石竹和瞿麥組織培養(yǎng)與試管開花技術(shù)研究

鄒歡歡，程明圣，黃孝風(fēng)，陳慧晶，肖 麗，張 云，鄒 娜

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

石竹（Dianthus chinensis）為石竹科石竹屬的多年生草本植物。石竹在園林綠化中，常作為1、2年生草本花卉栽培[1]，其花朵繁密，花色艷麗，常以叢栽或成片栽植的方式應(yīng)用于各種園林景觀，或作切花使用，起到美化環(huán)境及提升景觀的觀賞性的作用[2]。近年來，隨著人們生活水平和對(duì)生存環(huán)境質(zhì)量要求的提高，對(duì)石竹的需求量也越來越大，但是傳統(tǒng)的園藝栽培中，常采用扦插、分株等繁殖方法，存在品種退化和繁殖系數(shù)低的問題，難以滿足市場(chǎng)巨大的需求量。重瓣瞿麥（Dianthus superbus‘Chongban’）為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉盆景教學(xué)基地篩選培育出的的重瓣新品種，花色艷麗且花期長(zhǎng)，但無結(jié)實(shí)能力[3]。瞿麥花朵繁密，花色艷麗，作為地被植物來栽培易成活，常以叢栽或成片栽植的方式應(yīng)用于各種園林景觀，是園林綠化的重要組成部分。研究表明瞿麥具有抗菌、腎保護(hù)、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[4]。采用分株和播種繁殖方式的繁殖系數(shù)較低，難以形成瞿麥的大規(guī)模生產(chǎn)，且分株繁殖易造成病毒的積累。組織培養(yǎng)技術(shù)可有效的縮短繁殖時(shí)間，短期內(nèi)繁殖大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，在提高繁殖速度、縮短育種周期、降低成本上起到了重要作用，尤其在是一些新品種的選育、擴(kuò)繁和保持優(yōu)良品種的特性方面更顯示出優(yōu)越性[5,6]。試管開花是指通過組織培養(yǎng)的方法，使植物的開花過程在培養(yǎng)容器中完成。多數(shù)研究表明，離體條件下有助于調(diào)控植物開花的各個(gè)因素，深入研究植物開花的生理機(jī)制，以控制花期從而獲得大量成花[7]。通過分析以往人們對(duì)石竹組織培養(yǎng)的研究，發(fā)現(xiàn)石竹試管苗開花研究甚少，而且瞿麥試管開花尚未見報(bào)道。為此，本文通過對(duì)石竹和瞿麥離體培養(yǎng)技術(shù)的研究，探討石竹和瞿麥無菌苗增殖和壯苗培養(yǎng)的最佳條件，并進(jìn)一步研究不同因素對(duì)石竹和瞿麥試管苗成花的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

石竹種子和重瓣瞿麥外植體材料來自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉盆景教學(xué)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌消毒

石竹種子消毒滅菌：選取均勻飽滿的石竹種子，在自來水下沖洗浸泡30 min，之后在超凈工作臺(tái)上用濃度75 %的酒精浸泡30 s，再用濃度為0.1 %的氯化汞添加1 滴吐溫-20 滅菌8 min，無菌水沖洗4～5 次。用吸水紙吸干水分后播種在MS 培養(yǎng)基表面進(jìn)行種子萌發(fā)。

瞿麥莖段消毒滅菌：取無花苞、腋芽未萌發(fā)的幼嫩莖段帶回實(shí)驗(yàn)室，蘸洗潔精仔細(xì)刷洗枝條表面，流水下沖洗15 min。將清洗后的莖段轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用75 %酒精消毒30 s，再用含吐溫-20 質(zhì)量體積比為0.1 %的升汞溶液消毒8 min，無菌水沖洗5～6 遍，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

種子萌發(fā)形成的幼苗及由莖段誘導(dǎo)的腋芽分別接種于A2 培養(yǎng)基繼代1 次。當(dāng)無菌長(zhǎng)到2 cm 以上時(shí)，切取頂端2 cm 左右頂芽接種于附加不同濃度的6-BA 和NAA、的MS 基本培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)基的篩選。培養(yǎng)28 d 后統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)、平均高度和玻璃化率。

1.2.3 壯苗培養(yǎng)

當(dāng)增殖培養(yǎng)基上的石竹無菌苗長(zhǎng)到2.5 m 以上時(shí)，取頂端2 cm 接種到添加不同濃度的多效唑（0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L 和80 mg/L）及蔗糖（20 mg/L、40 g/L）組成的各培養(yǎng)基中進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)基的篩選。培養(yǎng)28 d 后統(tǒng)計(jì)各處理無菌苗苗高、莖粗、玻璃化率并記錄其長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.4 開花培養(yǎng)

選取莖粗壯，葉片均勻，長(zhǎng)勢(shì)較好的苗，取其頂芽，每頂芽下帶兩片葉子，接種在由不同基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度及配比、蔗糖和封口材料組成的開花培養(yǎng)基中進(jìn)行花芽誘導(dǎo)，60 d 以后統(tǒng)計(jì)開花率。開花率＝開花外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為25±1℃,光照2000 lx，光照時(shí)間為16 h/d。瞿麥外植體接種后先暗培養(yǎng)7 d，然后再置正常光照條件下培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用DPS7.05 軟件進(jìn)行方差分析和新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 不同激素及濃度對(duì)石竹和瞿麥增殖的影響

結(jié)果表明：不同因素水平對(duì)石竹增殖的高度、增殖系數(shù)、玻璃化率的影響不同（見表1）。根據(jù)調(diào)整極差R’ 判斷不同因素水平對(duì)石竹苗高影響的重要性依此為：基本培養(yǎng)基＞封口材料＞激素種類＞空白列＞6-BA 濃度； 石竹增殖系數(shù)影響的重要性依次為：基本培養(yǎng)基＞封口材料＞激素種類＞BA 濃度＞空白列；不同因素水平對(duì)石竹增殖過程中玻璃化的影響依次為：6-BA 濃度＞激素種類＞空白列＞基本培養(yǎng)基＝封口材料。其中，基本培養(yǎng)MS 對(duì)苗高和增殖系數(shù)的影響優(yōu)于1/2MS，塑料蓋優(yōu)于封口膜，0.1 mg/L的NAA 優(yōu)于等濃度的IBA，6-BA 濃度以0.5 mg/L為佳，即處理3。6-BA 濃度增大易導(dǎo)致石竹增殖過程中玻璃化苗的發(fā)生，激素種類對(duì)玻璃化也有一定的影響，相比較于IBA，NAA 更易導(dǎo)致石竹增殖培養(yǎng)過程中的玻璃化。而基本培養(yǎng)基和封口材料對(duì)石竹玻璃化影響不大。

表1 不同因素對(duì)石竹增殖影響的直觀分析表Table 1 Visual analysis table of the influence ofdifferent factors on the growth of Dianthus chinensis

方差分析結(jié)果表明（表2），基本培養(yǎng)基對(duì)石竹苗高的影響達(dá)到顯著水平，其它3 個(gè)因素6-BA 濃度、激素種類、封口材料對(duì)其增殖的影響均不顯著；就增殖系數(shù)而言，基本培養(yǎng)基和封口材料對(duì)其增殖的影響均達(dá)到極顯著水平，其它兩因素6-BA 濃度、激素種類對(duì)其增殖影響水平不顯著；就玻璃化率而言，各因素水平對(duì)石竹增殖的影響均不顯著。從表3可以看出，8 個(gè)不同處理中，苗高和增殖系數(shù)最好的都是處理3，其次是處理1、處理6 和處理7，并且與處理8 間的差異達(dá)到極顯著水平，而不同處理間玻璃化率沒有顯著差異。因此，以增殖系數(shù)為主要參考指標(biāo)，在綜合評(píng)價(jià)苗高、玻璃化率的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為石竹最佳的增殖配方為MS + 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L，用塑料蓋封口，即處理3。增殖培養(yǎng)28 d，平均苗高可達(dá)到4.2 cm，增殖系數(shù)可達(dá)到2.8 倍，且無玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。

表2 不同因素對(duì)石竹增殖影響結(jié)果的方差分析Table 2 Variance analysis of the effect of different factors on the proliferation of Dianthus chinensis

表3 影響石竹增殖的各個(gè)處理間差異顯著性檢驗(yàn)分析表Table 3 Test and analysis table for the significance of differences between treatments affecting the growth of Dianthus chinensis

2.1.2 不同因素對(duì)瞿麥增殖影響的分析

不同因素水平對(duì)瞿麥增殖影響的重要性依次為（表4）：基本培養(yǎng)基＞6-BA 濃度＞激素種類＞封口材料。從各因素不同處理來看，MS 優(yōu)于1/2MS 基本培養(yǎng)基，6-BA 濃度以0.1 mg/L 較好，苗高隨著6-BA濃度的增加呈逐漸減小趨勢(shì)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)以NAA好于IBA，不同封口材料對(duì)瞿麥增殖過程中苗高影響不大。因此瞿麥增殖過程中苗高生長(zhǎng)較佳培養(yǎng)基配方為：MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L 是最佳的配方，即處理1。從增殖系數(shù)來看，各因素水平對(duì)其增殖影響的重要性依次為：基本培養(yǎng)基＞封口材料＞6-BA濃度＞空白列＞激素種類。從各因素水平來看，MS 培養(yǎng)基對(duì)瞿麥的增殖效果優(yōu)于1/2MS，封口材料用瓶蓋較好，6-BA 濃度以0.5 mg/L 最佳，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類NAA 或IBA 對(duì)瞿麥增殖影響效果差別不大，瞿麥增殖的適宜培養(yǎng)基配方為：MS + 6-BA 0.5 mg/L+IBA（或NAA）0.1 mg/L，封口材料用瓶蓋，即處理3。從玻璃化率來判斷，各因素水平對(duì)其影響的重要性依次為：封口材料＞基本培養(yǎng)基＞6-BA 濃度＞空白列＞激素種類。從各因素水平來看，瓶蓋與封口膜相比更容易導(dǎo)致無菌苗玻璃化，MS 基本培養(yǎng)基比1/2MS 中的苗玻璃化率更多，隨著6-BA 濃度增大玻璃化率也呈增加趨勢(shì)。因此，以增殖系數(shù)為主要參考指標(biāo)，在綜合評(píng)價(jià)苗高、玻璃化率的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇瞿麥與石竹相同的增殖配方MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，用塑料蓋封口，即處理3。

表4 不同因素對(duì)瞿麥增殖影響的直觀分析表Table 4 Visual analysis table of the influence of different factors on Dianthus superbus proliferation

2.2 不同因素對(duì)石竹壯苗培養(yǎng)的影響

將通過增殖獲得的石竹無菌苗接種到不同壯苗培養(yǎng)基上，觀察苗的長(zhǎng)勢(shì)，并在28 d 后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)苗高、莖粗和玻璃化率（見表5）。結(jié)果表明：隨著多效唑濃度的增加，苗的高度呈下降趨勢(shì)，但是莖的粗度沒有明顯的變化；隨著蔗糖濃度的提高，石竹節(jié)間變短，葉片有所增大，葉色變綠舒展，莖粗沒有明顯的變化。綜合評(píng)價(jià)苗的長(zhǎng)勢(shì)和高度，認(rèn)為處理7最好。各處理均沒有出現(xiàn)玻璃化苗。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，添加40 mg/L 的多效唑和40 g/L 的蔗糖最有利于石竹的壯苗培養(yǎng)。

表5 不同因素對(duì)石竹壯苗培養(yǎng)的影響Table 5 The influence of different factors on the cultivation of strong seedlings of Dianthus chinensis

2.3 不同因素對(duì)石竹和瞿麥試管開花誘導(dǎo)的影響

將獲得的無菌苗接種到不同開花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，60 d 后統(tǒng)計(jì)各不同處理開花情況（見表6）。結(jié)果表明，各處理間的石竹無一開花，瞿麥開花率僅為11.11%～16.67%，開花率極低。

表6 不同因素對(duì)石竹和瞿麥開花誘導(dǎo)的影響Table 6 Effects of different factors on flowering induction of Dianthus chinensis and Dianthus superbus

圖1 石竹組織培養(yǎng)及試管開花誘導(dǎo)Figure 1 Dianthus chinensis s tissue culture and in vitro flowering induction

圖2 瞿麥組織培養(yǎng)及試管開花誘導(dǎo)Figure 2 Tissue culture of Dianthus superbus and in vitro flowering induction

3 討論與小結(jié)

3.1 不同激素與濃度對(duì)石竹和瞿麥增殖培養(yǎng)的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，石竹增殖的最適宜配方為MS +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 瓊脂7.0 g/L +蔗糖20 g/L，用塑料蓋封口。全營(yíng)養(yǎng)的MS 培養(yǎng)基不僅有利于石竹的長(zhǎng)高，也有利于提高增殖系數(shù)。用0.1 mg/L 的NAA 效果要優(yōu)于IBA。6-BA 的濃度對(duì)石竹的增殖效果不顯著，而且隨著濃度的提高會(huì)引起玻璃化苗的增加，這一結(jié)果與程云清的一致[8]。

瞿麥增殖最適宜的配方為MS + 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L + 瓊脂7.0 g/L + 蔗糖20 g/L。透氣膜比塑料蓋的透氣性更好，有效降低在增殖培養(yǎng)期間的玻璃化率[9]。

3.2 多效唑和蔗糖對(duì)石竹壯苗培養(yǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的多效唑可以使石竹苗矮化，葉色加深變綠等作用，并且隨著多效唑濃度的提高，石竹苗的高度降低。推測(cè)是由于多效唑能夠促進(jìn)植物葉片碳水化合物的合成，降低氮素的積累，提升碳氮比（C/N）[10]提高蔗糖的濃度也有利于石竹苗的矮化，隨著蔗糖濃度的提高，石竹苗的高度降低。因此，40 mg/L 的多效唑和40 g/L 的蔗糖最適宜石竹的壯苗培養(yǎng)。但蔗糖對(duì)植物矮化作用的生理生化機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步深入研究[11]。

3.3 石竹和瞿麥試管開花影響因素

石竹和瞿麥同為石竹科石竹屬的植物，組培過程中對(duì)培養(yǎng)基中各成分的響應(yīng)規(guī)律相似，但在本實(shí)驗(yàn)中，接種在各處理培養(yǎng)基上的石竹均未開花，且瞿麥也僅有部分開花。推測(cè)原因一方面是石竹的外植體材料為種子，比以莖段為外植體的瞿麥更難誘導(dǎo)其開花；另一方面石竹科植物種子有休眠的特征[12]，在種子萌發(fā)前沒有進(jìn)行催芽，瞿麥雖然開花，但是開花率低，后續(xù)可嘗試通過改變培養(yǎng)基中N、P、K 元素配比，或改變其他環(huán)境因素，對(duì)植物試管開花的關(guān)鍵因素及內(nèi)在調(diào)控機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究[13]。