新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架對(duì)牙周組織再生的影響?

吳世卿 溫志欣 何翠媚 劉雄 歐陽嘉杰 廖奕翔

牙周組織再生是口腔臨床治療中面臨的一個(gè)重大問題，牙周病引起的牙周軟硬組織缺失、拔牙后牙槽骨高度和寬度的減少及軟組織的萎縮、外科手術(shù)導(dǎo)致的軟硬組織缺損等，均給臨床治療帶來種種困難。傳統(tǒng)的牙周組織再生方法有牙周植骨術(shù)、引導(dǎo)組織再生術(shù)[1]。牙周植骨術(shù)是采用骨或骨的替代品等移植材料修復(fù)牙槽骨缺損，但植骨材料骨誘導(dǎo)能力低，通常被大量的結(jié)締組織覆蓋；而引導(dǎo)組織再生術(shù)是利用生物膜作為屏障阻擋牙齦上皮及結(jié)締組織長(zhǎng)入，引導(dǎo)牙周膜細(xì)胞優(yōu)先長(zhǎng)入根面，但無骨細(xì)胞誘導(dǎo)能力[2]。因此尋找一種既能誘導(dǎo)軟組織再生，亦能誘導(dǎo)骨組織再生的生物學(xué)材料用于調(diào)控牙周組織再生重建的過程，具有重要的科學(xué)價(jià)值與實(shí)際意義。前期實(shí)驗(yàn)中自主合成了新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架，并與上皮角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有較好的促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖的特性。因此，筆者提出新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架能更好地促進(jìn)人口腔源性成骨細(xì)胞和牙周成纖維細(xì)胞增殖和分化的假說。筆者擬從動(dòng)物模型層面上探討新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架調(diào)控牙周組織再生的作用，為尋找一種既能誘導(dǎo)軟組織再生，亦能誘導(dǎo)骨組織再生的生物學(xué)材料提供新線索，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 選取清潔級(jí)的SD大鼠24只，8周齡，體重200～250 g，雄性，購自廣東省實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心[SYXK（粵）2016-0073]，籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常光照，保證相對(duì)的溫度和濕度，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的過程中嚴(yán)格貫徹3R原則。DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Sigma）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thereto）；0.25%胰蛋白酶（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木素、伊紅（上海申能博彩生物技術(shù)公司）；聚己內(nèi)酯（美國(guó)Sigma）；甲基潑尼松龍（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組和建模 將24只大鼠隨機(jī)分為三組，每組8只大鼠，空白對(duì)照組（不植入任何材料）、陰性對(duì)照組（植入膠原凝膠）和實(shí)驗(yàn)組（植入新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架），經(jīng)腹部注射10%的20 mg/kg的水合氯醛麻醉大鼠，參照Botelho等[3]的研究方法建立大鼠牙周炎模型，大鼠仰臥在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使上頜磨牙充分暴露，分離牙齦到骨面，在上頜第一顆和第二顆磨牙之間置放結(jié)扎絲，確保結(jié)扎絲無松脫，結(jié)扎完成，建立大鼠牙周炎模型后，陰性對(duì)照組植入膠原凝膠，實(shí)驗(yàn)組植入新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架，空白對(duì)照組不做任何處理，并檢查結(jié)扎線是否松動(dòng)脫線，持續(xù)到術(shù)后14 d。

1.2 方法

1.2.1 micro-CT定量分析 術(shù)后2周，經(jīng)腹部注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用4%的多聚甲醛對(duì)心臟進(jìn)行灌流固定，取雙側(cè)上頜骨后，從腭中縫處分為左右兩個(gè)磨牙段及牙周組織聯(lián)合標(biāo)本，放于4%的多聚甲醛中固定。在將標(biāo)本浸沒在含有乙醇溶液的掃描管中，采用micro-CT掃描上頜第一顆和第二顆磨牙之間的牙槽區(qū)域，并使用計(jì)算機(jī)軟件分析相關(guān)參數(shù)骨礦物質(zhì)密度（BMD）、組織礦物質(zhì)密度（TMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.2.2 HE染色 將所取兩個(gè)磨牙段及牙周組織聯(lián)合標(biāo)本放入4%的多聚甲醛固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，首先放于60 ℃烤箱進(jìn)行20 min烤片，脫蠟，蘇木素染3 min，自來水沖洗3次，伊紅染1 min，自來水沖洗2次，封片，顯微鏡下觀察小鼠所取組織的病理學(xué)變化。

1.2.3 組織病理評(píng)分 采用0～3分等級(jí)對(duì)第一和第二磨牙之間的牙周組織的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。0分為未見牙槽骨和牙骨質(zhì)吸收，少量或者炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1分為牙槽骨輕度吸收，牙骨質(zhì)完整，炎癥細(xì)胞出現(xiàn)中等性浸潤(rùn)；2分為牙槽骨吸收破壞明顯，牙骨質(zhì)出現(xiàn)少量破壞，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)；3分為牙槽骨吸收嚴(yán)重，牙骨質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重的破壞，上皮全層出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 采用RIPA裂解緩沖液對(duì)蛋白進(jìn)行提取，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂乳封閉膜，在4 ℃下，添加一抗體孵育過夜，一抗IL-6（1∶1 000）、IL-1b（1∶1 000）、MCP-1（1∶1 000）進(jìn)行稀釋，然后在室溫下用二抗孵育2 h，最后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑，β-actin作內(nèi)參，檢測(cè)IL-6、IL-1b、G-CSF、MCP-1蛋白表達(dá)。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè) 采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對(duì)Runx-2、RANK、OPG和Collagen-Ⅰ水平進(jìn)行檢測(cè)，Runx-2 mRNA上游5’-GGTGAGAAACCCACCACAT-3’，下游5’-GGTGCTGATGTACCAGTT-3’；RANK mRNA上游5’-GGTGAGAAACCCACCACAT-3’，下游5’-GGTGCTGATGTACCAGTT-3’；OPGmRNA上游5’-GGACTACAGATGCACCACCATTA-3’，下游5’-TGAGCACTGTGTCCATAG -3’；Collagen-Ⅰ mRNA上游5’-CCATGUAUGUAACACGGUCC-3’，下游5’-CACAAGACAATTAGG-3’；β-actin作為內(nèi)參，引物序列為上游5’-AACCATCTATCCCATCATC-3’，下游5’-GCACAGTCCATAGCCTTACGAA-3’，反應(yīng)條件為 92 ℃，30 min；86 ℃、69 ℃，各20 s；75 ℃，10 min；循環(huán)次數(shù)為 40次，用相對(duì)定量2-ΔΔCT計(jì)算Runx-2、RANK、OPG、Collagen-ⅠmRNA水平，并計(jì)算RANK/OPG mRNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，多組資料間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組牙周骨組織再生指標(biāo)對(duì)比

micro-CT定量分析，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.05）；陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Tb.Sp明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組Tb.Sp明顯低于陰性對(duì)照組（P<0.05），見表 1。

表1 三組牙周骨組織再生指標(biāo)對(duì)比 （±s）

表1 三組牙周骨組織再生指標(biāo)對(duì)比 （±s）

組別 BMD（mm3） TMD（mm3） BV/TV（%） Tb.N（mm-1） Tb.Sp（mm） Tb.Th（mm）空白對(duì)照組（n=8） 803.46±56.59 149.76±52.51 0.09±0.02 4.98±0.13 0.26±0.06 0.07±0.02陰性對(duì)照組（n=8） 827.63±49.62 306.79±71.19 0.28±0.11 7.28±1.17 0.21±0.04 0.12±0.05實(shí)驗(yàn)組（n=8） 851.27±62.53 357.41±76.37 0.35±0.14 9.04±1.89 0.13±0.01 0.16±0.02 F值 21.693 49.561 5.878 7.927 4.964 4.129 P值 <0.001 <0.001 0.002 0.001 0.005 0.007

2.2 HE染色觀察牙周組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的組織病理學(xué)評(píng)分分別為（2.72±0.91）、（2.69±0.89）、（2.67±0.90）分，三組組織學(xué)評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.087），見圖 1。

圖1 HE染色結(jié)果 （×200）

2.3 三組炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三組炎癥相關(guān)蛋白IL-6、IL-1b和MCP-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2、圖2。

表2 三組炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （±s）

表2 三組炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （±s）

組別 IL-6 IL-1b MCP-1空白對(duì)照組（n=8） 0.36±0.02 1.03±0.04 1.27±0.05陰性對(duì)照組（n=8） 0.34±0.01 1.05±0.03 1.23±0.06實(shí)驗(yàn)組（n=8） 0.35±0.02 1.02±0.02 1.19±0.07 F值 2.773 1.984 2.543 P值 0.098 0.217 0.086

圖2 三組炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 三組骨及牙周膜改建相關(guān)因子表達(dá)比較

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Runx-2mRNA、RANK/OPG mRNA比 值、Collagen-ⅠmRNA相 對(duì)表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組Runx-2、RANK/OPG mRNA、Collagen-Ⅰ mRNA的相對(duì)表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 三組骨及牙周膜改建相關(guān)因子表達(dá)比較 （±s）

表3 三組骨及牙周膜改建相關(guān)因子表達(dá)比較 （±s）

組別 Runx-2 mRNA RANK/OPG mRNA Collagen-Ⅰ mRNA空白對(duì)照組（n=8） 1.82±0.07 4.92±0.39 1.06±0.03陰性對(duì)照組（n=8） 2.29±0.11 7.31±0.48 2.03±0.07實(shí)驗(yàn)組（n=8） 3.02±0.19 16.63±1.26 2.84±0.51 F值 5.579 12.539 4.492 P值 0.003 <0.001 0.008

3 討論

牙周病一般是指牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)相關(guān)的支持組織發(fā)生慢性的破壞，該病已經(jīng)成為牙齒缺失的主要原因[4]。到目前為止，牙周組織再生修復(fù)仍舊是國(guó)內(nèi)外口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題?？谇环N植術(shù)是常用的修復(fù)缺失牙手段，但由于在治療過程中會(huì)使牙槽骨產(chǎn)生功能性刺激喪失，進(jìn)而導(dǎo)致軟組織的萎縮和牙槽骨高度和寬度的降低，增加了種植牙植入的難度[5]。種植區(qū)軟硬組織的形態(tài)和質(zhì)量是影響種植體三維植入位點(diǎn)的遠(yuǎn)期存留的主要因素[6]。目前對(duì)于這些既有軟組織缺損又有硬組織缺損的病例治療中需同時(shí)植入軟組織移植骨替代材料，缺一不可。因此如能尋找一種既能引導(dǎo)軟組織再生、亦能引導(dǎo)骨組織及血管再生的生物學(xué)材料用于調(diào)控牙周組織再生重建的過程，對(duì)滿足口腔醫(yī)學(xué)臨床的應(yīng)用需求將具有重要的科學(xué)價(jià)值與實(shí)際意義。

靜電紡絲技術(shù)是一種獨(dú)特的納米纖維制造技術(shù)[7]，已經(jīng)在骨再生、血管再生、周圍神經(jīng)再生、皮膚再生等諸多組織再生領(lǐng)域獲得了突破和進(jìn)展，并被認(rèn)為是最有希望在組織再生領(lǐng)域取得重大成果的技術(shù)[8]。筆者前期研究的新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架，其是一種使用最先進(jìn)的電紡技術(shù)制作、具有梯度納米結(jié)構(gòu)的生物技術(shù)制作支架材料，不僅具備靜電紡絲技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，還具有獨(dú)特的創(chuàng)新之處[9]。首先，梯度納米明膠纖維結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的種植、黏附和分化；其次，聚己內(nèi)酯納米纖維三維技術(shù)增加了支架的生物相容性、耐水性和穩(wěn)定性[10]。相關(guān)研究已將牙齦角化細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞接種到新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架上，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞層數(shù)最高可達(dá)9～10層，而對(duì)照組接種到膠原凝膠上的牙齦角化細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞最多形成3層細(xì)胞，顯示出新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架有較好的促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖的特性[11-13]。也有研究將新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架植入中節(jié)段性骨缺損處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺損處軟組織再生[14-15]。借助以上思路，筆者建立了動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架促牙周組織再生的作用，為臨床上尋找一種能同時(shí)引導(dǎo)軟硬組織再生的生物學(xué)材料提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組Tb.Sp顯著低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。三組組織學(xué)評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；三組炎癥相關(guān)蛋白IL-6、IL-1b、MCP-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組Runx-2 mRNA、RANK/OPG mRNA、Collagen-Ⅰ mRNA的相對(duì)表達(dá)高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。提示新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架抑制炎癥因子的效果并不明顯，而對(duì)于骨組織再生和牙周膜改建具有一定的促進(jìn)作用。

綜上所述，新型聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架能促進(jìn)牙齦組織、牙周膜組織、骨組織再生，彌補(bǔ)臨床上生物膜僅能促進(jìn)骨組織再生或僅能促進(jìn)軟組織再生功能單一性的缺陷，對(duì)滿足口腔醫(yī)學(xué)臨床的應(yīng)用需求將具有重要的科學(xué)價(jià)值與實(shí)際意義。