41份木槿種質(zhì)資源的AFLP遺傳多樣性分析

竇 霄，陳俊強，董章凱，劉 紅，段正洪

(1.山東省林木種苗和花卉站，山東濟南250014；2.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東濟南250014；3.滕州市國有西崗苗圃，山東滕州277519)

木槿（Hibiscus syriacus）為錦葵科木槿屬小喬木或灌木，是我國園林綠化和庭院綠化中常用的觀賞植物，可做花籬式綠籬，孤植和叢植均可[1]。木槿開花量大，花色、花型多變，花期可由6月維持至10月，抗逆性較強，具備一定的吸附有害氣體和滯塵功能[2]。木槿種質(zhì)資源豐富，栽培歷史悠久，分布范圍廣泛。但是目前我國對木槿的繁育栽培技術(shù)和園林應(yīng)用研究較多[3-7]，對其遺傳背景、親緣關(guān)系尚未開展深入系統(tǒng)的研究。國內(nèi)方面，肖芬等[8]通過對27 個木槿品種進行ISSR-PCR 分子鑒定，聚類分析結(jié)果與形態(tài)分類和孢粉學(xué)分析的結(jié)果具有較強的一致性。趙藝璇等[9-10]使用SRAP 法擴增了39 個木槿品種的DNA 條帶，通過UPGMA 法進行聚類分析，得出了不同木槿變型及變種之間的遺傳距離較遠，不同木槿品種之間遺傳距離相對較近，木槿親緣關(guān)系遠近與木槿表型性狀之間存在一定聯(lián)系。此外，還對22 個木槿品種進行了花粉形態(tài)和分類研究，通過掃描電鏡進行形態(tài)特征及外壁紋飾觀測，然后使用R 型聚類分析和主成分分析等方法，得出木槿種內(nèi)藍紫色單瓣品種之間親緣關(guān)系相對較近，半重瓣品種之間親緣關(guān)系相對較近，白色單瓣品種之間親緣關(guān)系相對較近。國際方面，Sang Hoon Kim 等[11]用AFLP 分子標(biāo)記及形態(tài)學(xué)評價對127 個木槿品種進行分類，并分析了品種間的親緣關(guān)系。截至目前，只有少量木槿品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系比較清晰，尚有大量木槿品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系有待研究。本研究旨在對41 份木槿品種進行AFLP 分析，準(zhǔn)確了解其遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為今后進一步挖掘優(yōu)良木槿種質(zhì)、培育新優(yōu)品種和開展木槿育種研究提供有益參考和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與來源

供試材料于2020年8月取自浙江省嘉善縣、江蘇省沭陽縣和山東省臨邑縣，共計種質(zhì)41 份（見表1）。采集其健康、無病蟲害的嫩葉，于低溫下保存、運輸，并立即提取其基因組DNA。

表1 供試材料Table 1 Materials used in the experiment

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取

采用Murray 和Thompson 的CTAB 法[12]從幼葉中提取DNA。提取后的DNA 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，剩余材料-80℃超低溫保存。

1.2.2 AFLP 分析

利用北京鼎國生物技術(shù)公司生產(chǎn)的AFLP 試劑盒（EcoR I/Mse I 型）及其操作指南進行，分析41 份木槿種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

1.2.2.1 限制性酶切及連接反應(yīng)

限制性酶切及連接反應(yīng)體系為20 μL，在0.5 mL離心管中依次加入對照模板DNA 4 μL （50 ng/μL），Adapter 1 μL，EcoR I/Mse I 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，ATP (10 mM) 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，ddH2O 7 μL。將混合液在離心管中混勻離心數(shù)秒，混勻離心數(shù)秒，37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過夜。

1.2.2.2 預(yù)擴增反應(yīng)

預(yù)擴增反應(yīng)體系為25 μL，在0.2 mL 離心管中依次加入模板DNA 2 μL，Pre-ampmix 1 μL，dNTPs 1 μL，10×PCR buffer2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 18 μL。離心數(shù)秒，按照下列參數(shù)進行PCR擴增循環(huán)30 輪：94℃變性2 min；94 ℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸80 s；72℃延伸5 min。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20 倍，- 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 選擇性擴增反應(yīng)

從64 對EcoRⅠ/MseⅠ引物對中篩選出帶型清晰且多態(tài)性帶較好的引物對9 對（表2）。擴增體系為25 μL，其中預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋后的DNA 樣品2.0 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，EcoRI 引物和MseI 引物各1.0 μL （各8 種），dNTPs 0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。以上混勻，離心數(shù)秒，進行PCR 循環(huán)。第1 輪擴增參數(shù)：94℃30 s，65℃30 s，72℃80 s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，擴增12輪。接著按下列參數(shù)擴增23 輪：94℃30 s，55℃30 s，72℃80 s，最后延伸5 min。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用ABI377 自動測序儀對擴增產(chǎn)物進行電泳分離檢測，DNA 測序儀將自動保存膠圖。運用GENESCAN 3.1 分析軟件打開膠圖，對膠圖進行數(shù)據(jù)提取。運用NTSYSpc2.1 軟件，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)椤?，1”矩陣（根據(jù)記錄帶的有無，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”）。使用POPGEN 32 軟件計算標(biāo)記位點的多態(tài)性條帶（PPB）、多態(tài)信息量（PIC）和有效等位基因數(shù)(Ne)。運用NTSYSpc2.1 軟件，并根據(jù)相似性系數(shù)對41 份木槿種質(zhì)采用非加權(quán)配對類平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP 擴增結(jié)果分析

從64 對AFLP 引物組合中篩選出9 對帶型清晰穩(wěn)定、呈多態(tài)性的引物，對41 份木槿種質(zhì)的DNA進行選擇性擴增（見表2），獲得了較好的擴增效果。共擴增出733 條DNA 條帶，多態(tài)性條帶699 條，多態(tài)性位點平均95%，表明不同木槿種質(zhì)之間存在一定的遺傳差異。9 對引物中，擴增位點最多的是EACG/M-CAA 組合，為162 個；最少的是E-AGG/MCTT 組合，為114 個。擴增的多態(tài)性位點比率最高的是E-ACG/M-CAA，為100%；最低的是E-AGC/M-CAA 組合，為92%。

表2 木槿AFLP 分析結(jié)果Table 2 Results of AFLP analysis of Hibiscus syriacus

2.2 遺傳多樣性分析

Nei′s 基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon 信息指數(shù)(I)是度量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。41 份木槿種質(zhì)的Nei′s 基因多樣性指數(shù)為1.1801～1.2515，平均1.2076；Shannon 信息指數(shù)為0.1863～0.2445，平均0.2035，表明供試木槿種質(zhì)有較高的遺傳多樣性。

2.3 遺傳相似性分析

采用Nei- Li 相似系數(shù)(GS)對擴增結(jié)果進行計算，得到41 份木槿種質(zhì)的遺傳相似性矩陣。通過AFLP 檢測結(jié)果分析，41 份木槿種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.702～0.932。通過相似系數(shù)矩陣看出，在供試的木槿種質(zhì)中，其中38（雙豐4）和40（雙豐6）的遺傳相似系數(shù)最大，為0.932，且兩者均位于山東省臨邑縣，其遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近；20（紅心）與34（小木槿）的遺傳相似系數(shù)最小，為0.702，且兩者分別位于浙江省嘉善縣和江蘇省沭陽縣，其遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠。

2.4 聚類分析

在遺傳相似性系數(shù)基礎(chǔ)上，通過UPGMA 法對41 份木槿種質(zhì)進行聚類分析并繪制樹狀圖（圖1）。以相似系數(shù)0.87 為界，可將供試材料分為5 大類：第1 類僅含1 份種質(zhì)，為1（柔粉紅心重瓣），來源于浙江省嘉善縣；第2 類有29 份種質(zhì)，包括2（粉色雪紡）、3（木橋）、31（紫色絨球）、4（紫色法國酒館）、9（牡丹）、24（千絲絆）、25（雪紡）、26（中國雪紡）、28（長苞重瓣紫粉）、5 （藍莓冰沙）、15 （白花單瓣木槿）、7（雅致）、18（粉紅巨人）、8（薰衣草雪紡）、10（紫柱）、11（花葉木槿）、14（薄荷）、21（紫玉）、6（玫瑰）、16（胭脂紅）、17（單瓣紫通紫粉）、22（藍色雪紡）、23（馬麗娜）、13（阿芙羅狄）、20（紅心）、27（白花重瓣木槿）、30（夏威夷）、12（樹莓冰沙）、19（漢帛），其中25 份種質(zhì)來源于浙江省嘉善縣，4 份種質(zhì)來源于江蘇省沭陽縣；第3 類僅含1 份種質(zhì)，為29（紅色法國酒館），來源于浙江省嘉善縣；第4 類有9份種質(zhì)，包括32（紫裙）、36（雙豐2）、38（雙豐4）、40（雙豐6）、39（雙豐5）、37（雙豐3）、41（雙豐7）、35（雙豐1）、33（星光雪紡），其中7 份種質(zhì)來源于山東省臨邑縣，2 份種質(zhì)來源于江蘇省沭陽縣；第5 類僅含1 份種質(zhì)，為34（小木槿）。從聚類分析結(jié)果可以看出，41 份木槿種質(zhì)資源的分類與其地理分布位置關(guān)系較大，同一來源地的木槿種質(zhì)具有較高的遺傳相似性，親緣關(guān)系較近。

圖1 41 份木槿樣品的AFLP 分子聚類圖Figure 1 The dendrogram of 41 Hibiscus syriacus samples by clustering analysis with AFLP fingerprint

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性是生物生存、發(fā)展和進化的前提，是物種長期進化產(chǎn)生的結(jié)果[13]。本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，獲得了41 份供試木槿種質(zhì)間的遺傳變異情況及親緣關(guān)系等信息。結(jié)果顯示，41 份木槿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)(GS) 為0.702～0.932，多態(tài)性位比率、Nei 基因多樣性指數(shù)、Shannon 信息指數(shù)、遺傳多樣性的平均值分別為95%、1.2076、0.2035 和0.1282，表明41 份木槿種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。同時，通過聚類分析得出，在遺傳相似系數(shù)0.87 處可以將供試木槿種質(zhì)劃分為5 大類，且大部分來源于同一地區(qū)的木槿種質(zhì)基本處于同一類，表明從浙江省嘉善縣、江蘇省沭陽縣、山東省臨邑縣收集的木槿種質(zhì)資源，在遺傳多樣性及親緣關(guān)系方面與地理分布有著較為明顯的關(guān)系。此外，34（小木槿）與其他木槿種質(zhì)的親緣關(guān)系均較遠，是否與其他供試種質(zhì)屬于同一品種群還有待進一步試驗證明。

木槿作為我國常用的園林綠化植物，具備花期長、花色艷、抗性強等特點，其資源的種類和數(shù)量繁多，分布范圍廣泛。本研究在分子水平上研究分析了木槿種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為木槿品種選育、良種保護等方面提供了參考依據(jù)。但是本研究所收集的41 份木槿種質(zhì)資源僅涉及浙江、江蘇、山東的3 個縣，收集范圍相對集中，因此研究結(jié)果在取材范圍上有著一定的局限性。今后，還需進一步明確木槿種質(zhì)資源的分布情況，擴大資源收集范圍，并結(jié)合分子標(biāo)記、形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)等鑒定方法，更加全面、準(zhǔn)確地研究木槿種質(zhì)資源的遺傳多樣性。