油樟葉純露成分分析及不同季節(jié)純露的抑菌活性研究

吳芳 楊立艷 李莉 黃彭 魏琴

摘要 以不同季節(jié)（春季、夏季、秋季、冬季）宜賓油樟葉片為研究對(duì)象制備純露，利用GC-MS對(duì)油樟純露的主要成分進(jìn)行分析，通過抑菌圈、最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），研究不同季節(jié)純露對(duì)大腸埃希氏菌 （E.coli）、福氏志賀氏菌（S.flexneri）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）和腸炎沙門氏菌（S.enteritidis） 的抑菌活性。結(jié)果表明，油樟葉純露中的主要組分為1，8-桉葉油素（57.86%）、α-松油醇（31.74%）和松油烯-4-醇（9.13%）;不同季節(jié)純露對(duì)4種供試微生物均有明顯的抑菌效果，以冬季純露效果最好;4種供試微生物中，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好。油樟純露作為油樟精油生產(chǎn)副產(chǎn)物，具有一定的開發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞 油樟;純露;GC-MS;抑菌活性;不同季節(jié)

中圖分類號(hào) R 285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）16-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.051?? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Hydrosol Composition and Antibacterial Activity of ?Cinnamomum longepaniculatum ?（Gamble） Leaves from Different Seasons

WU Fang1，2，YANG Li-yan1，3，LI Li1，2 et al （1.Sichuan Oil Camphor Engineering Technology Research Center，Yibin，Sichuan 644000;2.Department of Quality Management and Inspection and Testing，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000;3.Key Lab of Aromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education，Yibin University，Yibin，Sichuan 644000）

Abstract The leaves of ?Cinnamomum longepaniculatum ?in different seasons （spring，summer，autumn，winter） were used as the research object to prepare pure dew.The main components of ?Cinnamomum longepaniculatum ?were analyzed by GC-MS.Through the zone of inhibition，minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC），the antibacterial activity of pure dew in different seasons on ?E.coli，S.flexneri，S.aureus ?and ?S.enteritidis ?were studied.The results indicated the major metabolites including 1，8-cineole（57.86%），α-terpineol （31.74%） and Terpinene-4-ol （9.13%）.The pure dew in different seasons had obvious antibacterial effect on the 4 tested microorganisms，and the pure dew in winter had the best effect.Among the 4 tested microorganisms，the inhibitory effect on ?Staphylococcus aureus ?was the best.As a by-product of essential oil of ?Cinnamomum longepaniculatum ?production，hydrosol had a certain development potential.

Key words ?Cinnamomum longepaniculatum; Pure dew;GC-MS;Antibacterial activity;Different seasons

純露是水蒸氣蒸餾制取精油時(shí)的副產(chǎn)物，其氣味較精油柔和，對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低，在化妝品行業(yè)得到越來越廣泛的應(yīng)用，另外，由于其抗菌和抗氧化性能，在食品工業(yè)中應(yīng)用也越來越受到青睞。油樟[ Cinnamomum longepaniculatum ?（Gamble） N.Chao ex H.W.Li]是中國四川宜賓的特有資源樹種，生長在海拔600～2 000 m的常綠闊葉林中[1-2]，其葉片被廣泛用于制取油樟精油。油樟油具有抗菌[3-5]、消炎[2]和抗氧化[6-7]等活性，主要用于出口香料和藥品的原料，其主要成分為桉樹油素（cineole）、松油醇（terpineol）和檜烯（sabinene）等[4]。但在利用水蒸氣蒸餾制取精油的過程中，不可避免地會(huì)得到許多“蒸餾水”（經(jīng)冷凝即為純露），目前常被作為油樟精油生產(chǎn)的廢棄物被排放掉。純露在化妝品行業(yè)和食品工業(yè)中都有很好的利用，為了充分利用森林資源，有必要對(duì)油樟精油生產(chǎn)過程中的“純露”利用潛力進(jìn)行研究。精油和純露的主要成分是揮發(fā)性有機(jī)物，Li等[4]對(duì)油樟精油的化學(xué)成分及其抑菌活性進(jìn)行了研究，與精油一樣，油樟純露可能也含有抗菌成分，具有利用價(jià)值（如玫瑰純露，售價(jià)很高），但有關(guān)油樟精油生產(chǎn)副產(chǎn)物純露的研究鮮見報(bào)道。

該研究以不同季節(jié)（春季、夏季、秋季、冬季）宜賓油樟葉片為研究對(duì)象制備純露，利用GC-MS對(duì)油樟純露的主要成分進(jìn)行分析，通過抑菌圈、最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），研究不同季節(jié)純露對(duì)大腸埃希氏菌 （E.coli）、福氏志賀氏菌（S.flexneri）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）和腸炎沙門氏菌（S.enteritidis） 的抑菌活性，旨在評(píng)估油樟純露在作為油樟精油生產(chǎn)副產(chǎn)物開發(fā)方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試油樟葉采自四川省宜賓市高縣紅巖山（27°50′N、105°20′E），包括1份多株葉片的混合樣品（用于分析油樟葉純露化學(xué)成分組成），1株植株春季、夏季、秋季、冬季不同季節(jié)葉片的樣品（用于分析不同季節(jié)油樟葉純露主要化學(xué)成分差異）。供試菌種為大腸埃希氏菌 （E.coli ?ATCC 21534）、福氏志賀氏菌 （S.flexneri ?ATCC 21513）、金黃色葡萄球菌 （S.aureus ?ATCC 21530）和腸炎沙門氏菌 （S.enteritidis ??21600），菌種購自中國微生物菌種保藏中心。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基。

1.2 研究方法

1.2.1 純露的制取。參照Tabti等[8]方法并略加改進(jìn)。材料經(jīng)蒸餾水洗滌后自然晾干，剪碎后稱取50 g（3個(gè)重復(fù)），放入4 ℃冰箱備用。制備時(shí)利用旋蒸儀，50 g樣品加入400 mL蒸餾水放入1 L蒸餾瓶中，煮沸后轉(zhuǎn)小火保持微沸6 h，冷卻1 h后收集上層油樟花水，4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 純露成分的測(cè)定。采用美國安捷倫Agilent 7890B/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)試樣成分進(jìn)行分析。

1.2.2.1 色譜條件。色譜柱為DB-FFAP （60 m×250 μm×0.25 μm）;載氣為氦氣（He）;流速1.0? mL/min;柱溫：程序升溫 90～190 ℃（5 ℃/min），恒溫5 min，190～220 ℃（5 ℃/min），恒溫 3? min，220～250 ℃（5 ℃/min）;進(jìn)樣量 0.5 μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。分流模式進(jìn)樣，分流比 3∶1;進(jìn)樣口溫度230 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿150 ℃;電離方式為EI;電子能量70 eV;電子倍增管電壓1 847 V;掃描質(zhì)量范圍30～550 amu。數(shù)據(jù)分析用Agilent 公司GC-MS solution工作站，NIST 08美國標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定。參考抗菌盤藥敏試驗(yàn)性能標(biāo)準(zhǔn)[9]，采用紙片擴(kuò)散法，有改動(dòng)。定性濾紙制作成直徑6 mm 的圓形紙片，高壓滅菌后分2份，分別浸泡于純露和無菌蒸餾水中浸泡2 h備用。吸取菌濃度106～107 CFU/mL的上述4種致病菌各100 μL分別用涂布棒均勻涂布到固體培養(yǎng)基表面，再將濾紙片放置在含菌平板上，每個(gè)紙片相隔一定間距，每種菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照（一個(gè)平板呈三角形放置3 張濾紙片），倒置于培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)（37 ℃、24 h）。測(cè)量抑菌圈的直徑，計(jì)算真實(shí)抑菌直徑。計(jì)算公式如下：真實(shí)抑菌圈直徑（mm）=試驗(yàn)組抑菌圈直徑-對(duì)照組抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）。參照魏琴等[10]的方法進(jìn)行。按照純露和蒸餾水1∶1～1∶16的比例進(jìn)行稀釋，然后各取0.5 mL 加入裝有9 mL培養(yǎng)基的試管中，再加入0.5 mL供試菌的菌懸液，使純露在培養(yǎng)基中的濃度分別為0.75、0.375、0.187 5、0.093 75、0.046 875 mL/mL，充分振蕩混勻，使試管中的細(xì)菌濃度達(dá)到105 CFU/mL。每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。觀察試驗(yàn)結(jié)果，若試管出現(xiàn)渾濁，則有菌生長，從而確定MIC。

1.2.5 最小殺菌濃度（MBC）。參照張萍等[11]的方法。取渾濁前的澄清菌懸液0.1 mL涂布于LB固體培養(yǎng)中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。記錄試驗(yàn)結(jié)果，將最后一個(gè)沒長菌培養(yǎng)基所對(duì)應(yīng)的稀釋濃度確定為最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油樟葉純露成分及含量

混合葉片制備純露的GC-MS圖譜如圖1所示，該試驗(yàn)條件下共鑒定出17個(gè)化合物（表1）。相對(duì)含量由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)根據(jù)峰面積歸一法給出。油樟葉純露中的主要組分為1，8-桉葉油素（57.86%）、α-松油醇（31.74%）和松油烯-4-醇（9.13%），其主成分含量與Li等[4]研究所得的油樟精油主成分（1，8-桉葉油素58.55%、α-松油醇15.43%和松油烯-4-醇4.84%）較類似。為分析不同季節(jié)油樟純露中主要成分的差異，利用GC-MS分析不同季節(jié)油樟純露，并將3種主要組分相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)于表1。

2.2 不同季節(jié)純露的抑菌活性

從表2可以看出，油樟葉純露對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌和腸炎沙門氏菌均有抑制作用，抑菌效果冬季最強(qiáng)、春季最弱。

2.3 不同季節(jié)純露對(duì)細(xì)菌的MIC和MBC

從表3可以看出，根據(jù)純露的MIC值，不同季節(jié)純露的抑菌效果不同，春季：金黃色葡萄球菌>腸炎沙門氏菌=大腸埃希氏菌=福氏志賀氏菌;夏季：金黃色葡萄球菌>大腸埃希氏菌>腸炎沙門氏菌=福氏志賀氏菌;秋季：金黃色葡萄球菌=福氏志賀氏菌>大腸埃希氏菌=腸炎沙門氏菌;冬季：金黃色葡萄球菌=福氏志賀氏菌>腸炎沙門氏菌=大腸埃希氏菌。根據(jù)純露的MBC值，不同季節(jié)純露的殺菌效果不同，春季：金黃色葡萄球菌>腸炎沙門氏菌=大腸埃希氏菌=福氏志賀氏菌;夏季：金黃色葡萄球菌>大腸埃希氏菌>腸炎沙門氏菌=福氏志賀氏菌;秋季：福氏志賀氏菌=大腸埃希氏菌>金黃色葡萄球菌=腸炎沙門氏菌;冬季：金黃色葡萄球菌=福氏志賀氏菌>腸炎沙門氏菌=大腸埃希氏菌。總體上看，不同季節(jié)純露對(duì)4種供試菌均有抑制和殺菌效果，相對(duì)而言，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制和殺菌效果較好，對(duì)腸炎沙門氏菌效果相對(duì)較差。

3 結(jié)論

（1）不同季節(jié)油樟葉純露的化學(xué)成分中相對(duì)含量較高的組分有3個(gè)，分別為1，8-桉葉油素、α-松油醇和松油烯-4-醇。

（2）從抑菌圈的大小來看，冬季的油樟純露對(duì)4種供試病菌的抑制效果最好，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最為強(qiáng)烈，抑菌圈達(dá)5.6 mm。其他季節(jié)的抑菌效果依次是夏季純露、秋季純露和春季純露，除了秋季純露對(duì)福氏志賀氏菌的效果最好外，其余3個(gè)季節(jié)純露均對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

（3）從MIC和MBC值來看，冬季純露的抑菌和殺菌效果均最好，其次為夏季、秋季和春季。不同季節(jié)純露均對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

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