fā)——納米網(wǎng)的形成

大防御素的N端結(jié)構(gòu)域?qū)g-BigDef1、Ap-BigDef1形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)鹽離子穩(wěn)定以及抗菌活性至關(guān)重要[3,52]。一方面，可利用這一特性設(shè)計(jì)一種類(lèi)似于大防御素N端結(jié)構(gòu)的藥物載體將細(xì)菌誘引至不同接觸靶點(diǎn)，使具有協(xié)同作用的抗菌肽與之充分接觸，保證殺菌的高效性，同時(shí)更好地規(guī)避耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，在一些需要采用耐鹽的抗菌肽治療的疾?。ㄈ缒覡罾w維癥）藥物開(kāi)發(fā)方面，大防御素的N端結(jié)構(gòu)域在保證鹽離子穩(wěn)定抗菌活性上顯示出巨大優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)Cg-BigDef1不會(huì)引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性[3]，說(shuō)明大防御素的納米結(jié)構(gòu)對(duì)哺乳動(dòng)物是安全的。綜上所述，通過(guò)從大防御素的結(jié)構(gòu)和抗菌特點(diǎn)逐步深入，可為新型藥物的開(kāi)發(fā)提供新的設(shè)計(jì)思路。

6 大防御素的重組表達(dá)與分析檢測(cè)

鑒于大防御素的應(yīng)用前景廣泛，大防御素的高效獲得方法成為研究熱點(diǎn)。大防御素的重組表達(dá)是重要獲得途徑。Zhao Jianmin等[14]通過(guò)構(gòu)建鰻弧菌感染的海灣扇貝的cDNA文庫(kù)找到并克隆出海灣扇貝大防御素基因，根據(jù)釀酒酵母密碼子使用偏好優(yōu)化基因Ai-BigDef，亞克隆到重組表達(dá)載體pPIC9K中，由畢赤酵母GS115誘導(dǎo)表達(dá)了重組海灣扇貝大防御素，重組海灣扇貝大防御素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌具有抑制活性。此外，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離發(fā)酵液上清蛋白時(shí)有較多雜蛋白條帶，而畢赤酵母分泌的內(nèi)源蛋白極少[63]，雜蛋白條帶的出現(xiàn)可能是大防御素對(duì)宿主菌有溶菌作用，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的溶出，這一現(xiàn)象需要進(jìn)一步的解釋。畢赤酵母分泌表達(dá)外源蛋白的影響因素主要有密碼子偏愛(ài)性、基因中腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸（A、T）含量、啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、分子伴侶、基因拷貝數(shù)、糖基化修飾以及發(fā)酵條件等，近年來(lái)，針對(duì)這些影響因素開(kāi)發(fā)了許多優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的策略，有望實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)[64]。 而鑒于大防御素對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）的抑菌作用較弱，2010年，Zhao Jianmin等[16]構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-21a-Vp-BigDef，以大腸桿菌BL21(DE3)-plysS為宿主菌成功表達(dá)了重組菲律賓蛤蜊大防御素，50 mL發(fā)酵液中可純化得到0.9 mg重組蛋白。同樣，Teng Lei[8]和González[7]等利用pET系列載體在大腸桿菌DE3中分別實(shí)現(xiàn)了頭索動(dòng)物文昌魚(yú)大防御素Bj-Bigdef、紫扇貝大防御素Ap-Bigdef的重組表達(dá)，且均具有抗菌活性。為了提高大防御素的表達(dá)量，董姝君[18]進(jìn)行了將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶與三角帆蚌大防御素在大腸桿菌中融合表達(dá)的嘗試，實(shí)現(xiàn)了融合蛋白表達(dá)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增加。因此，通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不斷完善以及大防御素表達(dá)條件的不斷優(yōu)化可實(shí)現(xiàn)大防御素的高效表達(dá)。

目前，防御素的測(cè)定方法有競(jìng)爭(zhēng)性化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法、狹縫印記測(cè)定法、半定量Western分析、酶聯(lián)免疫吸附法、非標(biāo)記液晶生物傳感器法、基于選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)的蛋白質(zhì)組學(xué)法、高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法[65]。而大防御素的檢測(cè)方法主要是生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的抗體，采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)[7]，酶解法裂解大防御素后，利用高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法分析肽段進(jìn)而對(duì)大防御素氨基酸進(jìn)行分析[3]。針對(duì)大防御素的功能檢測(cè)主要是通過(guò)微量肉湯稀釋法測(cè)定大防御素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（如金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、溶壁微球菌（Micrococcus lysodikicus）等）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、弧菌等）的最小抑菌濃度[14,16]來(lái)評(píng)判其抗菌效果。

7 結(jié) 語(yǔ)

大防御素具有廣泛應(yīng)用潛力，但其實(shí)際應(yīng)用首先要基于足夠的生產(chǎn)量。但目前生物體合成量少，直接從生物體中提取困難，化學(xué)合成成本比較高且技術(shù)還不夠成熟，無(wú)法達(dá)到應(yīng)用的需求。因此，基因工程菌體外重組表達(dá)成為獲取大防御素的重要途徑。目前，對(duì)于大防御素的重組表達(dá)進(jìn)行了大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的初步嘗試[7-8,14,16]，但有關(guān)表達(dá)量、產(chǎn)物純化以及純化產(chǎn)物生物學(xué)活性的研究資料還十分缺乏，僅處于生產(chǎn)階段，還未進(jìn)入表達(dá)質(zhì)量評(píng)估階段。因此，今后研究的一個(gè)重點(diǎn)就是優(yōu)化大防御素體外重組表達(dá)，以獲得高表達(dá)、高質(zhì)量的大防御素。另外，為了更好地挖掘大防御素的抗生素替代潛力以及設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)更多的新型藥物，需要加大大防御素相關(guān)基礎(chǔ)問(wèn)題的研究，例如大防御素的分離鑒定、大防御素的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域的抗菌作用機(jī)理、大防御素與其他物質(zhì)如抗生素等的互作等。