黑皮雞樅的分子鑒定與營養(yǎng)需求研究

羅影 關(guān)永強(qiáng) 賈培松 趙振豪 努爾孜亞?亞力買買提 魏鵬 賈文捷

摘要 為了明確黑皮雞樅的營養(yǎng)需求，促進(jìn)其制種工藝的提高。以新疆麥蓋提縣人工栽培的菌株為試材，采用單因素試驗(yàn)分別對其母種和原種的營養(yǎng)需求進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，黑皮雞樅母種培養(yǎng)基中最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母浸粉，加入1%的MgSO4、CaCl2及棗粉均能促進(jìn)其菌絲生長，而NaCl和KH2PO4抑制其菌絲生長，菌絲培養(yǎng)最適溫度為20～28? ℃，最適pH為5.5～6.0;原種培養(yǎng)基中將棉籽殼與木屑以7∶3比例混合作為主料使用效果明顯。

關(guān)鍵詞 黑皮雞樅;ITS;營養(yǎng)需求

中圖分類號 S 646? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）16-0044-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.013?? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study of Molecular Identification and Nutritional Requirement of ?Hymenopellis raphanipes

LUO Ying1，GUAN Yong-qiang2，JIA Pei-song1 et al （1.Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi，Xinjiang? 830091; 2.Xinjiang Institute of? Chinese Materia Medica and Ethnodrug，? Urumqi， Xinjiang? 830002 ）

Abstract To identify the effects of different nutrients on the mycelical growth of ?Hymenopellis raphanipes， ?and improve the level of strains production.The test was studied by single factor plate experiment， using a ?Hymenopellis raphanipes ?strain from Maigaiti County of Xinjiang as material.The results showed that the best carbon and nitrogen source were maltose and yeast extract respectively.The addition of 1% MgSO4， CaCl2 and jujube powder could promote the mycelial growth， while NaCl and KH2PO4 inhibited it.The optimal temperature range? was 20-28 ℃， and the optimal pH was 5.5-6.0.The mixture of cottonseed hull and sawdust at the ratio of 7∶3 was used as the main material.

Key words ?Hymenopellis raphanipes; ITS;Nutritional requirement

黑皮雞樅 （Hymenopellis raphanipes）， 又名二孢擬奧德蘑[1]、卵孢小奧德賽蘑、長根菇、長壽菇[2-3]，是新近商業(yè)化栽培的熱門食用菌。其在分類學(xué)上屬擔(dān)子門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Agaricales）、膨瑚菌（Physalacriaceae）[2]。該菌曾一度誤認(rèn)為是長根小奧德賽蘑 （Oudemansiella radicata）、鱗柄小奧德賽蘑（Oudemansiella furfuracea）及雞樅菌（Termitomyces albuminosus） [4]。Hao等[4]基于ITS和LSU片段的分子系統(tǒng)學(xué)分析將該菌認(rèn)定為 Oudemansiella raphanipes，分類學(xué)研究中把其劃歸為Hymenopellis 屬[5]。但由于我 國Oudemansiella raphanipes首次報(bào)道卵孢小奧德賽蘑時(shí)拉丁文名為Oudemansiella raphanipes， 所以為避免學(xué)名混亂，國內(nèi)一部分研究一直使用該名[6]。

黑皮雞樅香味馥郁，肉質(zhì)鮮嫩，含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖及礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分[7]，并具有較高的藥用價(jià)值，具有健脾益氣、止痛消腫等功效[3， 8]，是一種珍稀食藥用真菌。目前對于黑皮雞樅的研究，也涉及多個(gè)方面，包括子實(shí)體營養(yǎng)成分[7，9]、 化學(xué)成分及生物活性分析[8]，原生質(zhì)體的制備[10]，液體培養(yǎng)基優(yōu)化[3]及實(shí)際栽培中各項(xiàng)指標(biāo)的研究[11-12]等。

我國黑皮雞樅的人工栽培史相對較短，2007年人工栽培成功[13]，后續(xù)又不斷對栽培技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苣暝耘郲14]，目前山東、北京、四川、廣州、江蘇等地均有一定規(guī)模的人工栽培。隨著西部大開發(fā)和精準(zhǔn)扶貧的開展，黑皮雞樅也在新疆有小規(guī)模的栽培，但栽培面積小、產(chǎn)量少、質(zhì)量不穩(wěn)定，產(chǎn)品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。其中菌種是制約黑皮雞樅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一。筆者對麥蓋提縣栽培的黑皮雞樅子實(shí)體進(jìn)行組織分離，為防止出現(xiàn)同種異名的情況，對采集的黑皮雞樅進(jìn)行ITS序列測定，明確種源，并對其母種和原種的營養(yǎng)需求進(jìn)行研究，為黑皮雞樅的制種工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株。黑皮雞樅菌株（JZ004）保藏于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，其子實(shí)體采集于喀什地區(qū)麥蓋提縣人工栽培菇房。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然;基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂20 g，pH自然;基礎(chǔ)代料配方：主料78%，麥麩20%，石膏1%，石灰1%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離與純化。

采用組織分離法進(jìn)行分離純化，選擇菇蓋肥厚、無病蟲害的子實(shí)體作為分離材料，先將采集的子實(shí)體用無菌水清洗表面，再用75%乙醇表面消毒，在菌蓋與菌柄交接處取0.3～0.4 cm3的組織，移放到PDA斜面培養(yǎng)基中央，置于25? ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長情況，待菌絲長至1/2板時(shí)，挑取菌落邊緣新生菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基平板，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次即可得到純化菌株，純化好的菌株接種至PDA培養(yǎng)基斜面，待菌絲長滿斜面置于4 ℃保藏箱保藏，每個(gè)菌株保存5支。

1.2.2 菌種的活化與菌絲體收集。

將低溫保藏的黑皮雞樅菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，待菌絲長滿平板備用?；罨?，取菌絲尖端再接于PDA平板，培養(yǎng)基表面鋪一層玻璃紙。固體培養(yǎng)的菌絲體，用滅菌的接種鏟沿著玻璃紙的表面將菌絲體輕輕刮下，置稱量紙上，天平稱量備用。

1.2.3 ITS序列測定。

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行總DNA的提取，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度。

采用通用引物 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4 TCCTCCGCTTATTGGATATGC（由生工生物工程股份有限公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2× Taq ?PCR MasterMix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL、模板1.0 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將PCR產(chǎn)物交于生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/），進(jìn)行BLAST比對分析。選取同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA 6.0軟件首先進(jìn)行多重序列比對，再采用Neighbour-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次Bootstrap自舉法檢驗(yàn)。

1.2.4 母種培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.4.1 平板試驗(yàn)法。每個(gè)平皿中央定量接種直徑5 mm的菌絲塊，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，主要以菌絲生長速度為指標(biāo)，同時(shí)觀察菌落的形態(tài)特征、菌絲長勢等，所有試驗(yàn)均采用90 mm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基用量20 mL/皿。

1.2.4.2 培養(yǎng)基成分對黑皮雞樅菌絲生長的影響。

采用平板試驗(yàn)法，分別固定基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的碳源和氮源含量，對碳源、氮源及無機(jī)鹽進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，恒溫暗培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，綜合考慮菌絲長勢和菌絲生長速度，研究不同培養(yǎng)基成分對黑皮雞樅菌絲生長的影響。

1.2.4.3 培養(yǎng)條件對黑皮雞樅菌絲生長的影響。采用平板試驗(yàn)法，使用PDA培養(yǎng)基，分別改變溫度（5～30 ℃）、pH（4.0～8.5）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，綜合考慮菌絲長勢和菌絲生長速度，研究不同培養(yǎng)條件對黑皮雞樅菌絲生長的影響。

1.2.5 原種培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.5.1 平板篩選。

選擇食用菌栽培中常用的15種培養(yǎng)料，磨成粉末，過篩，在PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加等量培養(yǎng)料，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，篩選適合黑皮雞樅培養(yǎng)的培養(yǎng)料。

1.2.5.2 代料配方篩選。根據(jù)平板篩選結(jié)果，設(shè)計(jì)多個(gè)代料培養(yǎng)基配方，通過培養(yǎng)試驗(yàn)，對比不同培養(yǎng)基配方下黑皮雞樅菌絲體生長速度和菌絲長勢等生物學(xué)指標(biāo)，篩選出適宜代料培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1? ITS序列 將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST可知，供試菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中卵孢小奧德賽蘑 （Hymenopellis raphanipes） 的ITS序列同源性大于99%。選取10個(gè)同源性較高的序列，以口蘑科口蘑屬松茸 ?（Tricholoma matsutake ?EU294302.1） 的ITS為外群，與JZ004一起，用MEGA7.0中Neighbor-joining 法（maximum likehood bootstrap trials=1 000），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，供試菌株種源明確，與 Hymenopellis raphanipes 聚為一簇，從分子水平上鑒定采集的樣本為卵孢小奧德賽蘑（ Hymenopellis raphanipes）。

2.2 母種培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基成分篩選

2.2.1.1 碳源。

由表1和圖2可知，黑皮雞樅在8種碳源培養(yǎng)基上均能生長，但在不同碳源培養(yǎng)基上，菌絲生長有較大差異。以單一無機(jī)碳源培養(yǎng)黑皮雞樅時(shí)，其菌絲長勢較差。以可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌絲生長速度最快，但菌絲長勢較差，以麥芽糖為碳源時(shí)，菌絲生長速度達(dá)（5.81±0.84） mm/d，與對照和其他6種碳源存在顯著差異，且菌絲長勢最好，綜合菌絲長勢和生長速度，菌株JZ004 的最佳碳源為麥芽糖。

2.2.1.2 氮源。

由表2和圖3可知，黑皮雞樅在11種氮源培養(yǎng)基上均能生長，包括有機(jī)氮、氨基酸、無機(jī)氮化合物等，且不添加氮源時(shí)也能生長，但在不同氮源培養(yǎng)基上，菌絲生長有較大差異。其中以有機(jī)氮為氮源時(shí)菌絲相對濃密，菌絲長勢較好，且以酵母膏為氮源時(shí)，菌絲最為濃密粗壯，其次是酵母浸粉、牛肉膏、酸水解酪蛋白，以酵母浸粉為氮源時(shí)，生長速度最快，達(dá)（5.52±0.39）mm/d，牛肉膏和酸水解酪蛋白為氮源時(shí)次之。綜合菌絲長勢和生長速度，最佳氮源為酵母浸粉。

2.2.1.3 無機(jī)鹽。

由圖4可知，不同無機(jī)鹽對黑皮雞樅菌絲生長的影響效果有明顯差異?；A(chǔ)培養(yǎng)基中加入MgSO4，在供試范圍內(nèi)均能促進(jìn)其菌絲生長，加入CaCl2，低濃度對黑皮雞樅菌絲生長起促進(jìn)作用，后隨著濃度升高，又表現(xiàn)出抑制作用，且二者在加入量為1%，其促進(jìn)作用均最明顯;而NaCl和KH2PO4在供試范圍內(nèi)均起到抑制作用。

2.2.1.4 棗粉比例。

新疆當(dāng)?shù)丶t棗資源豐富，以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同比例的棗粉，通過培養(yǎng)試驗(yàn)，分析不同比例下黑皮雞樅菌絲體生長速度和菌絲長勢等生物學(xué)指標(biāo)，篩選出適宜的母種培養(yǎng)基配方。結(jié)果顯示，菌株JZ004加入1%棗粉時(shí)，菌絲長速最快，且菌絲長勢較好（表3、圖5）。

2.2.2 培養(yǎng)條件篩選。

2.2.2.1 溫度。設(shè)計(jì)多個(gè)培養(yǎng)溫度，通過培養(yǎng)試驗(yàn)，分析不同溫度下黑皮雞樅菌絲體生長速度和菌絲長勢等生物學(xué)指標(biāo)，篩選出黑皮雞樅適宜生長的溫度。結(jié)果顯示，菌株JZ004在15～30 ℃均能生長，在5和35 ℃條件下，菌絲能萌發(fā)但不能吃料和生長。在20～28 ℃菌絲生長均較好，長速差異不顯著（表4、圖6）;結(jié)合圖3，黑皮雞樅為中高溫型菌株，菌絲在20～28 ℃均適合其生長。

2.2.2.2 pH。改變培養(yǎng)基pH，通過培養(yǎng)試驗(yàn)，分析不同pH處理下黑皮雞樅的菌絲生長速度和菌絲長勢等生物學(xué)指標(biāo)，篩選出黑皮雞樅適宜生長的pH。結(jié)果顯示，黑皮雞樅菌絲在pH為4.5～9均可生長，且改變培養(yǎng)基pH菌絲長勢差異不顯著。以菌絲長勢為評價(jià)指標(biāo)，黑皮雞樅菌絲最適生長的pH在5.5～6.0，偏酸，差異顯著（表5）。

2.3 原種培養(yǎng)基篩選

2.3.1 平板篩選。

選擇食用菌栽培種常用的15種培養(yǎng)料，磨成粉末，過篩，在PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加等量培養(yǎng)料，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，篩選適合黑皮雞樅培養(yǎng)的培養(yǎng)料。結(jié)果顯示，PDA培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)料粉末，菌株JZ004的菌絲密度和生長速度均有所增強(qiáng)，其中加入未發(fā)酵棉籽殼時(shí)，生長速度最快，差異顯著（表6、圖7）。

2.3.2 代料篩選。

根據(jù)平板篩選試驗(yàn)，棉籽殼、木屑、玉米芯等均可以作為代料栽培黑皮雞樅。按照比例將棉籽殼和木屑混合作為主料，采用栽培袋進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表7，主料為棉籽殼∶木屑7∶3比例混合時(shí)，菌株JZ004在栽培袋中生長速度最快，且菌絲濃白，因此，棉籽殼與木屑以7∶3比例混合可作為主料。

按照比例將以7∶3比例混合的棉籽殼與木屑，再與玉米芯進(jìn)行混合，進(jìn)行培養(yǎng)基主料篩選，結(jié)果見表8。主料加入玉米芯后，對黑皮雞樅生長速度影響差異不顯著，但總體上是不加入玉米芯的培養(yǎng)料中菌株JZ004菌絲生長相對較快。

3 結(jié)論與討論

黑皮雞樅作為一種營養(yǎng)價(jià)值豐富的食用菌，栽培前景廣闊，也是近年來比較熱門的商業(yè)化栽培食用菌。在新疆也有小規(guī)模的栽培，但存在產(chǎn)量少、質(zhì)量不穩(wěn)定、人工成本高等問題，產(chǎn)品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)?shù)厥袌龅男枨蟆Ｆ渲芯N是制約黑皮雞樅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一。該研究以麥蓋提縣栽培的黑皮雞樅子實(shí)體進(jìn)行組織分離的菌株為試材，對其進(jìn)行ITS序列測定，以明確其種源，然后對其母種和原種的營養(yǎng)需求進(jìn)行研究，以期為黑皮雞樅的制種工藝提供理論依據(jù)，為新疆黑皮雞樅的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株種源明確， 與Hymenopellis raphanipes 聚為一簇，從分子水平上鑒定采集的樣本為卵孢小奧德賽 蘑（Hymenopellis raphanipes）。 綜合菌絲長勢和生長速度，黑皮雞樅菌絲生長的最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母浸粉，加入1%的MgSO4、CaCl2及棗粉均能促進(jìn)其菌絲生長，而NaCl和KH2PO4抑制其菌絲生長，菌絲培養(yǎng)最適溫度為20～28 ℃，最適pH為5.5～6.0;原種培養(yǎng)基中棉籽殼、木屑、玉米芯等均可以作為代料栽培黑皮雞樅，其中將棉籽殼與木屑以7∶3比例混合作為主料使用效果最佳。

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