脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物檢測(cè) 方法的研究進(jìn)展

劉 慧，吳 穎，黃 華

（1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，北京 101300；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

真菌毒素是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，絕大部分具有毒性。目前已知的真菌毒素超過(guò)300余種[1]，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約有25%～50%的農(nóng)作物會(huì)遭受真菌毒素的污染[2]。近年來(lái)， 由于氣候變化和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的改變，赤霉病已成為影響小麥等農(nóng)作物生產(chǎn)的最為嚴(yán)重的真菌病害之一。研究表明，赤霉病的發(fā)生與單端孢霉烯族毒素含量高度相關(guān)[3]。該毒素主要由鐮刀菌（Fusarium）產(chǎn)生， 基本結(jié)構(gòu)為四環(huán)倍半萜，典型特征是C9與C10處具有化學(xué)雙鍵，C12與C13處具有環(huán)氧化物[4]。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)中取代基的不同，可分為A、B、C、D 4 種類型，其中B型單端孢霉烯族毒素是污染最為普遍的一種鐮刀菌毒素[5]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）屬于B型單端孢霉烯族毒素，其化學(xué)名稱為3α,7α,15α-三羥基-12,12-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮，C8位置上有羰基[6]，最早由日本學(xué)者M(jìn)orooka等[7]于20世紀(jì)70年代在受鐮刀菌感染的小麥等農(nóng)作物中被發(fā)現(xiàn)并鑒定。DON理化性質(zhì)穩(wěn)定，在谷物磨粉、食品生產(chǎn)及日常食物烹調(diào)加工過(guò)程中均難以被破壞，還可在食物鏈中長(zhǎng)期富集，因此DON會(huì)對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生廣泛且明顯的毒性效應(yīng)[8]。研究表明，攝食被DON毒素污染的食物或飼料會(huì)引起生物體胃腸道和免疫系統(tǒng)功能損傷，誘發(fā)內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的病變，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成極大的威脅。急性DON中毒癥狀主要表現(xiàn)為腹部不適，如惡心、嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)甚至可能損害造血系統(tǒng)以致死亡；而長(zhǎng)期低劑量接觸可引起厭食癥、生長(zhǎng)遲緩、免疫失調(diào)、生殖和發(fā)育障礙等[9-10]。另外，DON及其衍生物還可以和其他真菌毒素如玉米赤烯酮等產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，加劇動(dòng)物肝、腎臟細(xì)胞膜損傷和氧化損傷[11]。

DON可通過(guò)乙?；?、氧化、脫環(huán)氧化或糖基化反應(yīng)降解成各種衍生物，這些衍生物又稱掩蔽型DON，包括3-乙?；?DON（3-acetyldeoxynivalenol，3-AcDON）、15-乙烯基-DON（15-acetyldeoxynivalenol，15-AcDON）、脫環(huán)氧DON（deepoxy-deoxynivalenol，DOM-1）、DON-3-葡萄糖苷（DON-3-glucoside，DON-3-Glc）和DON-3-O-葡萄糖醛酸（DON-3-glucuronide，DON-3-GlcA）等[12-16]，其基本信息見(jiàn)圖1。有研究表明，DON的各種衍生化產(chǎn)物對(duì)禾谷類農(nóng)作物同樣具有極強(qiáng)的污染性，15-AcDON是引起全球赤霉菌病的主要化學(xué)型[17]。盡管這些衍生物的毒性比DON本身低[18]，但在目前的研究中也已將3-AcDON、15-AcDON、DOM-1和DON-3-Glc等衍生物共同視為DON檢測(cè)項(xiàng)目中的靶標(biāo)化合物[19-20]。 因此，尋找快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)以分析食品、飼料、人和動(dòng)物體中DON及其衍生物的含量，對(duì)于暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及人們的飲食健康都具有十分重要的意義。本文綜述了DON及其衍生物檢測(cè)的常見(jiàn)技術(shù)，總結(jié)和比較了不同方法的原理及優(yōu)缺點(diǎn)，并介紹了具有良好應(yīng)用潛力的新興方法，此外還討論了與樣品制備有關(guān)的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，包括目標(biāo)物的提取和凈化，以期為DON及其衍生物檢測(cè)方法的科學(xué)選擇提供參考。

圖1 DON及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of DON and its derivatives

1 DON及其衍生物的提取與凈化

1.1 提取

DON及其衍生物屬極性化合物，通常選用極性溶劑如甲醇、乙醇、乙腈、水或極性溶劑的混合體系進(jìn)行提取。溶劑體系中各溶劑的比例由DON的理化特性及所選的檢測(cè)系統(tǒng)決定，DON提取常用的溶劑為乙腈-水的混合體系[17,21-22]。有研究報(bào)道，對(duì)于谷物樣品，含0.1%甲酸-水/乙腈（43∶57，V/V）的萃取體系可以更好地回收DON[23]；而對(duì)于血漿等樣品，以一定比例的甲醇-水作為提取溶劑，回收效果更佳，回收率高達(dá)80%[24]。提取溶劑的用量一般按照樣品質(zhì)量的4 倍進(jìn)行添加。樣品加入提取溶劑后要通過(guò)機(jī)械振蕩或漩渦充分混勻；而對(duì)于其他生物樣品，尤其是尿液，由于樣品中的葡萄糖醛酸化程度高，提取液中還需添加β-葡萄糖苷酶，然后再進(jìn)行混勻。對(duì)于提取次數(shù)的確定，有研究比較了一次提取和多次提取的回收率，發(fā)現(xiàn)二次提取DON的回收率顯著高于一次提取[25]。

1.2 凈化

經(jīng)溶劑提取后，DON及其衍生物還需要進(jìn)一步的凈化后再進(jìn)行定性定量分析，目的是減少雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾。傳統(tǒng)的液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）技術(shù)利用液體混合物中各組分在兩相中溶解度的差異實(shí)現(xiàn)提取凈化。根據(jù)相似相溶原理，乙腈/正己烷或甲醇/正己烷體系是常見(jiàn)的DON及其衍生物的萃取溶劑，可去除脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。LLE技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)等特點(diǎn)，但存在有機(jī)溶劑用量大、耗時(shí)、非特異性、目標(biāo)物易流失、不能滿足高通量檢測(cè)需求等問(wèn)題。隨著凈化技術(shù)的發(fā)展，固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）、多功能柱（multifunctional column，MFC）、免疫親和柱（immunoaffinity colums，IAC）等被廣泛應(yīng)用于DON等真菌毒素的凈化[26]。SPE技術(shù)基于液相色譜（liquid chromatography，LC）-固相色譜分離原理，目標(biāo)物首先被吸附到合適的固體吸附劑上，然后通過(guò)淋洗使目標(biāo)物與干擾組分分離，最后以合適的洗脫劑將目標(biāo)物從固體吸附劑上解離下來(lái)，從而達(dá)到凈化與富集目標(biāo)物的目的。SPE技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑用量少、適用于多殘留分析等優(yōu)點(diǎn)，目前用于DON及其衍生物凈化的SPE柱主要有硅膠柱、florisil柱、C8或C18反相SPE柱、離子交換柱等[17,27-31]。MFC是一種特殊的SPE柱，它以極性、非極性及離子交換樹脂等作為復(fù)合吸附填料，基于多重吸附機(jī)制，快速且有選擇性地吸附樣品中的色素、脂類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，而不吸附待測(cè)目標(biāo)物，從而使樣品得以凈化。研究表明，MFC凈化過(guò)程操作簡(jiǎn)單 快速，凈化效果較好，尤其適用于谷物中DON及其衍生物的同步分析[32-33]。Berthiller等[34]檢測(cè)了自然感染和人工接種感染赤霉病小麥中DON及DON-3-Glc的含量，樣品提取溶液采用MFC柱凈化，定容后再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，該方法在DON-3-Glc加標(biāo)0.15～1.20 mg/L時(shí)，回收率范圍為57.9%～64.1%，平均回收率為（60±8）%。DON及其衍生物采用MFC法凈化時(shí)，還可選用兩種商品化柱，分別是Multisep?和Mycosep?，這兩種柱子的凈化原理都是基于填料吸附干擾組分而使目標(biāo)物通過(guò)固相柱。IAC技術(shù)即利用免疫反應(yīng)的高度特異性，以抗原或抗體一方作為親和配基吸附另一方，從而使樣品得到凈化的分離體系[35]。Kostelanska等[36]采用專效凈化DON的IAC柱（DONPREPTM）對(duì)啤酒樣品進(jìn)行凈化處理，結(jié)果顯示該IAC柱能夠同時(shí)分離DON、DON-3-Glc和3-AcDON，且回收率較高。但是，DON及其衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量較小，屬弱免疫物質(zhì)，容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，因此目前可供選擇的商品化IAC種類十分有限[21,37]，且IAC柱的價(jià)格也相對(duì)偏高，使其在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)受到一定的限制。

此外，有研究報(bào)道分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIP）和免疫超濾（immune ultrafiltration，IUF）凈化技術(shù)在DON檢測(cè)中也顯示出巨大的潛力。MIP通過(guò)引入目標(biāo)物模板分子進(jìn)行聚合，再對(duì)模板分子進(jìn)行洗脫，這樣會(huì)在聚合物中留下模板分子空穴結(jié)構(gòu)和大小的“印跡”，這種“印跡”結(jié)構(gòu)能夠特異性識(shí)別目標(biāo)物及其結(jié)構(gòu)類似物[38]。因此，MIP具有較好的構(gòu)效預(yù)定性和選擇性，并且耐高溫、酸堿和有機(jī)溶劑。與IAC技術(shù)相比，MIP方法更便宜、高效。在IUF方法中，超濾膜裝置中膜的孔徑足夠小，可以保留抗體。具體操作過(guò)程是萃取混合液通過(guò)超濾膜，目標(biāo)組分即與抗體相結(jié)合，然后淋洗去除未被結(jié)合的干擾組分，再通過(guò)添加有機(jī)修飾劑將抗原抗體復(fù)合物解離開，最后經(jīng)離心將目標(biāo)物質(zhì)洗脫下來(lái)[39]。相較于IAC技術(shù)，IUF不需要固體支撐材料，使用起來(lái)更方便，同時(shí)它的高選擇性可與IAC相媲美。

2 DON及其衍生物的檢測(cè)方法

目前，對(duì)DON及其衍生物的檢測(cè)技術(shù)主要包括免疫法、光譜法、色譜法和質(zhì)譜法等，這些技術(shù)又可進(jìn)一步分為快速檢測(cè)和確證檢測(cè)兩類?？焖贆z測(cè)主要用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和半定量分析，而確證檢測(cè)則用于定性定量分析和實(shí)驗(yàn)室仲裁檢測(cè)。兩類檢測(cè)方法互為補(bǔ)充，為防范DON毒素安全風(fēng)險(xiǎn)提供一定技術(shù)支撐。

2.1 快速篩查方法

2.1.1 薄層色譜法薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）是較早 應(yīng)用于真菌毒素檢測(cè)分析的常規(guī)方法之一，主要原理是通過(guò)觀察毒素在紫外光線照射下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光的強(qiáng)弱和斑點(diǎn)大小來(lái)判定毒素的種類和含量[40]。Makun等[41]采用TLC法分離鑒定大米中DON，方法檢出限為 100 μg/kg，且分離效果良好。TLC方法簡(jiǎn)單，但存在試劑用量大、前處理繁瑣、重現(xiàn)性差、檢出限高等缺點(diǎn)，很難滿足現(xiàn)代食品檢測(cè)高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高自動(dòng)化的要求，在DON檢測(cè)研究中也已很少單獨(dú)使用TLC方法。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，TLC與其他分離技術(shù)手段如高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）法的聯(lián)合使用使得TCL法在DON檢測(cè)方面仍有一定的應(yīng)用前景[42]。

2.1.2 免疫分析法

2.1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法是目前檢測(cè)DON等真菌毒素最常用的免疫學(xué)分析策略。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)標(biāo)本性狀和試劑來(lái)源以及檢測(cè)條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測(cè)方法，主要包括雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和間接法。DON等真菌毒素屬于小分子物質(zhì)，一次只能結(jié)合一個(gè)抗體，故一般采取競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)模式。目前有多種專門針對(duì)食品及飼料中DON檢測(cè)的商品化ELISA試劑盒，這些ELISA試劑盒的靶標(biāo)物質(zhì)還包括3-AcDON、15-AcDON、脫環(huán)氧DON （DOM-1）和DON-3-葡萄糖苷等衍生物[43-44]。韓麗等[45]研制了一種自主組裝的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，用于飼料中DON的檢測(cè)，該試劑盒對(duì)DON的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為1.147 ng/mL，檢測(cè)范圍為1.50～130.31 ng/mL，測(cè)定結(jié)果與HPLC法結(jié)果一致。ELISA方法快速、靈敏、方便，在日常檢測(cè)中被廣泛使用，但它存在易發(fā)生交叉反應(yīng)、結(jié)果假陽(yáng)性率高、基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重等缺點(diǎn)，通常需要配合使用其他分析方法以驗(yàn)證結(jié)果。

2.1.2.2 時(shí)間分辨熒光免疫分析法

時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是在熒光免疫分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，與傳統(tǒng)的熒光素標(biāo)記不同，它以釤（Sm）、鈮（Nd）等三價(jià)稀土離子鑭系元素為標(biāo)記物代替熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物、酶、同位素，標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等。這些離子可產(chǎn)生熒光，其熒光不僅強(qiáng)度高，且熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，通過(guò)延長(zhǎng)測(cè)量時(shí)間，待樣品中壽命短的自然熒光衰變后再用TRFIA技術(shù)檢測(cè)，可消除自然熒光的干擾。TRFIA技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究也已逐漸展開，在DON等真菌毒素等分析中相繼建立起來(lái)，與傳統(tǒng)的ELISA相比，它具有良好的線性范圍和較低的基質(zhì)效應(yīng)。Zhang Jue等[46]采用TRFIA法測(cè)定谷物中的DON，結(jié)果表明使用Sm3+標(biāo)記的抗體比其他熒光染料標(biāo)記的抗體更穩(wěn)定，發(fā)射光譜更窄，DON的檢出限為0.194 μg/kg。TRFIA的熒光信號(hào)強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性強(qiáng)，同時(shí)它還不具有放射性，安全系數(shù)高，是一種很有應(yīng)用前景的技術(shù)。

2.1.2.3 側(cè)向免疫分析法

側(cè)向免疫分析（lateral flow immunoassay，LFI）法是在免疫滲透技術(shù)基礎(chǔ)上建立的固相標(biāo)記分析技術(shù)，其結(jié)合了免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。LFI的物化形式是免疫層析試紙條，其核心部分由樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)墊、支撐墊和吸水墊5 個(gè)部分組成（圖2）。LFI法以條狀纖維素膜為固相載體，借助毛細(xì)管的吸附作用使樣品在層析材料上移動(dòng)，當(dāng)流經(jīng)檢測(cè)帶和控制帶時(shí)，抗原、抗體和指示探針會(huì)發(fā)生一系列反應(yīng)，通過(guò)肉眼觀察和儀器測(cè)定進(jìn)行定性和定量分析[47]。目前應(yīng)用于真菌毒素等小分子目標(biāo)物檢測(cè)的LFI主要基于競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)模式，基本原理是固定化抗原/抗體與待檢樣品溶液中的目標(biāo)分析物之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，共同競(jìng)爭(zhēng)抗體/抗原與標(biāo)記物形成的指示探針。樣品滴加到樣品墊時(shí)，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)管作用流經(jīng)層析條帶，如果樣品中含有目標(biāo)分析物，則其會(huì)與指示探針結(jié)合后形成分析物-指示探針復(fù)合物，此時(shí)檢測(cè)帶上所能捕獲的探針量就少，檢測(cè)帶不可見(jiàn)，結(jié)果呈陽(yáng)性；如果樣品溶液中不存在目標(biāo)分析物或其含量低于檢測(cè)范圍，所有的指示探針都會(huì)與檢測(cè)帶相結(jié)合，而多余的指示探針會(huì)繼續(xù)流過(guò)膜與控制帶相結(jié)合，檢測(cè)帶與控制帶均可見(jiàn)，此時(shí)的結(jié)果呈陰性。Yu Songcheng等[48]通過(guò)制備抗體-納米-Au顆粒及DON-牛血清白蛋白復(fù)合物以建立基于競(jìng)爭(zhēng)免疫原理的LFI法，用于檢測(cè)谷物中的DON，該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，視覺(jué)檢出限低至10 ng/kg。LFI法具有直觀、成本低廉、顯色迅速、適用于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模初步篩選等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)靈敏度較低、結(jié)果易誤判、難以定量、易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)一定程度上限制了LFI的推廣應(yīng)用。

圖2 側(cè)向?qū)游鲈嚰埛磻?yīng)模板[47]Fig.2 Reaction template for lateral flow test strip[47]

2.1.2.4 其他新興免疫分析法

免疫芯片是基于蛋白質(zhì)微陣列和免疫反應(yīng)原理開發(fā)的一種特殊蛋白芯片，芯片上的探針點(diǎn)陣通過(guò)特異性免疫反應(yīng)捕獲樣品中的靶標(biāo)蛋白，然后用專用激光掃描系統(tǒng)和軟件對(duì)其進(jìn)行圖像掃描、分析及結(jié)果解釋。Wang Ying等[49]采用免疫芯片法同時(shí)檢測(cè)了包括DON在內(nèi)的12 種不同的真菌毒素，其中DON的檢出限為15.45 ng/mL。免疫芯片技術(shù)具有高通量、自動(dòng)化、靈敏度高和能夠多元分析等 優(yōu)點(diǎn)，特別適合用于多種DON毒素的同時(shí)分析。多重分析（multi-analyte profiling，ΧMAP）是一種基于流式細(xì)胞儀、ELISA和微陣列原理開發(fā)的一種新型檢測(cè)技術(shù)，具有低敏感性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。ΧMAP技術(shù)將一種用特殊顏色編碼的微球懸浮液陣列與專用流式細(xì)胞儀結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)孔中使用很小的樣品量即可完成不同目標(biāo)物的同時(shí)測(cè)定。Peters等[50]利用抑制免疫原理，將DON-牛血清白蛋白偶聯(lián)到羧化順磁微球上以對(duì)DON進(jìn)行ΧMAP分析，方法的檢出限低于500 μg/kg，該結(jié)果得到液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-tandem mass spectra，LC-MS/MS） 的驗(yàn)證，同時(shí)在測(cè)定過(guò)程中未觀察到交叉反應(yīng)。平面波導(dǎo)（planar waveguide，PWG）是一種基于間接競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定原理的篩選方法，通過(guò)光在波導(dǎo)中的傳播，測(cè)定與生物芯片表面結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物中的標(biāo)記抗體的熒光。近年來(lái)PWG也被用作同時(shí)分析多種真菌毒素，如在Tittlemier等[51]的研究中，采用PWG系統(tǒng)檢測(cè)到的DON檢出限約為400 μg/kg。然而，對(duì)于DON含量范圍在1 250～2 000 μg/kg的小麥樣品，該P(yáng)WG系統(tǒng)檢測(cè)的結(jié)果僅為GC-MS測(cè)定值的71%。PWG與其他分析技術(shù)相比，靈敏度較低。

2.1.3 生物傳感器法

2.1.3.1 表面等離子體共振法

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種光學(xué)物理現(xiàn)象，一束P偏振光在一定的角度范圍內(nèi)（入射角大于臨界角）入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象，所形成消逝波進(jìn)入光疏介質(zhì)中，并引發(fā)金屬薄膜中的自由電子形成表面等離子體。表面等離子的集體振蕩能夠產(chǎn)生一種沿著界面?zhèn)鞑サ臋M向電磁波，即表面等離子波。當(dāng)消逝波的波矢量與表面等離子波的波矢量相等時(shí)，引起金屬膜內(nèi)自由電子產(chǎn)生共振，即SPR。當(dāng)發(fā)生SPR時(shí)，檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度減弱。此時(shí)，光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被表面等離子吸收，使反射光的能量急劇減少，其中反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨著金屬薄膜表面折射率的改變而改變，任何附著在金屬薄膜表面物質(zhì)的量、構(gòu)型發(fā)生改變時(shí)均可被檢測(cè)出來(lái)[52]，其原理圖見(jiàn)圖3。SPR作為一種敏感的表面分析技術(shù)，通常被認(rèn)為是不使用任何人工標(biāo)記試劑的生物傳感器。SPR生物傳感器將探針或配體固定于金屬薄膜（傳感芯片）表面，含目標(biāo)分析物的測(cè)試樣品流經(jīng)金屬薄膜表面，分子間會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)從而改變膜表面的折射率，并通過(guò)放大反射光微小角度的變化響應(yīng)以得到分析結(jié)果[52]。Hossain等[53]基于競(jìng)爭(zhēng)免疫原理建立了納米金增強(qiáng)多重成像SPR方法，用于檢測(cè)小麥中DON，該方法檢出限為15 μg/kg。Wei Tao等[54]使用自組裝單層膜傳感器芯片建立了SPR方法，用于檢測(cè)小麥和玉米中的 DON，該方法不易發(fā)生交叉反應(yīng)，線性范圍良好，特異性較強(qiáng)，最低檢出限為3.26 ng/mL。SPR方法快速、靈敏，但測(cè)定結(jié)果易受溫度波動(dòng)和基質(zhì)效應(yīng)的影響，穩(wěn)定性較差。

圖3 SPR傳感器原理圖[52]Fig.3 Schematic diagram of surface plasmon resonance sensor[52]

2.1.3.2 生物膜層干涉法

生物膜層干涉法（biolayer interometry，BLI）是基于光干涉原理的非標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)損檢測(cè)、樣品消耗量少、實(shí)時(shí)結(jié)果輸出等優(yōu)點(diǎn)。與SPR的原理類似，BLI需要將目標(biāo)分析物結(jié)合在生物傳感器末端形成一層生物膜，區(qū)別在于BLI通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)光的干涉信號(hào)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的相互作用分析或檢測(cè)[55]。關(guān)于小麥粉中DON的BLI分析結(jié)果表明，檢測(cè)過(guò)程在7 min即可完成，測(cè)定的DON的檢出限為100 μg/kg[56]。Maragos等[57]采用抗體-膠體金偶聯(lián)物建立的BLI方法可將DON的檢出限降低至90 μg/kg，測(cè)定時(shí)間縮短至6 min，結(jié)果得到HPLC法的驗(yàn)證。與SPR方法類似，BLI同樣存在對(duì)溫度波動(dòng)敏感的問(wèn)題，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或陰性結(jié)果。

2.1.4 光譜分析方法

2.1.4.1 高光譜成像技術(shù)

高光譜成像技術(shù)（hyperspectral imaging，HSI）是基于非常多窄波段的影像數(shù)據(jù)技術(shù)，具有豐富的吸收譜帶，在識(shí)別樣品外部特征信息的同時(shí)，可獲得反映樣品內(nèi)部物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的光譜信息，并將圖譜合二為一。HSI最大的特點(diǎn)是能夠?qū)资畟€(gè)乃至幾百個(gè)窄波段進(jìn)行連續(xù)的光譜覆蓋，同時(shí)光譜分辨率高、操作方便。典型的HSI系統(tǒng)由硬件和軟件組成（圖4），硬件主要包括提供照明的光源、檢測(cè)器（可同時(shí)獲得光譜和空間信息）、高光譜儀（用于分散反射、透射或散射光的波長(zhǎng)，并將信號(hào)傳送到檢測(cè)器的感光表面）、物鏡（調(diào)整光的采集范圍）、載物臺(tái)以及計(jì)算機(jī)。成像原理為激發(fā)光源模塊產(chǎn)生線光源，照射到待測(cè)樣品后產(chǎn)生漫反射光，利用高信噪比的高光譜儀將產(chǎn)生的光轉(zhuǎn)換成光譜，并將其形成圖像，由攝像機(jī)統(tǒng)一接受并傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中，獲得可以指示食品樣品中物理性質(zhì)和化學(xué)成分的高光譜圖像。HSI具有非破壞性、操作簡(jiǎn)便、快速且重復(fù)性好等特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，目前主要應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)外部品質(zhì)的檢測(cè)，近年來(lái)也有應(yīng)用于DON等真菌毒素檢測(cè)的報(bào)道。如Liang Kun等[58]通過(guò)可 見(jiàn)-近紅外（visible near-infrared，Vis-NIR）和短波近紅外（short-wave infrared，SWIR）兩個(gè)高光譜成像系統(tǒng)分別采集96 個(gè)小麥籽粒和小麥粉的圖像，經(jīng)多元散射校正（mutiplicative scatter correction，MSC）和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate，SNV）兩種方法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，再分別運(yùn)用基于支持向量機(jī)和稀疏自動(dòng)編碼（sparse auto-encoder，SAE）網(wǎng)絡(luò)的算法建立模型用于預(yù)測(cè)樣品中DON的含量水平，結(jié)果表明，對(duì)于小麥籽粒樣品，Vis-NIR-MSC-SAE模型預(yù)測(cè)性能更高；對(duì)于小麥粉樣品，SWIR-SNV-SAE模型的預(yù)測(cè)性能更高。

圖4 高光譜成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)[59]Fig.4 Configuration of a hyperspectral imaging[59]

2.1.4.2 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜是一種能夠表征分子振動(dòng)能級(jí)的光譜，其拉曼效應(yīng)來(lái)源于分子振動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)，能夠?qū)ξ镔|(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)分析，具有極高的分子特異性。但是，傳統(tǒng)拉曼光譜散射強(qiáng)度較弱，易受熒光干擾，檢測(cè)靈敏度低，限制了其應(yīng)用范圍。而表面增強(qiáng)拉曼光譜（surfaceenhanced Raman spectroscopy，SERS）是利用光與金、銀等納米結(jié)構(gòu)材料相互作用產(chǎn)生很強(qiáng)的表面等離子基元共振效應(yīng)，可顯著增強(qiáng)吸附在納米結(jié)構(gòu)表面上分子的拉曼信號(hào)，以超靈敏地獲取樣品自身或拉曼探針?lè)肿拥闹讣y圖譜。通常情況下，SERS增強(qiáng)因子的平均值約為106，在等離子體間隙和尖銳突起的位置，局域增強(qiáng)因子可高達(dá)1014，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)拉曼光譜檢測(cè)靈敏度低的不足，是一種極具潛力的快速檢測(cè)技術(shù)，具有無(wú)損、快速、高靈敏度和高選擇性等優(yōu)勢(shì)。目前，SERS技術(shù)在其檢測(cè)中的應(yīng)用，主要是以抗原-抗體間的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，因此其基底制備是影響SERS信號(hào)增強(qiáng)效果的一個(gè)重要因素。基于貴金屬銀（Ag）、金（Au）的納米顆?；蚣{米陣列是常用的SERS基底，具有高增強(qiáng)、高均一性等優(yōu)點(diǎn)。Tegegne等[60]制備了涂有聚多巴胺（polydopamine，PDA）的納米銀基底，用于檢測(cè)飼料中DON含量，研究結(jié)果表明具有超薄PDA外殼的Ag NCs@PDA基底通過(guò)氫鍵和π-π堆積相互作用增強(qiáng)了DON的吸收，并提高了基底的穩(wěn)定性，SERS增強(qiáng)因子可達(dá)1.82×107，方法檢出限為0.243 pg/L。

2.2 基于色譜或質(zhì)譜的定性定量分析方法

2.2.1 高效液相色譜法

HPLC法適用于高沸點(diǎn)、不易揮發(fā)、受熱不穩(wěn)定易分解、不同極性的有機(jī)化合物的分析。鑒于DON分子的理化特性，HPLC法同樣適用于谷物、血漿、組織液等樣品基質(zhì)中的DON及其衍生物的檢測(cè)分析[61-63]。HPLC通常與紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器（ultraviolet-visible detector，UV）、二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）、熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)D）、火焰離子化檢測(cè)器或電子捕獲檢測(cè)器（electron capture detector，ECD）等相結(jié)合，以檢測(cè)和分析目標(biāo)物。HPLC-UV法是檢測(cè)DON等真菌毒素最常用的液相分析方法[64]。Klinglmayr等[65]采用HPLC-UV法在220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)小麥制品和飼料樣品中的DON，該方法檢出限和定量限分別為200 μg/kg和380 μg/kg。Rahmani等[66]基于空氣輔助分散液-液微萃取前處理技術(shù)建立了檢測(cè)大米中DON的HPLC-DAD法，該方法線性范圍為50～500 μg/kg，檢出限為23.6 μg/kg。Ok等[67]采用IAC對(duì)大米及米糠中的DON和雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）進(jìn)行凈化處理，并利用HPLC-UV法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，該方法線性關(guān)系良好，DON和NIV的定量限均小于11.09 μg/kg。Zhang Yingyue等[68]建立并優(yōu)化了同時(shí)基于DAD和FD檢測(cè)的multi-IAC-HPLC法，并對(duì)全麥粉和精致小麥粉中DON及其衍生物等9 種真菌毒素進(jìn)行分析測(cè)定，該方法的回收率為75.78%～118.24%，檢出限和定量限分別為1.5～20 μg/kg和5.0～60 μg/kg。HPLC技術(shù)具有靈敏度高、選擇性好、重復(fù)性可靠、操作自動(dòng)化、能同時(shí)對(duì)多種真菌毒素進(jìn)行定性定量分析等優(yōu)點(diǎn)，但儀器價(jià)格昴貴，待測(cè)樣品通常需要經(jīng)凈化處理后再進(jìn)系統(tǒng)分析。

2.2.2 氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

DON的沸點(diǎn)為543.88 ℃，不易汽化，因此不能直接采用GC或GC-MS法檢測(cè)，而需要先經(jīng)過(guò)衍生化處理使其沸點(diǎn)降低、熱穩(wěn)定性提高。DON化學(xué)結(jié)構(gòu)為四環(huán)倍半萜烯，其環(huán)有3 個(gè)羥基，易形成穩(wěn)定的氫鍵，不易揮發(fā)，一般選用衍生劑或酰化劑對(duì)這3 個(gè)羥基進(jìn)行甲基硅烷化或氟?；幚?。硅烷化試劑包括N,O-雙(三甲基硅基)乙酰胺、三甲基氯硅烷、N-三甲基硅咪唑、三甲基 硅基[27,69]；酰化試劑包含三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁基咪唑[70-72]。在利用GC分析DON等毒素含量時(shí)，常見(jiàn)的檢測(cè)器為ECD及質(zhì)譜檢測(cè)器。張正煒等[73]建立了一種GC-ECD法，用于分析小麥粉中DON毒素殘留，該方法 線性范圍為0.01～1.00 mg/L，最低檢測(cè)劑量為0.01 mg/kg。 王婭琴等[74]建立了SPE-GC-MS檢測(cè)醬油中DON的分析方法，DON的線性范圍為0.025～8.000 μg/mL，檢出限和定量限分別為5 ng/mL和16.67 ng/mL。Cunha等[31]采用 GC-MS/13C同位素標(biāo)記法對(duì)人體尿液中的DON、DOM-1、3-AcDON和15-AcDON進(jìn)行了分析測(cè)定，以上目標(biāo)分析物的檢出限分別為0.25、0.50、1.00 ng/mL和0.2 ng/mL。Jeleń等[75]建立了全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)小麥中的DON及其衍生物進(jìn)行分析，DON和3-AcDON的檢出限分別為25 μg/kg和50 μg/kg。GC-MS或GC-MS/MS技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于樣品需要凈化和衍生化的處理，使得該方法操作起來(lái)比較復(fù)雜。

2.2.3 液相色譜-質(zhì)譜或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法

LC-MS以LC作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)，樣品在檢測(cè)系統(tǒng)和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)的質(zhì)量分析器將離子碎片按照質(zhì)量數(shù)分開，最終檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。LC-MS或LC-MS/MS的靈敏度高、選擇性強(qiáng)，分析確證高度可靠，可同時(shí)檢測(cè)樣品中的包括DON及其衍生物在內(nèi)的多種真菌毒素。與GC-MS不同，待測(cè)樣品用LC-MS分析時(shí)不需要衍生化。電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）和大氣壓化學(xué)電離均可作為檢測(cè)DON及其衍生物分析的電離源。大多數(shù)關(guān)于DON定量分析的LC-MS方法通常選擇ESI作為電離源，但其容易受樣品基質(zhì)效應(yīng)干擾而產(chǎn)生離子抑制或增強(qiáng)現(xiàn)象[31]?；|(zhì)效應(yīng)是電離過(guò)程中樣品基質(zhì)里其他分子對(duì)目標(biāo)分析物的干擾，它會(huì)影響目標(biāo)分析物的檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確性。利用LC-MS/MS法測(cè)定DON毒素時(shí)，通過(guò)添加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（例如同位素標(biāo)記的分析物）、使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線、樣品凈化處理等手段可有效消除或降低基質(zhì)效應(yīng)。在確定流動(dòng)相方面，研究發(fā)現(xiàn)DON在甲醇溶液中具有更高的響應(yīng)值，因此通常選擇含5～10 mmol/L乙酸銨的甲醇作為有機(jī)相[30,76-77]；對(duì)于水相，通常使用含有與有機(jī)相相同揮發(fā)性鹽的超純水。Broekaert等[78]采用LC-MS/MS法檢測(cè)分析了雞和豬血漿中DON、DOM-1、3-AcDON及15-AcDON的殘留情況，4 種毒素的檢出限為0.01～0.70 ng/mL，定量限為0.1～2.0 ng/mL。吳琴燕等[79]建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法可同時(shí)檢測(cè)麥粒中的DON、3-AcDON、15-AcDON及NIV，4 種毒素檢出限為2.06～13.36 μg/L。Zhao Zhiyong等[80]建立 HPLC-MS/MS法測(cè)定飼料中DON、NIV、DOM-1、3-AcDON、15-AcDON及鐮刀菌烯酮Χ含量，并采用改進(jìn)的分散SPE法凈化樣品，以上6 種毒素的定量限范圍為5.0～13.6 μg/kg。 Stastny等[81]建立超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測(cè)分析豬的初乳和血清中DON及DOM-1的殘留情況，并采用親水親油平衡小柱凈化樣品，初乳中DON和DOM-1的檢出限分別為0.48 μg/L和0.54 μg/L，定量限分別為0.80 μg/L 和0.89 μg/L；血清中DON和DOM-1的檢出限分別為0.24 μg/L和0.36 μg/L，定量限分別為0.39 μg/L和0.60 μg/L。 LC-MS法通常要求樣品凈化后再上樣，以避免色譜柱的堵塞，但也有文獻(xiàn)報(bào)道了無(wú)需樣品凈化的LC-MS/MS法，這在同時(shí)檢測(cè)多種DON毒素時(shí)表現(xiàn)出很強(qiáng)的實(shí)用性。如Warth等[82]采用HPLC-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜法檢測(cè)人尿中的DON和DON-3-O-GlcA，并確定DON-3-O-GlcA 的定量限高于30 ng/mL，該方法不需要凈化處理。盡管LC-MS儀和LC-MS/MS儀價(jià)格昴貴，容易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，但鑒于其具有出色的靈敏度和良好可重復(fù)性，目前已成為檢測(cè)DON及其衍生物的最佳選擇之一。

3 結(jié) 語(yǔ)

DON及其衍生物的危害性和廣泛分布的特點(diǎn)會(huì)對(duì)人類健康、食品安全和國(guó)際貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。因此，在加強(qiáng)監(jiān)管的前提下，開發(fā)針對(duì)DON及其衍生物的定性定量分析方法顯得至關(guān)重要。本文綜述了當(dāng)前應(yīng)用于DON及其衍生物檢測(cè)的主要分析技術(shù)，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析，所提供的信息有助于研究人員在實(shí)際應(yīng)用中根據(jù)分析目的、樣品性質(zhì)及環(huán)境條件選擇適宜的方法。此外，隨著學(xué)科的交叉融合和各種檢測(cè)手段的發(fā)展以及檢測(cè)要求的不斷提高，DON及其衍生物的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)具有如下特點(diǎn)：1）快速檢測(cè)技術(shù)依然是現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地監(jiān)控DON及其衍生物的有效技術(shù)手段。基于免疫分析法的快速檢測(cè)技術(shù)離不開高靈敏、高特異性的抗體，因此通過(guò)研發(fā)更高水平的特異性抗體能顯著提高免疫分析法的檢測(cè)速度并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍；而針對(duì)其他快速檢測(cè)技術(shù)存在的成本較高、便攜性較差、無(wú)法精確定量等問(wèn)題，也需要對(duì)其方法進(jìn)行積極改進(jìn)，開發(fā)各種新型的、適合現(xiàn)場(chǎng)篩查的便攜式小型設(shè)備，以期滿足DON毒素的快速檢測(cè)需求。2）從檢測(cè)某種DON毒素向同時(shí)檢測(cè)多種DON毒素發(fā)展。隨著對(duì)DON衍生物研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)中DON衍生物往往與原型同時(shí)存在，有些甚至比原型毒素的毒性作用更大，如何方便、快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測(cè)出該多種毒素的種類及含量依舊是當(dāng)下和未來(lái)的研究重點(diǎn)。3）開發(fā)精準(zhǔn)高效的DON及其衍生物的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)技術(shù)。光譜檢測(cè)技術(shù)是基于DON及其衍生物污染樣品的光譜特征，對(duì)樣品中DON毒素進(jìn)行準(zhǔn)確定量，實(shí)現(xiàn)樣品的實(shí)時(shí)無(wú)損在線監(jiān)測(cè)，是DON毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。