氯吡格雷對順鉑介導的化療痛小鼠脊髓背角Iba-1及促炎因子的影響*

陳學泰 劉宇程 范利君 陳立平 申 文△

（1 徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉學重點實驗室，徐州 221004；2 鹽城市第一人民醫(yī)院麻醉科，鹽城 224700；3 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院疼痛科，徐州 221004）

近年來，國內(nèi)越來越多的文獻報道鉑類、紫杉類、長春生物堿類等抗腫瘤藥物在治療腫瘤的同時，可引起病人痛覺過敏或痛覺超敏，部分病人還表現(xiàn)為手套樣或襪套樣感覺異常，臨床上稱為化療藥物誘導的神經(jīng)病理性疼痛 (chemotherapy-induced neuropathic pain, CINP)，簡稱化療痛[1～3]。CINP 嚴重限制了抗腫瘤藥物的應用，影響了腫瘤病人的生活質量。然而，目前針對CINP 的有效治療方法有限，CINP 的機制也尚未明確，國內(nèi)外均未發(fā)現(xiàn)能預防和控制這一并發(fā)癥的有效藥物和方法，所以開展控制化療痛的新藥研究，闡明其分子機制是目前該領域的研究熱點。

最新研究證實，中樞敏化在CINP 的發(fā)病機制中起關鍵作用，越來越多的研究表明，中樞神經(jīng)膠質細胞在CINP 中發(fā)揮重要作用[4～6]。脊髓背角是化療引起痛覺過敏的主要作用部位。在脊髓中，痛覺信息由感覺神經(jīng)元傳遞，然后通過脊髓神經(jīng)元-神經(jīng)元和膠質細胞-神經(jīng)元之間的多種信號通路進行處理。除了神經(jīng)元機制外，脊髓膠質細胞，特別是小膠質細胞和星形膠質細胞，在化療誘導的痛覺過敏的發(fā)生中發(fā)揮了關鍵作用。研究表明，小膠質細胞的激活有助于順鉑誘導的神經(jīng)性疼痛。被激活的小膠質細胞能通過趨化作用介導傷害性信號，并通過小膠質細胞和神經(jīng)元的相互作用釋放促炎細胞因子[7～9]。

氯吡格雷 (Clopidogrel)是一種有效、口服的靶向血小板P2Y12 的抗血栓化合物[10,11]。有報道氯吡格雷對P2Y12 的作用依賴于其在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的活性代謝物，也觀察到其通過血腦屏障轉運[12]。近年來，大量的文獻指出，氯吡格雷能夠通過抑制小膠質細胞P2Y12 受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。有研究指出口服10 mg/kg 氯吡格雷可緩解脊神經(jīng)結扎所引起的觸覺異常和熱痛覺過敏[13]。也有研究報告稱，更高的劑量 (25 mg/kg) 對緩解觸覺異常具有更持久的影響[14]。然而，氯吡格雷能否緩解順鉑所介導的痛覺過敏以及潛在的細胞和分子機制仍不清楚?；谝陨献C據(jù)，本研究采用順鉑誘導的神經(jīng)病理性疼痛模型，探討氯吡格雷對順鉑介導的化療痛小鼠脊髓背角Iba-1 及促炎因子的影響，為進一步明確氯吡格雷在化療痛中的作用提供研究思路。

方 法

1.實驗動物及試劑

實驗采用SPF 級健康C57BL/6J 8 周雄性小鼠，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。所有實驗操作程序均經(jīng)徐州醫(yī)科大學實驗動物福利與應用委員會批準，遵守國際衛(wèi)生學會《實驗動物福利和應用指南》。山羊抗Iba-1 (Abcam, USA)，兔抗GAPDH (CST,USA)，TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA 試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

2. 順鉑介導的化療痛動物模型制備及給藥方法

C57BL/6J 8 周雄性小鼠40 只，采用隨機數(shù)字表法分為4 組（每組10 只）：對照組（Control 組）；氯吡格雷組 （Clopidogrel 組）：氯吡格雷10 mg/kg灌胃連續(xù)5 天；化療痛組（Cisplatin 組）：小鼠進行腹腔注射順鉑 2.3 mg/kg , 連續(xù)注射5 天，休息5天，再連續(xù)注射5 天，再休息5 天；化療痛 + 氯吡格雷組（Cisplatin + Clopidogrel 組）：順鉑最后1 次注射后，開始氯吡格雷10 mg/kg 灌胃，連續(xù)5天。順鉑給藥前、給藥后第 1、5、10、15、20 天使用vonFrey 測痛儀測定大鼠機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)（ 第20天行為學檢測時間在氯吡格雷腹灌胃4 h 后），采用Western Blot 及免疫熒光方法檢測Iba-1，給藥后采用ELISA 檢測脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6表達。

3.疼痛行為學檢測

采用MWT 值來反映小鼠的機械痛閾。本實驗使用的vonFrey 細絲包括：0.02、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0 和1.4 g。將小鼠放置到10 cm×10 cm×15 cm 的有機玻璃盒中，每次實驗前適應約半小時。小心將vonFrey 細絲置于小鼠足底并使其彎曲，保持彎曲3～4 s，且同一只小鼠的同一側足底相鄰2 次刺激之間需間隔10 min。初次刺激時使用克度為0.16 的vonFrey 細絲。當小鼠足底出現(xiàn)敏銳的抬腳反應，則為陽性反應，在vonFrey 表中記作X。反之，則為陰性反應，記作O。從出現(xiàn)陰、陽性反應變化開始，共進行6 次試驗。試驗結束后，用 50%vonFrey 反應閾值公式計算出小鼠的MWT 值。

4. Western Blot 檢測

小鼠深麻醉（小鼠腹腔注射 1%戊巴比妥鈉40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L4-5)，加入裂解液進行勻漿，4℃下12, 000 rpm 離心20 min，并進行BCA 蛋白定量。配置 12%的分離膠和 5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為 80 伏恒壓，分離膠電泳條件為100 伏恒壓，當溴酚藍染料前端電泳至分離膠末端處時即停止電泳，轉膜后 5%脫脂奶粉封閉 2 h，加入GAPDH (兔抗小鼠，1:2000)，IBA-1（羊抗小鼠，1:1000），4℃孵育過夜后 TBST 洗膜 6 次，每次5 min。加入 HRP 標記的山羊抗兔 IgG (1:1000)，HRP 標記的驢抗山羊IgG (1:1000) 室溫孵育1 h 后TBST 洗膜6 次，每次5 min。ECL 反應、顯影、定影后使用圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

5.免疫熒光染色

大鼠經(jīng)心臟灌注生理鹽水沖去血液，再用4℃的4%多聚甲醛溶液（溶于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，pH 7.4）灌注固定。取出L4-5脊髓組織，繼續(xù)后固定 1～3 h，隨后轉入 30%蔗糖溶液脫水3 天。用冰凍切片機 (Leica CM1900)將組織切成20 μm薄片用于染色。組織片用3% 驢血清的0.3% Triton X-100 溶液常溫固定1 h，再孵育小膠質細胞特異性標記物 Iba-1 抗體 4℃過夜，洗滌后常溫避光孵育FITC 偶聯(lián)的 IgG，用熒光顯微鏡和CCD 掃描相機(Leica)拍照。

6. ELISA 檢測

小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L4-5)，按組織凈重 (g)：稀釋液體積 (ml) = 1:9 的比例加入預冷的生理鹽水。勻漿后于4℃，3500 rpm 離心10 min（離心半徑5 cm），提取上清液并在-80℃保存。按試劑盒說明書檢測蛋白并繪制標準曲線，計算出脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 濃度。

7.統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，痛閾值分析采用重復測量的方差分析，灰度值比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊性時采用 LSD 法，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±SD)表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 氯吡格雷對順鉑介導的化療痛小鼠小鼠MWT的影響

給藥前各組小鼠的MWT 差異無統(tǒng)計學意義。與Control 組相比，腹腔注射順鉑 5 次后（第5 天），小鼠 MWT 顯著性降低 (P＜ 0.05)，并且一直持續(xù)到20 天，提示順鉑誘導化療痛小鼠模型成功。與Cisplatin 組相比，Cisplatin + Clopidogrel 組能夠明顯逆轉順鉑介導的化療痛小鼠的痛閾降低，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.05)。而正常組小鼠氯吡格雷灌胃前后痛閾無明顯差異（見圖1）。以上結果表明Clopidogrel 能減輕順鉑介導的化療痛小鼠的機械痛覺過敏。

圖1 氯吡格雷灌胃對順鉑介導的化療痛小鼠機械縮足反射閾值的影響(±SD,n =10)*P＜ 0.05，與control 組相比；#P＜ 0.05，與cisplatin 組相比Fig. 1 Effects of clopidogrel on MWT in mice with cisplatininducedpain (±SD, n= 10)*P ＜ 0.05, compared with group control; #P ＜ 0.05,compared with group cisplatin.

2. 氯吡格雷對順鉑介導的化療痛小鼠脊髓Iba-1蛋白表達的影響

Western Blot 結果顯示：在第20 天，與Control組相比，Cisplatin 組小鼠脊髓Iba-1 表達明顯增多(P＜0.05)，與Cisplatin 組相比，Cisplatin + Clopidogrel 組小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明顯逆轉化療痛小鼠脊髓Iba-1 蛋白表達增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，見圖2A），提示氯吡格雷可以抑制順鉑介導的化療痛小鼠脊髓Iba-1 的表達。

免疫熒光結果顯示：在第20 天，Control 組小鼠脊髓背角小膠質細胞數(shù)量較少；Cisplatin 組小鼠脊髓背角小膠質細胞數(shù)量明顯增多(P＜ 0.05)；Cisplatin + Clopidogrel 組小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明顯逆轉化療痛小鼠脊髓小膠質細胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，見圖2B），提示氯吡格雷可以抑制順鉑介導的化療痛小鼠脊髓背角小膠質細胞活性。

3.氯吡格雷對順鉑介導的化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表達的影響

ELISA 結果顯示：在第20 天，與Control 組相比，Cisplatin 組小鼠脊髓 TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達顯著升高 (P＜ 0.05)，與Cisplatin 組相比，Cisplatin + Clopidogrel 組小鼠氯吡格雷灌胃后，氯吡格雷可以明顯逆轉化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，見圖3）。提示氯吡格雷可以抑制順鉑介導的化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6 的表達。

圖3 氯吡格雷對順鉑介導的化療痛小鼠促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達的影響 (±SD)*P ＜ 0.05，與control 組相比；#P ＜ 0.05，與cisplatin 組相比Fig. 3 Effect of Clopidogrel on the expression of pro-inflammatory factor TNF-α, IL-1β and IL-6 in cisplatin induced chemotherapy pain (±SD)*P ＜ 0.05, compared with group control; #P ＜ 0.05, compared with group cisplatin.

討 論

化療痛(CINP)是化療藥物如鉑類化合物（順鉑）、紫杉烷、長春花生物堿的主要不良反應。順鉑作為第一代抗腫瘤藥物廣泛用于治療實體腫瘤，尤其是睪丸癌、卵巢癌和膀胱癌。鉑類藥物能夠與DNA 結合，影響DNA 復制，抑制轉錄，從而誘導細胞凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤活性[15]。但化療痛的機制至今尚未明確。近年來，有關中樞膠質細胞在CINP 中的作用的研究越來越多。研究表明，紫杉醇治療后脊髓中小膠質細胞表達明顯增多，以及小膠質細胞的抑制劑二甲胺四環(huán)素可以顯著逆轉紫杉醇引起的冷痛覺過敏。這些研究證明了脊髓小膠質細胞在化療痛中的關鍵作用。然而，也有證據(jù)表明脊髓星形膠質細胞的激活與奧沙利鉑、硼替佐柏和紫杉醇誘導的神經(jīng)性疼痛有關[16,17]。也有相關研究表明，小膠質細胞的激活有助于順鉑誘導的神經(jīng)性疼痛。順鉑能夠激活小膠質細胞，使其釋放大量促炎因子介導化療痛，并且不激活星形膠質細胞。注射小膠質細胞抑制劑二甲胺四環(huán)素能減輕順鉑誘導的CINP。而星形膠質細胞抑制劑的L-AA 對順鉑誘導的CINP 無明顯改善[7]。造成不同膠質細胞激活原因可能與化療藥物的種類和劑量有關。本研究結果與報道的一致，順鉑能引起小膠質細胞的激活，提示了小膠質細胞激活在順鉑誘導的化療痛機制中發(fā)揮了重要作用，但星形膠質細胞是否激活及小膠質細胞激活調(diào)節(jié)的具體機制還需進一步研究。

氯吡格雷是一種有效的、口服的靶向血小板P2Y12 的抗血栓化合物，其安全性來自廣泛的臨床項目的研究結果[10,11]。氯吡格雷對P2Y12 的作用依賴于其在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的活性代謝物，也觀察到其通過血腦屏障的轉運[12]。近年來，大量的文獻指出，氯吡格雷能夠通過抑制小膠質細胞P2Y12受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[13,14]。臨床上，氯吡格雷的活性代謝物需要連續(xù)幾天給藥才能達到治療效果，因此，本研究連續(xù)5 天給予氯吡格雷，使其有效地抑制P2Y12R。氯吡格雷的鎮(zhèn)痛作用已在脊神經(jīng)結扎模型[18]、慢性偏頭痛模型[19]中得到證實，但在化療誘導的神經(jīng)病理性疼痛中應用還未見報道，本研究結果顯示：氯吡格雷能減輕順鉑介導的化療痛小鼠的機械痛覺過敏，并且氯吡格雷抑制了順鉑介導的化療痛小鼠脊髓小膠質細胞蛋白的表達。

有文獻報道指出，在疼痛模型中，脊髓中小膠質細胞通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和p38 信號通路促進促炎細胞因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 的持續(xù)產(chǎn)生。一方面，這些促炎細胞因子通過作用于脊髓小膠質細胞、星形膠質細胞自身及周圍相應受體，促進膠質細胞介導的“炎癥湯”的形成。另一方面，它們通過作用于突觸前和/或突觸后膜中相應的受體，直接介導突觸可塑性和神經(jīng)元興奮性[20,21]。ELISA結果顯示，順鉑腹腔注射后，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達顯著升高，氯吡格雷對抑制了順鉑介導的化療痛小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表達增多。本研究表明氯吡格雷能夠緩解順鉑介導的化療痛小鼠痛覺過敏，其機制可能與炎癥反應有關。而氯吡格雷是否能夠通過抑制脊髓小膠質細胞活化，減少促炎因子的合成和釋放來緩解化療痛還有待于實驗進一步證實。

綜上所述，在本實驗條件下氯吡格雷能夠抑制順鉑誘導的神經(jīng)病理性疼痛，其作用機制可能與抑制脊髓小膠質細胞激活及其炎癥反應有關。這為闡明氯吡格雷調(diào)控化療痛的發(fā)展過程提供了實驗依據(jù)，并為臨床治療化療痛提供了新的思路。