人參實(shí)時(shí)熒光定量PCR 快速鑒別方法

李忠華，楊寶，馬寧，岳靜怡，郝娟，趙麗紅

（1. 太原市食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030031；2. 山西國(guó)新晉藥集團(tuán)有限公司，山西 太原 030006）

0 引言

人參為五加科植物人參（Panax ginseng）的干燥根和根莖。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效［1-3］。目前，人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛，人參市場(chǎng)除正品外，尚有代用品、偽品、混淆品，以假亂真的現(xiàn)象屢屢發(fā)生，人參飲片市場(chǎng)情況尤其嚴(yán)重，給藥用市場(chǎng)管理帶來(lái)極為不利的影響［4］。因此，急需一種能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別人參的方法，從而確保人參的臨床療效，這對(duì)于藥品、食品、保健品的質(zhì)量保障具有十分重要的意義。

DNA 分子鑒定技術(shù)因其準(zhǔn)確性、客觀性，在中藥材鑒定中的應(yīng)用越來(lái)越受到人們重視。Shaw 等采用RAPD 法明顯地區(qū)分開(kāi)人參屬的3 種藥材及4種偽品［5］，AP-PCR、PCR-SSCP 法也被應(yīng)用在人參屬藥材的鑒定中［6-7］。崔光紅等利用多重等位基因特異PCR 鑒別人參、西洋參［8］；王雪松等采用PCRRFLP 鑒定人參真?zhèn)危?］；徐鳳嬌等設(shè)計(jì)3 條引物多重PCR 方法鑒定人參和西洋參［10］，上述三種方法均需要擴(kuò)增后電泳，所需檢測(cè)設(shè)備多，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，電泳毒性大。侯雙利等基于β-actin 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 鑒別人參真?zhèn)?。黃林杰等運(yùn)用qPCR 技術(shù)對(duì)蘄蛇、浙貝母進(jìn)行了鑒別研究，該方法采用SYBR Green I 染料，染料毒性大，該方法較Taqman 探針?lè)ㄌ禺愋圆?，且人參鑒別還需經(jīng)溶解曲線確定是否為目的產(chǎn)物，檢驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)［11-12］；黃永輝等建立了qPCR 技術(shù)鑒別西洋參的方法［13］；吳迪等使用qPCR技術(shù)準(zhǔn)確地鑒別了紫河車摻偽品中的豬、牛、羊物種［14］。因此從分子生物學(xué)準(zhǔn)確、快速鑒別中藥材的真?zhèn)纬蔀檠芯繜狳c(diǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是在定性PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、無(wú)污染等特點(diǎn)，已被廣泛用于基因的表達(dá)分析。本研究基于人參ITS 序列的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并引入了Taq?Man 熒光探針，它是一種寡核苷酸探針，其5′端攜帶熒光基團(tuán)，如FAM、HEX 等，3′端攜帶淬滅基團(tuán)，如TAMRA、BHQ 等，在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR 擴(kuò)增時(shí)，TaqMan 酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR 產(chǎn)物形成完全同步。此方法不僅實(shí)現(xiàn)了人參的快速鑒別，還能區(qū)分人參和替代品及仿冒品，而且可以對(duì)人參樣品進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定，大大提高了人參鑒別的準(zhǔn)確度和靈敏度，為規(guī)范人參的市場(chǎng)管理提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

香港力康Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī)；eppen?dorf 微量核酸分析儀；美國(guó)熱電ABI7500fast 熒光定量PCR 儀；BIO-RAD C1000 TOUCH 梯 度PCR儀；Power Pac Basic 電泳儀；美國(guó)伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng)；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Tkara，Cat#9765）；上海生工生物公司合成的引物、探針；TaqMan?Fast Uni?versal PCR Master Mix（2X）（ABI，NO.4366072）。

共收集人參藥材及其易混偽品11 個(gè)物種36 份樣，樣品產(chǎn)地及來(lái)源于河北安國(guó)、安徽亳州、廣西玉林、吉林通化及太原市藥店醫(yī)院和生產(chǎn)企業(yè)等地。樣品經(jīng)山西省食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師崔宇宏鑒定，保存于太原市食品藥品檢驗(yàn)所詳見(jiàn)表1-表2。

表1 人參樣品信息Table 1 Sample information of Panax ginseng

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA 提取

為了避免污染，樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛?，晾干，干品用球磨儀粉碎成細(xì)粉狀，鮮品用潔凈的剪刀剪碎，混勻，稱取20 mg 置于滅菌的2 mL 離心管中。用Tkara 提取試劑盒提取樣本DNA，用核酸分析儀測(cè)定DNA的純度及濃度，將OD260/OD280在1.7～1.9 之間，且濃度達(dá)到10 ng/μL～100 ng/μL的DNA 溶液作為模板DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品DNA 質(zhì)量確定

按照1.2.1 方法提取人參對(duì)照藥材（121591-201602）、人參、人參葉及其他中藥材樣品（見(jiàn)表2）共計(jì)13 個(gè)樣品DNA，水作為空白對(duì)照，以13 個(gè)樣品的DNA 為模板，使用通用引物

表2 其他中藥材樣品信息Table 2 Sample information of the other Chinese herbal medicine

ITS5F： 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA?CAAGG-3′，

ITS4R： 5′-TCCTCCGCTTATTGATAT?GC-3′［15］

進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，觀察實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

引物的設(shè)計(jì)：通過(guò)查閱文獻(xiàn)后獲得人參、西洋參及其他常見(jiàn)近源物種序列，首先用Snapgene 軟件比對(duì)出保守序列，再經(jīng)過(guò)Oligov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast，設(shè)計(jì)出能夠用于人參真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針，由上海生工生物公司合成。

正 向 引 物：5′-AGTTGCGCCCGAAGCCAT?TA-3′；

反 向 引 物 ： 5′-ATCACTCCTTTGC?GGGAGTCGA-3′；

探針：FAM5′-CTATTACCGGAGGGCACA?GA-3′TAMRA。

擴(kuò)增反應(yīng)體系配制如表3。反應(yīng)條件為：50 ℃2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)。

表3 反應(yīng)體系配制表Table 3 Preparation table of reaction system

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

將1.2.2 提取的人參樣品和其他樣品的DNA作為模板。按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，以水作為空白對(duì)照，驗(yàn)證引物和探針對(duì)人參樣品擴(kuò)增的特異性。

1.2.5 樣品覆蓋度實(shí)驗(yàn)

以表1 中34 批人參DNA 為模板，按照1.2.3 進(jìn)行擴(kuò)增，以水作為空白對(duì)照，進(jìn)行覆蓋度試驗(yàn)。

1.2.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將100 ng 的人參DNA 模板10 倍遞減稀釋，稀釋至10-5，每個(gè)梯度做4 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按照1.2.3 中反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增，測(cè)試該方法的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)樣品ITS 片段擴(kuò)增結(jié)果

13 個(gè)樣品DNA 擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均得到700 bp 左右ITS 片段（圖1），說(shuō)明13 個(gè)樣品均能獲得到高質(zhì)量的DNA。

圖1 ITS 片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis pattern of ITS fragment amplified products

M、marker 1、人參對(duì)照藥材2、人參3、人參葉4、西洋參5、黃芪6、三七7、苦參8、太子參9、玄參、10、桔 梗11、沙 參12、丹 參 13、黨 參K、空 白 對(duì) 照（ddH2O）

2.2 特異性引物與探針序列

中藥基源、近源物種和偽品DNA 序列完全的比較研究是中藥DNA 分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)中引物設(shè)計(jì)是否科學(xué)的關(guān)鍵［16］。通過(guò)對(duì)人參、西洋參、三七常見(jiàn)近源物種和偽品序列檢索NCBI 的數(shù)據(jù)庫(kù)，首先用Snapgene 軟件比對(duì)出保守序列，再經(jīng)過(guò)Oli?gov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast，設(shè)計(jì)出能夠用于人參真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針（見(jiàn)圖2），探針序列將測(cè)序后獲得的發(fā)現(xiàn)所有人參與西洋參的5.8S 和ITS2 片段上在位點(diǎn)116、127 處都有2 個(gè)堿基的差異，并且所有的人參5.8S 和ITS2 片段上位點(diǎn)116 均為堿基“C”，位點(diǎn)127 均為堿基“T”，而所有西洋參5.8S 和ITS2 片段上位點(diǎn)116 均為堿基“T”，位點(diǎn)127 均為堿基“C”。比對(duì)結(jié)果同時(shí)顯示人參與三七在5.8S 和ITS2 片段在112、118、127、130 處有4 個(gè)堿基的差異，更容易區(qū)別?；谝陨喜町?，設(shè)計(jì)人參檢測(cè)特異性探針。

圖2 人參、西洋參和三七5.8S 和ITS2 片段上序列的SNP 位點(diǎn)特征Fig. 2 Characteristics of SNP loci on 5.8S and ITS2 fragments of Panax ginseng,P. quinquefolium and P. notoginseng

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

圖3 為空白對(duì)照無(wú)FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照非人參類樣品無(wú)明顯的FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct 值均大于35；陽(yáng)性對(duì)照人參對(duì)照藥材有FAM 熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值小于35 實(shí)驗(yàn)有效。人參、人參葉樣品在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)有FAM 熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值小于35。

圖3 人參特異性擴(kuò)增圖譜Fig. 3 Specific amplification map of P. ginseng

2.4 樣品覆蓋度實(shí)驗(yàn)

圖4（A）為人參對(duì)照藥材和20 批人參樣品擴(kuò)增結(jié)果，圖4（B）為1 批紅參、10 批人參粉、2 批人參配方顆粒樣品擴(kuò)增結(jié)果，由結(jié)果可知，34 批樣品在40個(gè)循環(huán)中均有明顯的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct值均小于35。所以此方法適用于人參藥材、飲片、粉、配方顆粒和紅參的鑒別。

圖4 樣品擴(kuò)增圖譜Fig. 4 Amplification map of sample

2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

圖5 為樣品在稀釋度10-5～100時(shí)，Ct值均＜35，且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均＜3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct值作圖，其線性關(guān)系如圖6 所示，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.993，線性方程為y=-3.99×lgx+16.021，線性范圍為0.001 ng～100 ng，即1×10-3ng/反應(yīng)～100 ng/反應(yīng)，該方法具有良好的線性相關(guān)度。本方法靈敏度高達(dá)1×10-3ng/反應(yīng)。

圖5 人參樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜Fig. 5 Sensitivity amplification map of P. ginseng sample

圖6 人參樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve of sensitivity amplification of P.ginseng sample

3 討論

人參質(zhì)量鑒定方法很多，但有其局限性和專屬性。傳統(tǒng)鑒別方法往往是通過(guò)外觀性狀，如眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等，必要時(shí)借助顯微觀察和薄層鑒別，這種鑒別方式對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高，而且存在主觀差別，不適用于快速、準(zhǔn)確、廣泛的推廣。目前光譜法也用于人參的鑒別，且不破壞樣品，但必須由經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)圖譜進(jìn)行解析［17-18］。而高效液相色譜法操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)分析成本較高，且近緣品指標(biāo)成分相近較難確證［19］。雙反應(yīng)體系測(cè)定3 種樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜、基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法近幾年也運(yùn)用于藥材和中成藥的質(zhì)量控制［20-21］?，F(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)2015 年版中國(guó)藥典首次采用PCR-RFLP 方法鑒別川貝母、PCR 方法鑒別烏梢蛇和蘄蛇及金錢白花蛇，也首次制定了中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則，這也是中國(guó)中藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)劃時(shí)代邁向分子時(shí)代。

ITS 作為真核生物核糖體DNA 的非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，物種間變異較大，遺傳信息較豐富，而且長(zhǎng)度適宜，有利于后續(xù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，所以ITS 分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定。本文依據(jù)中國(guó)藥典2015 年版四部［22］和陳士林對(duì)中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則［23］、基于ITS 分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)了特異性鑒別人參的引物和TaqMan 探針，在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)人參對(duì)照藥材、人參藥材飲片、人參粉、人參配方顆粒、人參葉、紅參有熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，其他非人參樣品無(wú)熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，整個(gè)實(shí)驗(yàn)2 h～3 h 左右用時(shí)較短；靈敏度較高，達(dá)1×10-3ng/反應(yīng)；整個(gè)過(guò)程閉管操作，減小了出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率，同時(shí)避免了電泳時(shí)熒光染料對(duì)身體及環(huán)境造成損害的可能；人工操作較少，業(yè)務(wù)不熟練的檢驗(yàn)人員也可快速掌握，與形態(tài)學(xué)生藥鑒定結(jié)果完全吻合，也驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法鑒別人參真?zhèn)蔚目煽啃院头€(wěn)定性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的引物和TaqMan 探針與模板的特異性PCR 擴(kuò)增可有效鑒別人參，也可有效區(qū)分混淆品和代用品，并且完全閉管檢測(cè)，無(wú)須PCR 后處理，避免了交叉污染和假陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由儀器通過(guò)數(shù)字方式給出，較為準(zhǔn)確，減小了檢驗(yàn)人員判讀時(shí)的主觀誤差，而且可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量；具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、易掌握、便利等特點(diǎn)，作為人參鑒別的新技術(shù)，可以在實(shí)際應(yīng)用中推廣。