安徽省太和縣瓜類褪綠黃化病毒自然侵染南瓜的檢測(cè)分析

陳瑩 韓科雷 章東方 顧江濤 高正良 郭志 嚴(yán)丹侃 王芳

摘要 采集安徽省太和縣南瓜具有典型癥狀的病葉樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)鑒定，并結(jié)合測(cè)序結(jié)果確定為CCYV。為了更加明確安徽太和地區(qū)CCYV的來源和序列的變異情況，測(cè)定了該病毒的外殼蛋白（coat protein，CP）序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，此次安徽太和縣所檢測(cè)到的分離物與我國其他地區(qū)的分離物以及以色列、日本和希臘等國家存在較小的地域差異性，親緣關(guān)系較近，而與伊朗地區(qū)的分離物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。該研究是安徽省CCYV侵染南瓜的首次報(bào)道，以期為該病害的預(yù)警和防控提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)對(duì)策。

關(guān)鍵詞 南瓜;瓜類褪綠黃化病毒;系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào) S 436.42? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）16-0159-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.042?? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Detection and Analysis of Cucurbit? Chlorotic Yellow Virus Naturally Infecting Pumpkin in Taihe，Anhui Province

CHEN Ying， HAN Ke-lei， ZHANG Dong-fang et al

（Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract We collected samples of diseased leaves with typical symptoms for RT-PCR detection and identification， and combined the sequencing results to determine that it was CCYV. In order to more clarify the source and sequence variation of CCYV in Taihe， Anhui Province， the coat protein （CP） sequence of the virus was determined for phylogenetic analysis. The results showed that the isolates detected in Taihe， Anhui Province were relatively close to isolates from other areas of China， Israel， Japan， and Greece. The relationship with the isolates in Iran was relatively distant. This study was the first report of CCYV infestation of pumpkins in Anhui Province， in order to provide a theoretical basis and scientific countermeasures for the early warning and prevention of the disease.

Key words Pumpkin;Cucurbit chlorotic yellows virus;Phylogenetic analysis

瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）屬于長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（ Crinivirus ），由2種類型的煙粉虱（B型和Q型）半持久性傳播[1-2]，不能夠通過摩擦接種傳播。CCYV在自然條件下可侵染多種瓜類作物，如西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜等[3-6]。CCYV最早是2004年日本學(xué)者在一個(gè)甜瓜的溫室大棚中發(fā)現(xiàn)，但其基因組序列是2010年才被鑒定出來[5]。我國2019年被首次報(bào)道（湖南?。〤CYV在自然條件下侵染南瓜。雖然該病毒是毛形病毒屬近幾年新加入的成員，但其危害范圍較廣，蔓延速度較快，在伊朗[7]、黎巴嫩[8]、希臘[9]和蘇丹[10]等國家均有發(fā)生危害，此外在我國如上海[11]、臺(tái)灣[12]、山東[13]、新疆[4]、河南和海南[14]等地也均有報(bào)道。CCYV主要危害瓜類作物的葉片，癥狀表現(xiàn)為花葉、黃化和卷曲等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株壞死，顆粒無收[15]。

目前關(guān)于CCYV可以侵染南瓜的報(bào)道不多，調(diào)查發(fā)現(xiàn)在安徽太和縣溫室內(nèi)發(fā)生在南瓜上的CCYV侵染十分嚴(yán)重，該病毒侵染南瓜后植株葉片表現(xiàn)出褪綠畸形，無法結(jié)出果實(shí)，嚴(yán)重影響了該地南瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。因此，為了明確安徽省太和縣CCYV侵染南瓜的發(fā)生情況和遺傳變異等問題，筆者利用RT-PCR的方法對(duì)其CP序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，并將本地的分離物與其他地區(qū)已報(bào)道的分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為安徽省太和縣CCYV發(fā)生情況和病害防控提供了數(shù)據(jù)支撐。這是繼我國湖南省報(bào)道的CCYV可以在自然條件下侵染南瓜后的第二次報(bào)道，同時(shí)這是安徽省CCYV可以在自然條件下侵染南瓜的首次報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年10月，在安徽省太和縣舊縣鎮(zhèn)精準(zhǔn)扶貧就業(yè)基地的南瓜溫室中，南瓜表現(xiàn)出大面積的葉片褪綠、黃化、壞死及植株矮化等癥狀，造成整個(gè)溫室的南瓜顆粒無收，采集具有典型病毒病癥狀的帶毒樣品，對(duì)其樣品進(jìn)行編號(hào)后置于液氮中速凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱，待進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)鑒定。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 RT-PCR 檢測(cè)。

根據(jù)該基地溫室中南瓜葉片的發(fā)病癥狀以及溫室大棚中出現(xiàn)煙粉虱等傳毒介體，推測(cè)其可能受CCYV的侵染，因此根據(jù)NCBI中所報(bào)道的CCYV CP序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。將采集的帶毒樣品進(jìn)行充分研磨后，參照TIANGEN植物總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit進(jìn)行植物總RNA提取，然后根據(jù)Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ說明書操作（購于艾科瑞生物有限公司），對(duì)所提取的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用2×Mix（購于北京艾德萊生物有限公司）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)。上游引物CCYV-CP-F：5′-CGTAAGTGATCGCAATCAAT-3′;下游引物CCYV-CP-R：5′-AGTGATCACTTGACCATCTCC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為876 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送至南京生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BLAST進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析。

采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用鄰接法（neighbor-joining）建樹，Bootstrap replications中輸入1 000，序列比對(duì)時(shí)選擇氨基酸（amino acid），由此完成建樹[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCYV發(fā)生情況

對(duì)安徽省太和縣舊縣鎮(zhèn)精準(zhǔn)扶貧就業(yè)基地的南瓜溫室進(jìn)行了調(diào)查分析。溫室內(nèi)南瓜產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生十分嚴(yán)重，并出現(xiàn)煙粉虱等傳毒介體，受病毒病侵染的南瓜葉片表現(xiàn)為褪綠黃化、皺縮、畸形、壞死，且植株矮化，不結(jié)果實(shí)。典型癥狀見圖1。

2.2 CCYV的RT-PCR檢測(cè)鑒定

將采集的4組表現(xiàn)病毒病癥狀的樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，根據(jù)合成的CCYV特異性引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采集的4組樣品中，有一組樣品檢測(cè)出相應(yīng)條帶，條帶大小為876 bp（圖2）。PCR產(chǎn)物通過測(cè)序后，確定為瓜類褪綠黃化病毒。通過Blast比對(duì)后，CCYV CP 序列全長(zhǎng)753 bp，編碼250個(gè)氨基酸，且發(fā)現(xiàn)該次檢測(cè)到的CCYV CP序列與登錄號(hào)為KY400633.1、KX118632.1、LT716000.1、JQ904629.1、MH819191.1和JN126046.1的CP序列完全一致。該分離物CP核苷酸序列與其他地區(qū)已報(bào)道的分離物核苷酸序列同源性在94.82%～99.87%，這是安徽省CCYV自然侵染南瓜的首次報(bào)道，后續(xù)對(duì)于該基地南瓜的發(fā)病情況也會(huì)持續(xù)調(diào)查和研究。

2.3 CCYV的CP序列系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確安徽省太和南瓜CCYV的分類地位以及與各地區(qū)所報(bào)道的同種病毒不同寄主之間的親緣進(jìn)化關(guān)系，將檢測(cè)到的CCYV CP序列結(jié)合已報(bào)道的29個(gè) CCYV CP序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并將bean yellow disorder virus分離物（登錄號(hào)：EU191905.1）作為外群一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCYV的不同分離物在不同地區(qū)具有一定的地理特征。中國各地區(qū)的分離物與日本、塞浦路斯、以色列和希臘地區(qū)的分離物差異較小，親緣關(guān)系較近，而與伊朗地區(qū)的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分別屬于2個(gè)不同的分支。此外有些CCYV分離物雖然來源于同一地區(qū)，但由于發(fā)生的寄主植物不同，在分類地位上也存在一定的差異，如山東省在西瓜和絲瓜上所報(bào)道的CCYV分離物處于不同的分支。

3 結(jié)論與討論

瓜類褪綠黃化病毒作為長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（ Crinivirus ）的新成員，近幾年對(duì)瓜類等葫蘆科作物造成較嚴(yán)重的侵害和損失[15]。自2010年CCYV被日本首次報(bào)道[5]，同年在我國臺(tái)灣地區(qū)也檢測(cè)到該病毒[12]，隨后在2011年我國山東省、浙江省和上海市的西瓜、甜瓜和黃瓜上均檢測(cè)到CCYV，且病害發(fā)生率在50%～100%[17-18]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。該研究通過RT-PCR檢測(cè)，確定安徽省太和縣南瓜上暴發(fā)的病毒為CCYV，這是安徽省CCYV侵染南瓜的首次報(bào)道。通過對(duì)CCYV CP序列與其他地區(qū)的分離物同源性進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明此次檢測(cè)到的CCYV分離物與已報(bào)道的6個(gè)其他分離物核苷酸同源性為100%，登錄號(hào)分別為KY400633.1、KX118632.1、LT716000.1、JQ904629.1、MH819191.1和JN126046.1。核苷酸序列與伊朗地區(qū)的分離物同源性較差，為94.82%～95.09%，與其他地區(qū)已報(bào)道的分離物核苷酸同源性為97.79%～99.87%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)所檢測(cè)的分離物與我國其他地區(qū)的分離物親緣關(guān)系密切，與伊朗地區(qū)分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。太和縣舊縣鎮(zhèn)精準(zhǔn)扶貧就業(yè)基地作為安徽省重要的農(nóng)產(chǎn)品扶貧產(chǎn)業(yè)區(qū)，南瓜生產(chǎn)遭受CCYV危害十分嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為南瓜葉片褪綠黃化皺縮畸形，影響果實(shí)生長(zhǎng)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2014年蘇丹地區(qū)報(bào)道了CCYV能夠自然侵染南瓜[19]，但在2019年湖南省首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了CCYV能夠自然侵染南瓜[6]。因此，結(jié)合近幾年各地CCYV的發(fā)生蔓延情況和基于該次調(diào)查的結(jié)果，應(yīng)引起CCYV對(duì)南瓜生產(chǎn)方面的重視，積極有效地采用防治措施加以防治。同時(shí)安徽CCYV與已報(bào)道的CCYV基因組核苷酸和氨基酸序列變異較小，表明未來在抗性品種的選育方面可能較容易找到適合各地的抗病性設(shè)計(jì)靶標(biāo)，該試驗(yàn)結(jié)果旨在為CCYV的防控和抗性育種等方面提供理論參考。

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