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    人參實(shí)時(shí)熒光定量PCR 快速鑒別方法

    2021-08-31 06:10:42李忠華楊寶馬寧岳靜怡郝娟趙麗紅
    關(guān)鍵詞:西洋參人參探針

    李忠華,楊寶,馬寧,岳靜怡,郝娟,趙麗紅

    (1. 太原市食品藥品檢驗(yàn)所,山西 太原 030031;2. 山西國(guó)新晉藥集團(tuán)有限公司,山西 太原 030006)

    0 引言

    人參為五加科植物人參(Panax ginseng)的干燥根和根莖。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效[1-3]。目前,人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛,人參市場(chǎng)除正品外,尚有代用品、偽品、混淆品,以假亂真的現(xiàn)象屢屢發(fā)生,人參飲片市場(chǎng)情況尤其嚴(yán)重,給藥用市場(chǎng)管理帶來(lái)極為不利的影響[4]。因此,急需一種能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別人參的方法,從而確保人參的臨床療效,這對(duì)于藥品、食品、保健品的質(zhì)量保障具有十分重要的意義。

    DNA 分子鑒定技術(shù)因其準(zhǔn)確性、客觀性,在中藥材鑒定中的應(yīng)用越來(lái)越受到人們重視。Shaw 等采用RAPD 法明顯地區(qū)分開(kāi)人參屬的3 種藥材及4種偽品[5],AP-PCR、PCR-SSCP 法也被應(yīng)用在人參屬藥材的鑒定中[6-7]。崔光紅等利用多重等位基因特異PCR 鑒別人參、西洋參[8];王雪松等采用PCRRFLP 鑒定人參真?zhèn)危?];徐鳳嬌等設(shè)計(jì)3 條引物多重PCR 方法鑒定人參和西洋參[10],上述三種方法均需要擴(kuò)增后電泳,所需檢測(cè)設(shè)備多,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),電泳毒性大。侯雙利等基于β-actin 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 鑒別人參真?zhèn)?。黃林杰等運(yùn)用qPCR 技術(shù)對(duì)蘄蛇、浙貝母進(jìn)行了鑒別研究,該方法采用SYBR Green I 染料,染料毒性大,該方法較Taqman 探針?lè)ㄌ禺愋圆?,且人參鑒別還需經(jīng)溶解曲線確定是否為目的產(chǎn)物,檢驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)[11-12];黃永輝等建立了qPCR 技術(shù)鑒別西洋參的方法[13];吳迪等使用qPCR技術(shù)準(zhǔn)確地鑒別了紫河車摻偽品中的豬、牛、羊物種[14]。因此從分子生物學(xué)準(zhǔn)確、快速鑒別中藥材的真?zhèn)纬蔀檠芯繜狳c(diǎn)。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)是在定性PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù),具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、無(wú)污染等特點(diǎn),已被廣泛用于基因的表達(dá)分析。本研究基于人參ITS 序列的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,并引入了Taq?Man 熒光探針,它是一種寡核苷酸探針,其5′端攜帶熒光基團(tuán),如FAM、HEX 等,3′端攜帶淬滅基團(tuán),如TAMRA、BHQ 等,在探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR 擴(kuò)增時(shí),TaqMan 酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR 產(chǎn)物形成完全同步。此方法不僅實(shí)現(xiàn)了人參的快速鑒別,還能區(qū)分人參和替代品及仿冒品,而且可以對(duì)人參樣品進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定,大大提高了人參鑒別的準(zhǔn)確度和靈敏度,為規(guī)范人參的市場(chǎng)管理提供了技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    香港力康Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī);eppen?dorf 微量核酸分析儀;美國(guó)熱電ABI7500fast 熒光定量PCR 儀;BIO-RAD C1000 TOUCH 梯 度PCR儀;Power Pac Basic 電泳儀;美國(guó)伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng);TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0(Tkara,Cat#9765);上海生工生物公司合成的引物、探針;TaqMan?Fast Uni?versal PCR Master Mix(2X)(ABI,NO.4366072)。

    共收集人參藥材及其易混偽品11 個(gè)物種36 份樣,樣品產(chǎn)地及來(lái)源于河北安國(guó)、安徽亳州、廣西玉林、吉林通化及太原市藥店醫(yī)院和生產(chǎn)企業(yè)等地。樣品經(jīng)山西省食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師崔宇宏鑒定,保存于太原市食品藥品檢驗(yàn)所詳見(jiàn)表1-表2。

    表1 人參樣品信息Table 1 Sample information of Panax ginseng

    1.2 方法

    1.2.1 樣品DNA 提取

    為了避免污染,樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精棉球?qū)⒈砻娌潦酶蓛?,晾干,干品用球磨儀粉碎成細(xì)粉狀,鮮品用潔凈的剪刀剪碎,混勻,稱取20 mg 置于滅菌的2 mL 離心管中。用Tkara 提取試劑盒提取樣本DNA,用核酸分析儀測(cè)定DNA的純度及濃度,將OD260/OD280在1.7~1.9 之間,且濃度達(dá)到10 ng/μL~100 ng/μL的DNA 溶液作為模板DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 樣品DNA 質(zhì)量確定

    按照1.2.1 方法提取人參對(duì)照藥材(121591-201602)、人參、人參葉及其他中藥材樣品(見(jiàn)表2)共計(jì)13 個(gè)樣品DNA,水作為空白對(duì)照,以13 個(gè)樣品的DNA 為模板,使用通用引物

    表2 其他中藥材樣品信息Table 2 Sample information of the other Chinese herbal medicine

    ITS5F: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAA?CAAGG-3′,

    ITS4R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATAT?GC-3′[15]

    進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,40 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,觀察實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。

    1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

    引物的設(shè)計(jì):通過(guò)查閱文獻(xiàn)后獲得人參、西洋參及其他常見(jiàn)近源物種序列,首先用Snapgene 軟件比對(duì)出保守序列,再經(jīng)過(guò)Oligov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast,設(shè)計(jì)出能夠用于人參真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針,由上海生工生物公司合成。

    正 向 引 物:5′-AGTTGCGCCCGAAGCCAT?TA-3′;

    反 向 引 物 : 5′-ATCACTCCTTTGC?GGGAGTCGA-3′;

    探針:FAM5′-CTATTACCGGAGGGCACA?GA-3′TAMRA。

    擴(kuò)增反應(yīng)體系配制如表3。反應(yīng)條件為:50 ℃2 min;95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,40 個(gè)循環(huán)。

    表3 反應(yīng)體系配制表Table 3 Preparation table of reaction system

    1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

    將1.2.2 提取的人參樣品和其他樣品的DNA作為模板。按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增,以水作為空白對(duì)照,驗(yàn)證引物和探針對(duì)人參樣品擴(kuò)增的特異性。

    1.2.5 樣品覆蓋度實(shí)驗(yàn)

    以表1 中34 批人參DNA 為模板,按照1.2.3 進(jìn)行擴(kuò)增,以水作為空白對(duì)照,進(jìn)行覆蓋度試驗(yàn)。

    1.2.6 靈敏度實(shí)驗(yàn)

    將100 ng 的人參DNA 模板10 倍遞減稀釋,稀釋至10-5,每個(gè)梯度做4 個(gè)平行實(shí)驗(yàn),按照1.2.3 中反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增,測(cè)試該方法的靈敏度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 特異性實(shí)驗(yàn)樣品ITS 片段擴(kuò)增結(jié)果

    13 個(gè)樣品DNA 擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均得到700 bp 左右ITS 片段(圖1),說(shuō)明13 個(gè)樣品均能獲得到高質(zhì)量的DNA。

    圖1 ITS 片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis pattern of ITS fragment amplified products

    M、marker 1、人參對(duì)照藥材2、人參3、人參葉4、西洋參5、黃芪6、三七7、苦參8、太子參9、玄參、10、桔 梗11、沙 參12、丹 參 13、黨 參K、空 白 對(duì) 照(ddH2O)

    2.2 特異性引物與探針序列

    中藥基源、近源物種和偽品DNA 序列完全的比較研究是中藥DNA 分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)中引物設(shè)計(jì)是否科學(xué)的關(guān)鍵[16]。通過(guò)對(duì)人參、西洋參、三七常見(jiàn)近源物種和偽品序列檢索NCBI 的數(shù)據(jù)庫(kù),首先用Snapgene 軟件比對(duì)出保守序列,再經(jīng)過(guò)Oli?gov7.0.1 和NCBI 的Primer-Blast,設(shè)計(jì)出能夠用于人參真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)引物和探針(見(jiàn)圖2),探針序列將測(cè)序后獲得的發(fā)現(xiàn)所有人參與西洋參的5.8S 和ITS2 片段上在位點(diǎn)116、127 處都有2 個(gè)堿基的差異,并且所有的人參5.8S 和ITS2 片段上位點(diǎn)116 均為堿基“C”,位點(diǎn)127 均為堿基“T”,而所有西洋參5.8S 和ITS2 片段上位點(diǎn)116 均為堿基“T”,位點(diǎn)127 均為堿基“C”。比對(duì)結(jié)果同時(shí)顯示人參與三七在5.8S 和ITS2 片段在112、118、127、130 處有4 個(gè)堿基的差異,更容易區(qū)別?;谝陨喜町?,設(shè)計(jì)人參檢測(cè)特異性探針。

    圖2 人參、西洋參和三七5.8S 和ITS2 片段上序列的SNP 位點(diǎn)特征Fig. 2 Characteristics of SNP loci on 5.8S and ITS2 fragments of Panax ginseng,P. quinquefolium and P. notoginseng

    2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

    圖3 為空白對(duì)照無(wú)FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線;陰性對(duì)照非人參類樣品無(wú)明顯的FAM 熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,Ct 值均大于35;陽(yáng)性對(duì)照人參對(duì)照藥材有FAM 熒光信號(hào)檢出,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct值小于35 實(shí)驗(yàn)有效。人參、人參葉樣品在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)有FAM 熒光信號(hào)檢出,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct值小于35。

    圖3 人參特異性擴(kuò)增圖譜Fig. 3 Specific amplification map of P. ginseng

    2.4 樣品覆蓋度實(shí)驗(yàn)

    圖4(A)為人參對(duì)照藥材和20 批人參樣品擴(kuò)增結(jié)果,圖4(B)為1 批紅參、10 批人參粉、2 批人參配方顆粒樣品擴(kuò)增結(jié)果,由結(jié)果可知,34 批樣品在40個(gè)循環(huán)中均有明顯的熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,Ct值均小于35。所以此方法適用于人參藥材、飲片、粉、配方顆粒和紅參的鑒別。

    圖4 樣品擴(kuò)增圖譜Fig. 4 Amplification map of sample

    2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

    圖5 為樣品在稀釋度10-5~100時(shí),Ct值均<35,且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng),擴(kuò)增結(jié)果具有良好的重復(fù)性,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均<3.5%。以稀釋度量值對(duì)Ct值作圖,其線性關(guān)系如圖6 所示,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.993,線性方程為y=-3.99×lgx+16.021,線性范圍為0.001 ng~100 ng,即1×10-3ng/反應(yīng)~100 ng/反應(yīng),該方法具有良好的線性相關(guān)度。本方法靈敏度高達(dá)1×10-3ng/反應(yīng)。

    圖5 人參樣品靈敏度擴(kuò)增圖譜Fig. 5 Sensitivity amplification map of P. ginseng sample

    圖6 人參樣品靈敏度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve of sensitivity amplification of P.ginseng sample

    3 討論

    人參質(zhì)量鑒定方法很多,但有其局限性和專屬性。傳統(tǒng)鑒別方法往往是通過(guò)外觀性狀,如眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等,必要時(shí)借助顯微觀察和薄層鑒別,這種鑒別方式對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高,而且存在主觀差別,不適用于快速、準(zhǔn)確、廣泛的推廣。目前光譜法也用于人參的鑒別,且不破壞樣品,但必須由經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)圖譜進(jìn)行解析[17-18]。而高效液相色譜法操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)分析成本較高,且近緣品指標(biāo)成分相近較難確證[19]。雙反應(yīng)體系測(cè)定3 種樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜、基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法近幾年也運(yùn)用于藥材和中成藥的質(zhì)量控制[20-21]?,F(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)2015 年版中國(guó)藥典首次采用PCR-RFLP 方法鑒別川貝母、PCR 方法鑒別烏梢蛇和蘄蛇及金錢白花蛇,也首次制定了中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則,這也是中國(guó)中藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)劃時(shí)代邁向分子時(shí)代。

    ITS 作為真核生物核糖體DNA 的非編碼區(qū),承受的選擇壓力較小,物種間變異較大,遺傳信息較豐富,而且長(zhǎng)度適宜,有利于后續(xù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),所以ITS 分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定。本文依據(jù)中國(guó)藥典2015 年版四部[22]和陳士林對(duì)中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[23]、基于ITS 分子標(biāo)記,設(shè)計(jì)了特異性鑒別人參的引物和TaqMan 探針,在40 個(gè)循環(huán)內(nèi)人參對(duì)照藥材、人參藥材飲片、人參粉、人參配方顆粒、人參葉、紅參有熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,其他非人參樣品無(wú)熒光對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線,整個(gè)實(shí)驗(yàn)2 h~3 h 左右用時(shí)較短;靈敏度較高,達(dá)1×10-3ng/反應(yīng);整個(gè)過(guò)程閉管操作,減小了出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率,同時(shí)避免了電泳時(shí)熒光染料對(duì)身體及環(huán)境造成損害的可能;人工操作較少,業(yè)務(wù)不熟練的檢驗(yàn)人員也可快速掌握,與形態(tài)學(xué)生藥鑒定結(jié)果完全吻合,也驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法鑒別人參真?zhèn)蔚目煽啃院头€(wěn)定性。

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)建立的引物和TaqMan 探針與模板的特異性PCR 擴(kuò)增可有效鑒別人參,也可有效區(qū)分混淆品和代用品,并且完全閉管檢測(cè),無(wú)須PCR 后處理,避免了交叉污染和假陽(yáng)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由儀器通過(guò)數(shù)字方式給出,較為準(zhǔn)確,減小了檢驗(yàn)人員判讀時(shí)的主觀誤差,而且可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量;具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、易掌握、便利等特點(diǎn),作為人參鑒別的新技術(shù),可以在實(shí)際應(yīng)用中推廣。

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