硫酸鹽還原菌處理含高錸酸根離子廢水研究

吉莉，李娜，王新明，錢天偉*，張桂香，胡變芳

（1. 太原科技大學(xué) 環(huán)境與安全學(xué)院，山西 太原 030024；2. 廣東省環(huán)境資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3. 晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600）

0 引言

伴隨著世界上化石能源的日益匱乏，核電事業(yè)將會(huì)得到更大的發(fā)展。核電站的運(yùn)行每年都會(huì)產(chǎn)生大量的99Tc，其半衰期長(zhǎng)達(dá)2.1×105年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了工程屏障的有效期，一旦工程屏障失效，將在水中以高锝酸根（TcO4-）的形態(tài)存在，溶解性強(qiáng)，難以被土壤顆粒吸附，極易在地下水中遷移。如何有效地阻滯VII 價(jià)的TcO4-，降低99Tc 在土壤和地下水中的遷移性，是處置庫性能評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。

锝是過渡金屬中唯一所有同位素都是放射性的元素，其半衰期長(zhǎng)、放射性強(qiáng)，對(duì)人類生存具有潛在威脅［1］。锝與錸是同族元素，具有相似的離子半徑、核外電子排布、晶體結(jié)構(gòu)、主要氧化態(tài)以及EhpH 圖［2］，化學(xué)性質(zhì)非常接近，且錸比锝的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢(shì)低，比锝更難被還原。已有學(xué)者以錸作為锝的替代元素進(jìn)行了研究，丁慶偉等［3］使用實(shí)驗(yàn)室和計(jì)算機(jī)模型等多種不同方法進(jìn)行了锝的動(dòng)力學(xué)研究，Kim 等［4］利用錸作為锝的替代元素，研究了聚合物對(duì)锝的吸附效果，趙晶等［1］以錸作為锝的類似物研究了黃鐵礦對(duì)锝的去除效果。因此，學(xué)者們經(jīng)常用錸模擬锝的化學(xué)行為［5］，從而避免實(shí)驗(yàn)過程的污染。

硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，簡(jiǎn)稱SRB）是一類能進(jìn)行硫酸鹽異化還原反應(yīng)的厭氧菌，其代謝產(chǎn)生的S2-可以與重金屬離子反應(yīng)生成難溶的硫化物沉淀，達(dá)到去除硫酸鹽、沉淀重金屬和提高pH 的效果［6］。Lovely 等［7］提出利用微生物以氫為電子供體將地下水中可溶性六價(jià)的鈾轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的、溶解度很低的四價(jià)鈾，進(jìn)而防止其遷移擴(kuò)散的設(shè)想。Lloyd 等利用靜息態(tài)的固定化SRB 細(xì)胞在流式生物反應(yīng)器中處理Tc（VII），結(jié)果表明，SRB 具 有 處 理 含 锝 廢 水 的 應(yīng) 用 潛 力［8?9］。研 究 發(fā)現(xiàn)，SRB 對(duì)于pH 和鹽濃度具有一定的適應(yīng)性，其可耐受不同的重金屬和溶解的硫化物［10］。

有研究表明，pH、溫度、重金屬離子的初始濃度、菌接種量、碳源、反應(yīng)時(shí)間均可影響SRB 對(duì)重金屬的去除。徐建平等［11］通過響應(yīng)曲面法確定pH、溫度、重金屬離子的初始濃度是影響SRB 去除重金屬的主要因素，且最佳反應(yīng)時(shí)間為5 d。宋霄敏等［12］通過研究SRB 對(duì)鉛的去除，發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌接種量為10%（體積分?jǐn)?shù)）和20%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，鉛的去除率相差甚微，其最佳接種量應(yīng)為10%（體積分?jǐn)?shù)）。劉辰等［13］發(fā)現(xiàn)不同的碳源對(duì)SRB 的生長(zhǎng)有影響，以乳酸鈉作為碳源時(shí)，混合SRB 的生長(zhǎng)最佳、乙醇其次、甲醇次之、葡萄糖最小。本實(shí)驗(yàn)在10%（體積分?jǐn)?shù)）菌接種量以及5 d 反應(yīng)時(shí)間的條件下，采用富集培養(yǎng)基對(duì)SRB 進(jìn)行培養(yǎng)，研究了pH、培養(yǎng)溫度及初始濃度對(duì)硫酸鹽還原菌還原固定高錸酸根的影響，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，獲取最佳反應(yīng)條件，為我國長(zhǎng)壽命核素高锝酸根的安全處置提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

硫酸鹽還原菌的馴化培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)所用厭氧污泥來源于山西省山陰縣大營村地下水井挖掘過程中21 m 處的土柱，土柱置于30 ℃手套箱（Coy Labora?tory）中厭氧處理7 d。取土柱中心的土樣置于無菌水中，采用稀釋涂布法，對(duì)硫酸鹽還原菌進(jìn)行富集培養(yǎng)7 d。然后采用培養(yǎng)基進(jìn)一步馴化培養(yǎng)，每7 d更換新鮮培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)28 d 即獲得實(shí)驗(yàn)用的混合SRB 菌液。

菌懸液的制備：將馴化后的混合SRB 菌液重新培養(yǎng)24 h，待菌液變?yōu)楹谏矣谐綦u蛋氣味后，將菌液以8 000 r/min 離心10 min，棄上清，收集菌體，采用無菌水配制成菌懸液（OD600=0.1）。

培養(yǎng)基配方及分量如下：K2HPO40.50 g/L，（NH4）2SO42.50 g/L，NaHCO30.50 g/L，CaCl20.2 g/L，MgSO41.0 g/L，乳酸鈉20 mL/L，Vc 0.10 g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.50 g/L，酵母膏1.50 g/L，（NH4）2Fe（SO4）20.50 g/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

表1 單因素水平表Table 1 The levels of Single-factor experiment

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

自單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各取3 個(gè)較優(yōu)水平，利用La（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，在恒溫生物搖床上振蕩培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行ReO4-去除率的測(cè)定與分析，確定最佳還原條件。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取配置好的0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 μg/mL 的錸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5 mL，用0.22 μm 微濾膜抽濾，取抽濾完成液加入0.5 mL pH=2.4 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，0.5 mL 5%的（NH4）2SO4溶液，0.5 mL10%的酒石酸和1.5 mL 0.1%的乙基紫，加水至10.0 mL，振蕩搖勻，再加入5.0 mL 苯，于搖床振蕩10 min設(shè)置轉(zhuǎn)速300 r/min。振蕩完成后靜置15 min，有機(jī)相分層；使用移液槍吸取有機(jī)相置于離心試管中，設(shè)置轉(zhuǎn)速8 000 r/min，離心2 min，取上清液；將上清液置于石英比色皿中，在分光光度計(jì)（SP-756）上以濃度為0 的錸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的上清液作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)610 nm［14］處測(cè)定吸光度，讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 ReO4-的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Linear relationship curve between ReO4-concentration and solution absorbance

1.4 檢測(cè)方法

將處理后的樣品離心，取上清液5 mL，并重復(fù)1.3 過程，將上清液置于石英比色皿中，在分光光度計(jì)（SP-756）上以純培養(yǎng)基的上清液作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)610 nm 處測(cè)定吸光度。

1.5 分析方法

式中：η是去除率，%；C0為的初始濃度，μg/mL；Ct為反應(yīng)5 d 后的濃度，μg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由圖2（a）可知，在培養(yǎng)溫度為30 ℃、pH7.5 的條件下，當(dāng)初始濃度為10 μg/mL 時(shí)，SRB 具有較高的降解能力，去除率達(dá)到61.23%。有研究表明，SRB 的還原效率隨著重金屬濃度降低而增加，的毒性作用主要表現(xiàn)在對(duì)化學(xué)需氧量（COD）、酶的代謝活性、細(xì)菌濃度或生物膜厚度等方面的影響［15］。當(dāng)濃度增加到15 μg/mL～25 μg/mL 時(shí)，去除率開始呈下降趨勢(shì)；且隨著濃度的增加，下降趨勢(shì)更為明顯，即對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用不斷增加，這是因?yàn)檫^高的高錸酸根離子濃度引起SRB 酶的活性降低，還原效率降低，蛋白質(zhì)變性，與必需陽離子競(jìng)爭(zhēng)［16］導(dǎo)致細(xì)胞器的破裂和膜的完整性破壞，從而抑制SRB 的生長(zhǎng)和代謝［17-19］。

圖2 不同因素對(duì)SRB 去除ReO4-的影響（a）ReO4-初始濃度；（b）初始pH；（c）培養(yǎng)溫度Fig. 2 Effects of different factors on ReO4-removal by SRB.(a)initial ReO4-concentration;(b)initial pH;(c)culture temperature

王輝等［20］對(duì)Cu2+、Zn2+、Cd2+和Pb2+等重金屬離子的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的重金屬均對(duì)SRB 產(chǎn)生抑制作用，且抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，抑制作用大小依次為：Cd2+＞Cu2+＞Zn2+＞Pb2+，且當(dāng)Cu2+濃度大于10 mg/L 時(shí)，其對(duì)SRB 的毒性增強(qiáng)，影響的還原過程。姜勇等［21］對(duì)Fe2+的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Fe2+濃度從100 mg/L 增加到150 mg/L～300 mg/L 時(shí)，培養(yǎng)7 d 對(duì)的最高去除率從93%降到63%。

由圖2（b）可知，在培養(yǎng)溫度為30 ℃、ReO4-初始濃度為10 μg/mL 的條件下，SRB 菌種的最適宜pH為7.5，去除率達(dá)57.94%。當(dāng)pH 為4.5～7.5，去除率分別為22.49%、37.96%、46.47% 和57.94 %，而當(dāng)pH 增加到8.5 時(shí)，去除率下降為35.21 %。已有研究表明，pH 是影響SRB 活力的主要因素［22］，不同的pH 條件下，SRB 菌群生長(zhǎng)繁殖的速度會(huì)有差異［23］。當(dāng)pH 為5～8，pH 值的升高可促進(jìn)硫酸鹽還原菌的大量生長(zhǎng)［24］，其適宜生長(zhǎng)的pH 值為7.0～7.5，在7.16 時(shí)生長(zhǎng)最旺盛，代謝能力最強(qiáng)［25-26］。pH值可以引起細(xì)胞膜電位的變化，從而影響微生物對(duì)底物的吸收［27］。有研究表明，微酸性pH 值對(duì)硫酸鹽還原有負(fù)影響，當(dāng)pH 值低于5 時(shí)，SRB 就會(huì)失活［28］；在pH 高于9 的環(huán)境下，SRB 還原硫酸鹽產(chǎn)生的H2S 對(duì)本身產(chǎn)生抑制作用，生長(zhǎng)受限［29］，對(duì)金屬的去除率下降。同時(shí)，由于SRB 在pH 為7.5 的環(huán)境下生長(zhǎng)旺盛，導(dǎo)致大量H+被消耗，使得pH 值升高［30］，導(dǎo)致對(duì)的去除效率更低。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)條件對(duì)ReO4-去除率的影響

實(shí)驗(yàn)選用3 個(gè)影響因素：高錸酸根濃度，pH，溫度，每個(gè)因素分3 個(gè)水平［33］。 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。表3 中T表示實(shí)驗(yàn)總和指標(biāo)，為某一因素某一水平的去除率之和，其中Ti1為每個(gè)因素的第一個(gè)水平的去除率之和。表示平均實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，為某一因素某一水平的平均去除率，其中為每個(gè)因素的第一個(gè)水平的平均去除率，且根據(jù)每個(gè)因素在不同水平下的指標(biāo)，可選取其各自因素條件下的最大值為最優(yōu)水平組合A1B3C3。表中R表示極差，是同一因素的中最大值減去最小值之差，因素的極差R越大，該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響也就越顯著。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)及其結(jié)果的直觀分析Table 3 Design of the experimental scheme and the visual analysis of the results

已有研究表明，SRB 去除水中的ReO4-受多因素之間的相互影響。通過正交實(shí)驗(yàn)可知，高錸酸根的初始濃度是SRB 去除水中ReO4-的主要因素，這主要是因?yàn)榉派湫灾亟饘賹?duì)SRB 生物膜有一定的毒害作用，影響了硫酸鹽還原菌的生物代謝［34］，且隨著濃度的升高，SRB 的代謝活性受到抑制，ReO4-的去除率降低。當(dāng)pH 接近中性時(shí)，SRB 的酶活性不斷增強(qiáng)，ReO4-的去除率增強(qiáng)［35］，且大多數(shù)硫酸鹽還原菌是中溫菌，最適宜生長(zhǎng)溫度為30 ℃～35 ℃［20］。

本文研究結(jié)果顯示，高錸酸根的初始濃度對(duì)SRB 還原的影響較大，其次是培養(yǎng)溫度的影響，最后是溶液的初始pH。當(dāng)初始濃度為5 μg/mL，pH為7.5，溫度為35 ℃時(shí)，高錸酸根的去除效果最好，可達(dá)64.21%。

3 結(jié)論

（1）利用硫酸鹽還原菌可以對(duì)高錸酸根具有一定的去除效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高錸酸根的初始濃度是影響去除效率的主要因素，其次是溫度以及pH對(duì)其的影響。

（2）在單因素實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)高錸酸根初始濃度為10 μg/mL、pH 為7.5、溫度為35 ℃時(shí)，硫酸鹽還原菌對(duì)高錸酸根的去除效果最好，去除率可達(dá)63.01%。

（3）在正交實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)高錸酸根初始濃度為5 μg/mL、pH 為7.5、溫度為35 ℃時(shí)，硫酸鹽還原菌對(duì)高錸酸根的去除效果最好，去除率可達(dá)64.21%。

由于放射性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)的局限性，實(shí)驗(yàn)中以錸替代锝，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于高锝酸根的處理及對(duì)土壤和地下水環(huán)境條件下的核廢物處置具有一定的參考價(jià)值。