• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人參實(shí)時(shí)熒光定量PCR 快速鑒別方法

    2021-08-31 06:10:42李忠華楊寶馬寧岳靜怡郝娟趙麗紅
    關(guān)鍵詞:西洋參人參探針

    李忠華,楊寶,馬寧,岳靜怡,郝娟,趙麗紅

    (1. 太原市食品藥品檢驗(yàn)所,山西 太原 030031;2. 山西國(guó)新晉藥集團(tuán)有限公司,山西 太原 030006)

    0 引言

    人參為五加科植物人參(Panax ginseng)的干燥根和根莖。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效[1-3]。目前,人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛,人參市場(chǎng)除正品外,尚有代用品、偽品、混淆品,以假亂真的現(xiàn)象屢屢發(fā)生,人參飲片市場(chǎng)情況尤其嚴(yán)重,給藥用市場(chǎng)管理帶來(lái)極為不利的影響[4]。因此,急需一種能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別人參的方法,從而確保人參的臨床療效,這對(duì)于藥品、食品、保健品的質(zhì)量保障具有十分重要的意義。

    DNA 分子鑒定技術(shù)因其準(zhǔn)確性、客觀性,在中藥材鑒定中的應(yīng)用越來(lái)越受到人們重視。Shaw 等采用RAPD 法明顯地區(qū)分開(kāi)人參屬的3 種藥材及4種偽品[5],AP-PCR、PCR-SSCP 法也被應(yīng)用在人參屬藥材的鑒定中[6-7]。崔光紅等利用多重等位基因特異PCR 鑒別人參、西洋參[8];王雪松等采用PCRRFLP 鑒定人參真?zhèn)危?];徐鳳嬌等設(shè)計(jì)3 條引物多重PCR 方法鑒定人參和西洋參[10],上述三種方法均需要擴(kuò)增后電泳,所需檢測(cè)設(shè)備多,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),電泳毒性大。侯雙利等基于β-actin 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 鑒別人參真?zhèn)?。黃林杰等運(yùn)用qPCR 技術(shù)對(duì)蘄蛇、浙貝母進(jìn)行了鑒別研究,該方法采用SYBR Green I 染料,染料毒性大,該方法較Taqman 探針?lè)ㄌ禺愋圆?,且人參鑒別還需經(jīng)溶解曲線確定是否為目的產(chǎn)物,檢驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)[11-12];黃永輝等建立了qPCR 技術(shù)鑒別西洋參的方法[13];吳迪等使用qPCR技術(shù)準(zhǔn)確地鑒別了紫河車摻偽品中的豬、牛、羊物種[14]。因此從分子生物學(xué)準(zhǔn)確、快速鑒別中藥材的真?zhèn)纬蔀檠芯繜狳c(diǎn)。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)是在定性PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù),具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、無(wú)污染等特點(diǎn),已被廣泛用于基因的表達(dá)分析。本研究基于人參ITS 序列的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,并引入了Taq?Man 熒光探針,它是一種寡核苷酸探針,其5′端攜帶熒光基團(tuán),如FAM、HEX 等,3′端攜帶淬滅基團(tuán),如TAMRA、BHQ 等,在探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR 擴(kuò)增時(shí),TaqMan 酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR 產(chǎn)物形成完全同步。此方法不僅實(shí)現(xiàn)了人參的快速鑒別,還能區(qū)分人參和替代品及仿冒品,而且可以對(duì)人參樣品進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定,大大提高了人參鑒別的準(zhǔn)確度和靈敏度,為規(guī)范人參的市場(chǎng)管理提供了技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    香港力康Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī);eppen?dorf 微量核酸分析儀;美國(guó)熱電ABI7500fast 熒光定量PCR 儀;BIO-RAD C1000 TOUCH 梯 度PCR儀;Power Pac Basic 電泳儀;美國(guó)伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng);TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0(Tkara,Cat#9765);上海生工生物公司合成的引物、探針;TaqMan?Fast Uni?versal PCR Master Mix(2X)(ABI,NO.4366072)。

    共收集人參藥材及其易混偽品11 個(gè)物種36 份樣,樣品產(chǎn)地及來(lái)源于河北安國(guó)、安徽亳州、廣西玉林、吉林通化及太原市藥店醫(yī)院和生產(chǎn)企業(yè)等地。樣品經(jīng)山西省食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師崔宇宏鑒定,保存于太原市食品藥品檢驗(yàn)所詳見(jiàn)表1-表2。

    表1 人參樣品信息Table 1 Sample information of Panax ginseng

    1.2 方法

    1.2.1 樣品DNA 提取

    為了避免污染,樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛?,晾干,干品用球磨儀粉碎成細(xì)粉狀,鮮品用潔凈的剪刀剪碎,混勻,稱取20 mg 置于滅菌的2 mL 離心管中。用Tkara 提取試劑盒提取樣本DNA,用核酸分析儀測(cè)定DNA的純度及濃度,將OD260/OD280在1.7~1.9 之間,且濃度達(dá)到10 ng/μL~100 ng/μL的DNA 溶液作為模板DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 樣品DNA 質(zhì)量確定

    按照1.2.1 方法提取人參對(duì)照藥材(121591-201602)、人參、人參葉及其他中藥材樣品(見(jiàn)表2)共計(jì)13 個(gè)樣品DNA,水作為空白對(duì)照,以13 個(gè)樣品的DNA 為模板,使用通用引物

    表2 其他中藥材樣品信息Table 2 Sample information of the other Chinese herbal medicine

    ITS5F: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA?CAAGG-3′,

    ITS4R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATAT?GC-3′[15]

    進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,40 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,觀察實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。

    1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

    引物的設(shè)計(jì):通過(guò)查閱文獻(xiàn)后獲得人參、西洋參及其他常見(jiàn)近源物種序列,首先用Snapgene 軟件比對(duì)出保守序列,再經(jīng)過(guò)Oligov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast,設(shè)計(jì)出能夠用于人參真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針,由上海生工生物公司合成。

    正 向 引 物:5′-AGTTGCGCCCGAAGCCAT?TA-3′;

    反 向 引 物 : 5′-ATCACTCCTTTGC?GGGAGTCGA-3′;

    探針:FAM5′-CTATTACCGGAGGGCACA?GA-3′TAMRA。

    擴(kuò)增反應(yīng)體系配制如表3。反應(yīng)條件為:50 ℃2 min;95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,40 個(gè)循環(huán)。

    表3 反應(yīng)體系配制表Table 3 Preparation table of reaction system

    1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

    將1.2.2 提取的人參樣品和其他樣品的DNA作為模板。按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增,以水作為空白對(duì)照,驗(yàn)證引物和探針對(duì)人參樣品擴(kuò)增的特異性。

    1.2.5 樣品覆蓋度實(shí)驗(yàn)

    以表1 中34 批人參DNA 為模板,按照1.2.3 進(jìn)行擴(kuò)增,以水作為空白對(duì)照,進(jìn)行覆蓋度試驗(yàn)。

    1.2.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

    將100 ng 的人參DNA 模板10 倍遞減稀釋,稀釋至10-5,每個(gè)梯度做4 個(gè)平行實(shí)驗(yàn),按照1.2.3 中反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增,測(cè)試該方法的靈敏度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 特異性實(shí)驗(yàn)樣品ITS 片段擴(kuò)增結(jié)果

    13 個(gè)樣品DNA 擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均得到700 bp 左右ITS 片段(圖1),說(shuō)明13 個(gè)樣品均能獲得到高質(zhì)量的DNA。

    圖1 ITS 片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis pattern of ITS fragment amplified products

    M、marker 1、人參對(duì)照藥材2、人參3、人參葉4、西洋參5、黃芪6、三七7、苦參8、太子參9、玄參、10、桔 梗11、沙 參12、丹 參 13、黨 參K、空 白 對(duì) 照(ddH2O)

    2.2 特異性引物與探針序列

    中藥基源、近源物種和偽品DNA 序列完全的比較研究是中藥DNA 分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)中引物設(shè)計(jì)是否科學(xué)的關(guān)鍵[16]。通過(guò)對(duì)人參、西洋參、三七常見(jiàn)近源物種和偽品序列檢索NCBI 的數(shù)據(jù)庫(kù),首先用Snapgene 軟件比對(duì)出保守序列,再經(jīng)過(guò)Oli?gov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast,設(shè)計(jì)出能夠用于人參真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針(見(jiàn)圖2),探針序列將測(cè)序后獲得的發(fā)現(xiàn)所有人參與西洋參的5.8S 和ITS2 片段上在位點(diǎn)116、127 處都有2 個(gè)堿基的差異,并且所有的人參5.8S 和ITS2 片段上位點(diǎn)116 均為堿基“C”,位點(diǎn)127 均為堿基“T”,而所有西洋參5.8S 和ITS2 片段上位點(diǎn)116 均為堿基“T”,位點(diǎn)127 均為堿基“C”。比對(duì)結(jié)果同時(shí)顯示人參與三七在5.8S 和ITS2 片段在112、118、127、130 處有4 個(gè)堿基的差異,更容易區(qū)別?;谝陨喜町?,設(shè)計(jì)人參檢測(cè)特異性探針。

    圖2 人參、西洋參和三七5.8S 和ITS2 片段上序列的SNP 位點(diǎn)特征Fig. 2 Characteristics of SNP loci on 5.8S and ITS2 fragments of Panax ginseng,P. quinquefolium and P. notoginseng

    2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

    圖3 為空白對(duì)照無(wú)FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線;陰性對(duì)照非人參類樣品無(wú)明顯的FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,Ct 值均大于35;陽(yáng)性對(duì)照人參對(duì)照藥材有FAM 熒光信號(hào)檢出,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct值小于35 實(shí)驗(yàn)有效。人參、人參葉樣品在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)有FAM 熒光信號(hào)檢出,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct值小于35。

    圖3 人參特異性擴(kuò)增圖譜Fig. 3 Specific amplification map of P. ginseng

    2.4 樣品覆蓋度實(shí)驗(yàn)

    圖4(A)為人參對(duì)照藥材和20 批人參樣品擴(kuò)增結(jié)果,圖4(B)為1 批紅參、10 批人參粉、2 批人參配方顆粒樣品擴(kuò)增結(jié)果,由結(jié)果可知,34 批樣品在40個(gè)循環(huán)中均有明顯的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,Ct值均小于35。所以此方法適用于人參藥材、飲片、粉、配方顆粒和紅參的鑒別。

    圖4 樣品擴(kuò)增圖譜Fig. 4 Amplification map of sample

    2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

    圖5 為樣品在稀釋度10-5~100時(shí),Ct值均<35,且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng),擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均<3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct值作圖,其線性關(guān)系如圖6 所示,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.993,線性方程為y=-3.99×lgx+16.021,線性范圍為0.001 ng~100 ng,即1×10-3ng/反應(yīng)~100 ng/反應(yīng),該方法具有良好的線性相關(guān)度。本方法靈敏度高達(dá)1×10-3ng/反應(yīng)。

    圖5 人參樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜Fig. 5 Sensitivity amplification map of P. ginseng sample

    圖6 人參樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve of sensitivity amplification of P.ginseng sample

    3 討論

    人參質(zhì)量鑒定方法很多,但有其局限性和專屬性。傳統(tǒng)鑒別方法往往是通過(guò)外觀性狀,如眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等,必要時(shí)借助顯微觀察和薄層鑒別,這種鑒別方式對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高,而且存在主觀差別,不適用于快速、準(zhǔn)確、廣泛的推廣。目前光譜法也用于人參的鑒別,且不破壞樣品,但必須由經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)圖譜進(jìn)行解析[17-18]。而高效液相色譜法操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)分析成本較高,且近緣品指標(biāo)成分相近較難確證[19]。雙反應(yīng)體系測(cè)定3 種樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜、基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法近幾年也運(yùn)用于藥材和中成藥的質(zhì)量控制[20-21]?,F(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)2015 年版中國(guó)藥典首次采用PCR-RFLP 方法鑒別川貝母、PCR 方法鑒別烏梢蛇和蘄蛇及金錢白花蛇,也首次制定了中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則,這也是中國(guó)中藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)劃時(shí)代邁向分子時(shí)代。

    ITS 作為真核生物核糖體DNA 的非編碼區(qū),承受的選擇壓力較小,物種間變異較大,遺傳信息較豐富,而且長(zhǎng)度適宜,有利于后續(xù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),所以ITS 分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定。本文依據(jù)中國(guó)藥典2015 年版四部[22]和陳士林對(duì)中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[23]、基于ITS 分子標(biāo)記,設(shè)計(jì)了特異性鑒別人參的引物和TaqMan 探針,在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)人參對(duì)照藥材、人參藥材飲片、人參粉、人參配方顆粒、人參葉、紅參有熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,其他非人參樣品無(wú)熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,整個(gè)實(shí)驗(yàn)2 h~3 h 左右用時(shí)較短;靈敏度較高,達(dá)1×10-3ng/反應(yīng);整個(gè)過(guò)程閉管操作,減小了出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率,同時(shí)避免了電泳時(shí)熒光染料對(duì)身體及環(huán)境造成損害的可能;人工操作較少,業(yè)務(wù)不熟練的檢驗(yàn)人員也可快速掌握,與形態(tài)學(xué)生藥鑒定結(jié)果完全吻合,也驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法鑒別人參真?zhèn)蔚目煽啃院头€(wěn)定性。

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)建立的引物和TaqMan 探針與模板的特異性PCR 擴(kuò)增可有效鑒別人參,也可有效區(qū)分混淆品和代用品,并且完全閉管檢測(cè),無(wú)須PCR 后處理,避免了交叉污染和假陽(yáng)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由儀器通過(guò)數(shù)字方式給出,較為準(zhǔn)確,減小了檢驗(yàn)人員判讀時(shí)的主觀誤差,而且可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量;具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、易掌握、便利等特點(diǎn),作為人參鑒別的新技術(shù),可以在實(shí)際應(yīng)用中推廣。

    猜你喜歡
    西洋參人參探針
    水中人參話鰍魚
    “參”得人心的文登西洋參
    金橋(2020年7期)2020-08-13 03:07:02
    益氣養(yǎng)陰西洋參
    清爽可口的“水中人參”
    海峽姐妹(2019年8期)2019-09-03 01:01:04
    西洋參的前世 今生
    胡蘿卜為什么被稱為“小人參”
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    吃人參不如睡五更
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    国产单亲对白刺激| 亚洲av国产av综合av卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 大香蕉久久成人网| 国产黄频视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 国产一区二区三区综合在线观看| av欧美777| 无遮挡黄片免费观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 91老司机精品| 国产精品一区二区免费欧美| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 俄罗斯特黄特色一大片| 女人久久www免费人成看片| 90打野战视频偷拍视频| 十八禁网站免费在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色老头精品视频在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲成人手机| 脱女人内裤的视频| 日本av手机在线免费观看| av国产精品久久久久影院| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 看免费av毛片| 国产精品电影一区二区三区 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 两人在一起打扑克的视频| 18禁美女被吸乳视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品福利永久在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲国产av影院在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 在线av久久热| 亚洲精品乱久久久久久| 国产单亲对白刺激| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 老司机福利观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久午夜综合久久蜜桃| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日本av手机在线免费观看| 脱女人内裤的视频| 99国产精品99久久久久| 丰满少妇做爰视频| 老司机亚洲免费影院| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 九色亚洲精品在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美日韩精品网址| 少妇 在线观看| 国产视频一区二区在线看| 在线观看66精品国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲精品国产区一区二| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产亚洲精品第一综合不卡| www日本在线高清视频| 无限看片的www在线观看| 免费av中文字幕在线| 中文字幕最新亚洲高清| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲中文日韩欧美视频| 热re99久久国产66热| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲专区字幕在线| 精品福利观看| 999精品在线视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 涩涩av久久男人的天堂| 精品一区二区三卡| 一进一出好大好爽视频| 国产在线免费精品| 露出奶头的视频| 午夜福利免费观看在线| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久亚洲真实| 国产熟女午夜一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品 欧美亚洲| 久久影院123| 狂野欧美激情性xxxx| 人人妻人人澡人人看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区 | 99在线人妻在线中文字幕 | 国产不卡一卡二| 人妻 亚洲 视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美精品一区二区大全| 麻豆国产av国片精品| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 中文字幕高清在线视频| 手机成人av网站| 水蜜桃什么品种好| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲成人免费av在线播放| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 丰满少妇做爰视频| 色老头精品视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 老司机靠b影院| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美午夜高清在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久国产精品麻豆| 最近最新中文字幕大全免费视频| 最新的欧美精品一区二区| 99久久国产精品久久久| √禁漫天堂资源中文www| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲精品国产区一区二| www日本在线高清视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品 欧美亚洲| av天堂久久9| 窝窝影院91人妻| 99国产精品一区二区三区| 欧美成人午夜精品| 自线自在国产av| 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产精品一区二区免费欧美| 丰满少妇做爰视频| 午夜两性在线视频| 国产精品影院久久| av在线播放免费不卡| 国产午夜精品久久久久久| 满18在线观看网站| 亚洲五月婷婷丁香| 高清av免费在线| 丁香六月欧美| 丰满少妇做爰视频| 国产日韩欧美视频二区| 午夜视频精品福利| 天天影视国产精品| 日韩三级视频一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 国产高清videossex| 亚洲情色 制服丝袜| 热99国产精品久久久久久7| 午夜两性在线视频| 一个人免费看片子| 精品一区二区三卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 成年人免费黄色播放视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 久久香蕉激情| 少妇的丰满在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲成人手机| 9热在线视频观看99| 纯流量卡能插随身wifi吗| 极品少妇高潮喷水抽搐| 黄片小视频在线播放| 18禁美女被吸乳视频| 久久久国产成人免费| 老司机福利观看| 国产av国产精品国产| av电影中文网址| 在线观看www视频免费| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品国产av在线观看| 久久中文字幕一级| 久久九九热精品免费| 亚洲综合色网址| 99久久99久久久精品蜜桃| 成人特级黄色片久久久久久久 | 黄片小视频在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 久9热在线精品视频| 黄色丝袜av网址大全| 成人精品一区二区免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲成人免费av在线播放| 老司机影院毛片| 69av精品久久久久久 | 9色porny在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 蜜桃国产av成人99| 91字幕亚洲| 国产av一区二区精品久久| 啦啦啦 在线观看视频| cao死你这个sao货| 久9热在线精品视频| 婷婷丁香在线五月| 人人澡人人妻人| 丰满少妇做爰视频| 蜜桃国产av成人99| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 精品视频人人做人人爽| 午夜福利,免费看| 在线看a的网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品一区二区在线不卡| 成年版毛片免费区| 国产精品影院久久| 宅男免费午夜| 女性生殖器流出的白浆| 国产黄色免费在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 搡老乐熟女国产| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲成人国产一区在线观看| videosex国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久国产成人免费| 日韩中文字幕视频在线看片| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 极品人妻少妇av视频| 国产片内射在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品 欧美亚洲| 丝袜美足系列| 飞空精品影院首页| 欧美黑人精品巨大| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人影院久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一二三四社区在线视频社区8| cao死你这个sao货| 日韩大片免费观看网站| 高清在线国产一区| 女性被躁到高潮视频| tube8黄色片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 最黄视频免费看| 一级毛片精品| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产在线一区二区三区精| 欧美激情 高清一区二区三区| cao死你这个sao货| 少妇的丰满在线观看| 脱女人内裤的视频| 亚洲专区国产一区二区| 国产高清激情床上av| av网站免费在线观看视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 老司机亚洲免费影院| 日韩成人在线观看一区二区三区| videosex国产| 久久久国产成人免费| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲中文av在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品免费大片| 亚洲色图av天堂| 1024香蕉在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲视频免费观看视频| 丝袜人妻中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一级,二级,三级黄色视频| www.精华液| 日韩一区二区三区影片| 日韩欧美三级三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| a级片在线免费高清观看视频| 交换朋友夫妻互换小说| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品国产高清国产av | 极品少妇高潮喷水抽搐| 啦啦啦 在线观看视频| 久久久国产成人免费| 国产成人av激情在线播放| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品美女久久av网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产亚洲精品一区二区www | 国产精品久久久av美女十八| 国产有黄有色有爽视频| 国产单亲对白刺激| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久久国内视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 成人av一区二区三区在线看| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 五月天丁香电影| 亚洲视频免费观看视频| 久9热在线精品视频| netflix在线观看网站| 丁香欧美五月| 十八禁人妻一区二区| 国产成人av激情在线播放| 国产男靠女视频免费网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜激情久久久久久久| 动漫黄色视频在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美日韩精品网址| 日韩欧美三级三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 免费看a级黄色片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 中文字幕人妻熟女乱码| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品国产区一区二| 日韩视频一区二区在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久av网站| 操美女的视频在线观看| 老司机亚洲免费影院| 国产主播在线观看一区二区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 青草久久国产| 在线观看免费高清a一片| 午夜福利乱码中文字幕| 久9热在线精品视频| 成人永久免费在线观看视频 | 国产男女内射视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久国产精品麻豆| 高清av免费在线| 少妇 在线观看| 99在线人妻在线中文字幕 | 欧美成狂野欧美在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产视频一区二区在线看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日本a在线网址| 久久午夜综合久久蜜桃| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av日韩在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天天影视国产精品| 一区二区三区精品91| 男男h啪啪无遮挡| 久热这里只有精品99| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| aaaaa片日本免费| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产精品欧美亚洲77777| 中文字幕制服av| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 99国产精品一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 老司机亚洲免费影院| 亚洲精品美女久久av网站| 99久久人妻综合| 无限看片的www在线观看| 久热这里只有精品99| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜福利,免费看| 十分钟在线观看高清视频www| 91精品国产国语对白视频| 99re在线观看精品视频| 精品国产一区二区久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产精品久久久人人做人人爽| 色婷婷av一区二区三区视频| 9热在线视频观看99| 五月开心婷婷网| 多毛熟女@视频| av线在线观看网站| 中亚洲国语对白在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 老司机在亚洲福利影院| 国产亚洲欧美在线一区二区| www.熟女人妻精品国产| 无遮挡黄片免费观看| 成人手机av| 国产成+人综合+亚洲专区| 日本黄色日本黄色录像| 老司机福利观看| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆av在线久日| 一本综合久久免费| 亚洲久久久国产精品| 久久久久视频综合| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品偷伦视频观看了| 757午夜福利合集在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 91麻豆av在线| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人精品久久二区二区91| 日日爽夜夜爽网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利在线观看吧| 国产在视频线精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产片内射在线| 国产在线观看jvid| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 老司机在亚洲福利影院| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲美女黄片视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲三区欧美一区| 一级片免费观看大全| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产一区二区三区综合在线观看| av一本久久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产国语露脸激情在线看| 欧美在线一区亚洲| 国产精品电影一区二区三区 | 国产精品国产av在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品亚洲一级av第二区| 日本a在线网址| 美国免费a级毛片| 捣出白浆h1v1| 欧美久久黑人一区二区| 精品一区二区三卡| 国产区一区二久久| 亚洲精品在线观看二区| 制服诱惑二区| 亚洲三区欧美一区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 成人精品一区二区免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机午夜福利在线观看视频 | 欧美激情 高清一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久国产欧美日韩av| 99香蕉大伊视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| cao死你这个sao货| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产成人影院久久av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 成年人免费黄色播放视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 男女午夜视频在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 999久久久国产精品视频| 一区在线观看完整版| 女同久久另类99精品国产91| 一级,二级,三级黄色视频| 一本大道久久a久久精品| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲午夜理论影院| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲色图综合在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 最新美女视频免费是黄的| 欧美变态另类bdsm刘玥| 黄色丝袜av网址大全| 人妻 亚洲 视频| 亚洲综合色网址| 久久狼人影院| 人妻久久中文字幕网| 丝袜喷水一区| 性少妇av在线| 久久久国产欧美日韩av| 国产成人免费观看mmmm| 国产男靠女视频免费网站| 国产麻豆69| 日本五十路高清| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美+亚洲+日韩+国产| 极品人妻少妇av视频| 日本五十路高清| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品在线观看二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲全国av大片| 精品熟女少妇八av免费久了| 悠悠久久av| 美女主播在线视频| 老司机靠b影院| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 波多野结衣一区麻豆| 蜜桃国产av成人99| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 老汉色∧v一级毛片| 99久久国产精品久久久| 嫩草影视91久久| 精品久久久久久电影网| av天堂在线播放| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 精品国产乱码久久久久久男人| 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一本大道久久a久久精品| 51午夜福利影视在线观看| 精品久久久精品久久久| 欧美激情高清一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 国产成人精品久久二区二区91| 激情在线观看视频在线高清 | 久久亚洲真实| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 青草久久国产| 久久久久久久国产电影| 三级毛片av免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 成人国语在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久国产一区二区| 在线观看免费视频网站a站| 一级片'在线观看视频| 热99久久久久精品小说推荐| 制服人妻中文乱码| 日韩欧美三级三区| 日日夜夜操网爽| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久人妻熟女aⅴ| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产有黄有色有爽视频| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品 国内视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 麻豆国产av国片精品| 十八禁高潮呻吟视频| 91麻豆av在线| 久久久精品免费免费高清| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲中文av在线| 国产亚洲精品一区二区www | 纵有疾风起免费观看全集完整版|