植物內(nèi)生菌對蘋果樹腐爛病防治的研究進展

張永華劉巖趙興民王道亮

(1.山東省新泰市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 新泰 271200；2.山東省新泰市國有土門林場，山東 新泰 271200)

植物內(nèi)生菌(Endophyte)主要是指存在于植物各組織或器官內(nèi)，在植物整個生命或某一特定生活階段，不使其出現(xiàn)明顯被感染癥狀的一種微生物。最具代表性的有內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌3種[1]。從1886年德國科學家DeBarry首次提出“內(nèi)生菌(endophyte)”一詞,20世紀30年代人們通過食用被牲畜感染了內(nèi)生菌的草開始對內(nèi)生菌有了初步的認識，進而開始研究。隨著研究領(lǐng)域的擴大，內(nèi)生菌的生理和預(yù)防功能已被國內(nèi)外學者在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領(lǐng)域進行了探索，并逐步推廣應(yīng)用。內(nèi)生細菌作為一種生物農(nóng)藥，具有耐藥性、無害、無毒、無污染，能夠維持生態(tài)平衡等優(yōu)點，逐漸成為國內(nèi)外學者的研究熱點。

1 植物內(nèi)生菌作為資源菌的作用

1.1 固氮作用

固氮生物通常是小型原核生物，所以也被稱為固氮微生物。根據(jù)固氮生物與高等植物的關(guān)系，固氮生物可分為自養(yǎng)固氮菌、共生固氮菌和結(jié)合固氮菌。

1.2 溶磷解鉀的作用

許多微生物可以礦化有機磷或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為可溶性磷，從而促進植物對磷的吸收[2]。

1.3 鐵載體作用

鐵載體是螯合鐵的一種，由植物或微生物合成分泌產(chǎn)生。是微生物攝取鐵的低分子量化合物，幾乎分布在所有微生物中。許多植物可以吸收細菌中的鐵載體，這對植物吸收和利用鐵非常重要。這種方式也是這種細菌促進植物生長的一個方面。內(nèi)生菌通過與病原菌競爭鐵營養(yǎng)，抑制病原微生物的生長繁殖，從而發(fā)揮生物防治作用。

圖1 3種鐵載體的類型

1.4 促進植物生長

植物生長素、赤霉素、細胞分裂素等植物激素可由內(nèi)生菌產(chǎn)生，可直接促進植物生長。內(nèi)生菌通過直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)來抑制病原菌，同時通過加強植物對相關(guān)營養(yǎng)元素的吸收，與宿主體內(nèi)的病原菌爭奪生存空間和物質(zhì)來抑制病原菌的生長，從而促進植物的健康生長。除了促進植物生長外，內(nèi)生菌在防治植物病害方面也發(fā)揮著重要的作用，這也是本文將重點研究的內(nèi)容。

2 蘋果樹腐爛病的防治

蘋果腐爛病(Valsa mali Miyabe et yamada)俗稱爛皮病、臭皮病，是由無性型為Vespora的蘋果腐爛病菌(Valsa ceratosperma)的真菌對蘋果樹干造成嚴重危害的病害之一，癥狀主要為潰瘍型和死枝型。蘋果樹腐爛病的主要特征如下。

2.1 病菌的潛伏期長

病原體從木質(zhì)部侵入樹體后，通常不會立即發(fā)作，而是潛伏起來，在條件適合致病時，再從木質(zhì)部向皮層擴散。據(jù)觀察，蘋果樹腐爛病的潛伏期可長達3～4a。

2.2 感染點多

腐爛病可通過人為傷害如砍鋸、轉(zhuǎn)枝、蟲害、機械損傷、凍害等自然災(zāi)害造成的傷口感染果樹。此外，果樹的皮孔、果痕、葉痕也可以作為侵染腐爛的入口。簡而言之，腐爛病可以感染的途徑很多，足以導致每一根樹枝都被細菌感染。

2.3 田間細菌多

蘋果樹腐爛病菌的孢子可以通過氣流、雨水和昆蟲傳播，而果農(nóng)一般將清理好的病組織堆積在果園里或倒入果園旁的雜草中，不注意病菌的徹底清除，容易造成大規(guī)模感染。目前，蘋果樹腐爛仍然是一種不治之癥。

研究表明，被內(nèi)生菌感染的宿主植物具有抗逆性、抗病性、逆境性和快速生長的優(yōu)勢，較未感染的植物具有更強的生存競爭力。而且植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，可以作為生物防治的資源和新藥的來源。作為潛在的資源菌，因其獨特的優(yōu)勢，如能很好地在植物的相應(yīng)部位定居，占據(jù)有利的生態(tài)位置，不易受環(huán)境條件影響，能抵抗病原體的入侵等，在植物病害的防治中顯示出很強的應(yīng)用前景。

3 植物內(nèi)生菌對蘋果樹腐爛病防治

3.1 植物內(nèi)生細菌對蘋果樹腐爛病的抑制作用

內(nèi)生菌在其生長過程中可以產(chǎn)生抗生素、水解酶、生物堿等抗菌活性物質(zhì)，這些在植物體內(nèi)產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運的抗菌活性物質(zhì)可以直接抵抗病原菌的入侵，從而有效防治植物病害。

1992年，Kloepper首次提出內(nèi)生細菌的概念，認為內(nèi)生細菌可以在健康的植物組織中定殖，與植物本身和諧相處[3]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌不僅能產(chǎn)生與宿主植物相同的化合物，還能產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，主要包括酚類、醌類、生物堿類等，能促進植物生長，抗病蟲害。Kumara P M、Shweta S等從蘋果樹皮中篩選內(nèi)生細菌B5014，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對蘋果腐爛病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。分離自蘋果樹皮的內(nèi)生細菌B5014對蘋果樹具有良好的親和性。接種在蘋果樹上很容易被果樹接收，因此可以在果樹上長期甚至永久定殖，起到生物防治作用。

3.2 植物內(nèi)生真菌對蘋果樹腐爛病的抑制作用

內(nèi)生菌可以帶走病原菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，導致病原菌因營養(yǎng)不足、生長能力不足而生長緩慢或停止生長。在一些植物組織或器官中，內(nèi)生菌和病原菌的生態(tài)位是相同的，因此內(nèi)生菌可以通過搶占病原菌的生長空間來提高宿主植物的抗性，從而起到防治作用。因此，內(nèi)生菌利用自身優(yōu)勢占據(jù)植物中病原菌的生態(tài)位，帶走所需的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制其生長，是有效防止植物受到病原菌入侵的重要途徑之一。

目前已有利用內(nèi)生真菌防治蘋果樹腐爛病的報道。研究表明，從生防因子ND35的培養(yǎng)濾液中提取的粗酶液能強烈抑制蘋果樹腐爛病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)。薛應(yīng)鈺、李發(fā)康等[4]從健康富士蘋果樹皮中分離出13屬126株內(nèi)生真菌。通過室內(nèi)抑菌試驗和田間保護效果試驗，發(fā)現(xiàn)42株內(nèi)生真菌抑制蘋果樹腐爛病的生長。篩選出抑菌效果較好的拮抗內(nèi)生菌。不同內(nèi)生真菌的ME無菌培養(yǎng)液對蘋果樹腐爛病菌絲生長和分生孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中鏈格孢菌占87.5%，說明鏈格孢菌在防治腐爛病中起著重要作用。此外，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)也能抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲的生長。

如圖2所示，蘋果樹腐爛病菌的菌絲在抑制帶邊緣已經(jīng)明顯變細，分布不均勻，說明菌絲生長受到了明顯的抑制。如果能提前3d接種內(nèi)生細菌，其抑制作用會更明顯、更強。

圖2 內(nèi)生真菌對蘋果樹腐爛病菌的抑制情況

鏈格孢菌是一種普遍存在的真菌，主要分布在植物上，分布廣泛，少數(shù)會出現(xiàn)在有機物或土壤上。同時還有個別菌株，也是人和動物的條件致病菌。鏈格孢菌能產(chǎn)生多種毒素，在植物病害防治方面具有巨大潛力，成為植物的重要病原。

圖3 蘋果內(nèi)生鏈格孢產(chǎn)生的揮發(fā)物質(zhì)對腐爛病菌菌絲生長的抑制作用

3.3 植物內(nèi)生放線菌對蘋果樹腐爛病的抑制作用

研究證明，誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(ISR)以抵抗病原菌的感染，減少疾病的發(fā)生，是反映植物內(nèi)生菌預(yù)防效果的另一種途徑。誘導系統(tǒng)抗性(ISR)不同于傳統(tǒng)的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)，其表型與病原體誘導的SAR相似。2種ISR都能誘導對病原菌的廣譜抗性?？偟膩碚f，ISR抗性和苯酚積累與植物抗毒素水平的增加有關(guān)。最典型的內(nèi)生細菌是內(nèi)生放線菌。此外，內(nèi)生菌還可以通過增強宿主植物的抗性或促進其生長來控制疾病。一般來說，被內(nèi)生菌感染的植物比未感染的植物生長得更快。這主要是因為內(nèi)生細菌能夠加速宿主植物對養(yǎng)分的吸收，典型的表現(xiàn)為內(nèi)生固氮菌。此外，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生或促進宿主產(chǎn)生一些植物生長調(diào)節(jié)劑，如細胞分裂素、赤霉素等，從而提高植物的生長速度。

圖4 誘導系統(tǒng)抗性

植物內(nèi)生放線菌是指存在于健康植物各種組織器官中，不危害宿主植物生長的放線菌。其分布在植物的各種組織中，可以促進植物抗病、適應(yīng)逆境、吸收養(yǎng)分、維持植物體內(nèi)的微生態(tài)平衡。與其它微生物相比，植物內(nèi)生放線菌能夠在植物組織中定居，避免與土壤和根際微生物的競爭，從而具有突出的競爭優(yōu)勢；可通過在植物組織中產(chǎn)生抗生素、溶菌酶等拮抗物質(zhì)來增強植物的抗性；能與寄主植物共生固氮，既能促進植物生長，又能增加產(chǎn)量。

植物內(nèi)生放線菌在植物病害生物防治中的優(yōu)勢已引起廣泛關(guān)注。主要通過產(chǎn)生抗生素和分泌細胞壁降解酶來抑制病原菌的生長，或者通過固氮、鐵載體、信號分子等手段誘導植物產(chǎn)生抗體，從而達到控制的目的。此外，內(nèi)生放線菌還可以通過產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)劑來加速植物生長，提高植物抗病性。從灰色鏈霉菌中分離出的一個變種對蘋果樹腐爛病菌的菌絲生長有抑制作用。提取其發(fā)酵液后，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯相具有較強的抗菌活性。

薛應(yīng)鈺等[4]研究了內(nèi)生放線菌對蘋果樹腐爛病的防治效果。結(jié)果表明，7株內(nèi)生放線菌能很好地抑制病原菌分生孢子的萌發(fā)和病原菌菌絲的生長，并以Hhs.015菌株的抑制效果為例。如圖5所示，用Hhs.015菌株的無菌發(fā)酵濾液處理后，該菌株出現(xiàn)菌絲原生質(zhì)體溢出，菌絲分枝增多，頂端呈圓形，不規(guī)則彎曲。

圖5 施用菌株Hhs.015無菌發(fā)酵濾液前后蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的變化

如圖6所示，正常蘋果腐爛病菌菌株在PDA培養(yǎng)中表現(xiàn)為表面光滑、尖尖、粗細均勻、菌絲細長。Hhs.015菌株經(jīng)無菌發(fā)酵濾液處理后，菌絲原生質(zhì)體溢出，菌絲分枝增多，頂端呈圓形，不規(guī)則彎曲。

圖6 菌株Hhs.015無菌發(fā)酵濾液作用前后蘋果樹腐爛病菌菌絲生長的對比

綜上所述，內(nèi)生菌主要通過產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物和活性物質(zhì)來抑制蘋果樹腐爛病的發(fā)生，使蘋果樹腐爛病病原菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)發(fā)生畸形。

4 結(jié)語

我國幅員遼闊，植物資源豐富。內(nèi)生菌具有種類豐富、生活環(huán)境特殊的特點。此外，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)劑，誘導宿主植物產(chǎn)生抗性，抑制病原菌的生長，不僅可以防治植物病害，還具有環(huán)保安全的優(yōu)點，非常符合當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生物防治的需要。自20世紀初發(fā)現(xiàn)蘋果樹腐爛病以來，其危害性受到廣泛關(guān)注，防治和研究一直在繼續(xù)。但目前，蘋果樹腐爛病的防治主要還是以化學防治為主，仍然是一種難以根治的病害。因此，利用內(nèi)生菌控制蘋果樹腐爛在植物病理學領(lǐng)域是很有前景的。