溫郁金脫毒快繁及移栽方法研究

郭月琴 李帆 姜程曦 任仙櫻

摘要 [目的]通過試驗(yàn)尋找出優(yōu)良的溫郁金脫毒苗的制備方法及栽培方法。[方法]通過固定其中一個(gè)條件不變，改變其他因素，驗(yàn)證出較好的溫郁金根狀莖消毒方法，及其叢生芽的誘導(dǎo)、愈傷、繼代、分化、生根培養(yǎng)方法。[結(jié)果]溫郁金根狀莖的消毒方法為流水沖洗30～50 min，再用70%乙醇和10%過氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無菌水重新沖洗3～4次。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈傷、繼代、分化、生根培養(yǎng)基分別為MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L、MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L、MS+KT 5.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L、MS+NAA 1.0 mg/L。[結(jié)論]通過對脫毒苗制備過程的條件控制，使溫郁金脫毒苗品質(zhì)較高以及脫毒率可以達(dá)到100%，另外提供科學(xué)的栽培方法，使所制備的脫毒苗栽培育苗后成活率達(dá)到100%，且幼苗健壯。

關(guān)鍵詞 溫郁金;脫毒苗;制備方法;移栽方法

中圖分類號 S 567.23+9? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）16-0040-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.012?? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Rapid Propagation and Transplanting Methods of Virus-free Seedling of ?Curcuma wenyujin

GUO Yue-qin1，2，LI Fan2，JIANG Cheng-xi1，3 et al （1.College of Pharmaceutical Sciences， Wenzhou Medical University，Wenzhou，Zhejiang 325035;2.Institute of Life Sciences，Wenzhou University，Wenzhou，Zhejiang 325035;3.Wenzhou Ejin Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yueqing，Zhejiang 325600）

Abstract [Objective]The preparation method and cultivation method of excellent ?Curcuma wenyujin ?virus-free seedlings were found through experiments.[Method]By fixing one of the conditions unchanged and changing other factors， a better disinfection method of ?Curcuma wenyujin ?rhizomes， and the induction， callus， subculture， differentiation， and rooting culture methods of cluster buds were verified.[Result]The disinfection method of ?Curcuma wenyujin ?rhizoma tympanum was to flush the rhizoma tympanum by running water for 30-50 minutes， then disinfect it with 70% ethanol and 10% hydrogen peroxide for 20-40 s and 6-8 minutes successively， and then rinse it again with sterile water for 3-4 times.The cluster bud induction medium was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L.The media for callus， subculture， differentiation and rooting were MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L， MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L， MS +KT 5.0 mg/L + NAA 0.3 mg/L， MS+NAA 1.0 mg/L.[Conclusion]By controlling the conditions in the preparation process of virus-free seedlings， the quality of ?Curcuma wenyujin ?virus-free seedlings is higher and the virus-free rate can reach 100%，and by providing scientific cultivation methods， the survival rate of the prepared virus-free seedlings after cultivation and nursery can reach 100%， and the seedlings are robust.

Key words ?Curcuma wenyujin; Virus-free seedlings;Preparation method;Transplanting method

溫郁金 （Curcuma wenyujin） 系浙江南部地區(qū)種植的一種姜科姜黃屬植物，其塊根、根莖可供藥用，塊根加工成的藥材溫郁金是浙江省著名道地藥材“浙八味”之一[1]。目前，溫郁金的野生種已罕見，以人工栽培為主。溫郁金喜溫暖濕潤、陽光充足的氣候，耐旱抗?jié)?，但怕霜凍，適宜在土質(zhì)疏松、排水良好、土層深厚的沖積土、砂壤土中生長[2-5]。溫郁金開花很少，種子多不充實(shí)，栽培上用種姜根莖繁殖。溫郁金年生長周期約250 d，一般4月上旬（清明前后）種植，12月中上旬收獲[6]。

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，土壤污染日益嚴(yán)重，尤其是土壤中有害重金屬積累到一定程度就會(huì)對土壤-植物系統(tǒng)產(chǎn)生毒害，不僅導(dǎo)致土壤退化，還會(huì)引起農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低，危及人類生命和健康。溫郁金在環(huán)境因子的作用下，植物與病原菌相互適應(yīng)和相互斗爭導(dǎo)致病害的發(fā)生和蔓延。由于溫郁金屬于多基源品種，來源復(fù)雜，并且目前溫郁金的種植基本上是按照傳統(tǒng)的粗放模式進(jìn)行，導(dǎo)致品種退化、病毒化嚴(yán)重、采收及產(chǎn)地加工不規(guī)范等情況出現(xiàn)[7]，致使藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，難以得到控制，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量，市場競爭力下降，市場占有份額擴(kuò)展困難。

近年來，脫毒苗的研究與使用能夠在一定程度上緩解上述問題。趙霞等[8]通過對草莓莖尖進(jìn)行熱處理脫毒處理，得到的草莓苗繁育增殖、病蟲害減少，降低了生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提高了經(jīng)濟(jì)效益。吳順等[9]以無花丹參莖尖為材料，優(yōu)化其脫毒培養(yǎng)和植株再生的激素濃度組合，篩選出最佳組合，所得的無花丹參苗移栽后病蟲害減少且長勢優(yōu)良。肖雅等[10]以感染TMV和CMV的湘西本地小黃姜為試材，采用熱處理、莖尖培養(yǎng)結(jié)合添加病毒唑的方法進(jìn)行脫毒處理以獲得無病毒的優(yōu)質(zhì)生姜種苗，其脫毒率可達(dá)100%。

該試驗(yàn)為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，經(jīng)過多年試驗(yàn)，研制出一種溫郁金煉苗方法及移栽方法，為溫郁金組培苗生產(chǎn)者提供技術(shù)參考，同時(shí)為溫郁金GAP生產(chǎn)提供新的規(guī)范化種植模式。

1 材料與方法

1.1 材料 該試驗(yàn)所用的溫郁金頂芽或腋芽尖來自浙江溫州市瑞安沙洲村溫郁金種植基地，并由溫州醫(yī)科大學(xué)姜程曦教授鑒定，共100批次。

1.2 試劑與儀器

MS培養(yǎng)基，KT、6-BA、2，4-D、NAA激素，均來自北京酷來搏科技有限公司;光照培養(yǎng)箱LI180A、恒溫培養(yǎng)箱來自上海京孚儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 芽的脫毒。

秋天收獲時(shí)，挑選株高在70～120 cm的矮稈品種溫郁金，取溫郁金根狀莖上的0.5～2.0 cm的頂芽或腋芽尖端作為接種材料，并對其進(jìn)行消毒處理，每種處理接種50個(gè)。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理。處理①，流水沖洗10～15 min，用70%乙醇和10%過氧化氫先后消毒10～15 s和3～5 min，無菌水沖洗3～4次;處理②，流水沖洗30～50 min，再用70%乙醇和10%過氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無菌水重新沖洗3～4次;處理③，流水沖洗10～15 min，再用70%乙醇和10%過氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無菌水重新沖洗3～4次;處理④，流水沖洗10～15 min，70%乙醇溶液消毒10～15 s，無菌水沖洗3～4次;處理⑤，流水沖洗10～15 min， 10%過氧化氫先后消毒3～5 min，無菌水沖洗3～4次。

脫毒率=脫毒個(gè)數(shù)/成活個(gè)數(shù)×100%（1）

1.3.2 根狀莖頂芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

在無菌條件下，取莖尖生長點(diǎn)，切成0.1～0.3 mm方塊接種在MS含有6-BA和NAA不同濃度配比的莖尖啟動(dòng)培養(yǎng)基上，每處理接種50個(gè)，在無光照和溫度為12～18 ℃的條件下培養(yǎng)2～5 d，然后在溫度為18～24 ℃，每天光照為4～6 h的條件下培養(yǎng)15～20 d，觀察莖尖誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率=成活數(shù)/接種數(shù)×100%（2）

1.3.3 愈傷組織的誘導(dǎo)。

將小芽轉(zhuǎn)接至含有不同激素2，4-D和KT配比的MS培養(yǎng)基中，在28 ℃進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，觀察愈傷組織的形成情況，每處理接種50個(gè)。

1.3.4 繼代培養(yǎng)。

形成愈傷組織后轉(zhuǎn)接至含有不同激素2，4-D和KT配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，觀察生長情況，每處理接種50個(gè)。

繼代培養(yǎng)成活率=繼代培養(yǎng)成活數(shù)/接種數(shù)×100%（3）

1.3.5 轉(zhuǎn)接分化。繼代培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)接至含有不同激素NAA和KT配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，觀察分化情況，每處理接種50個(gè)。

分化率=分化數(shù)/接種數(shù)×100%（4）

1.3.6 生根。分化后轉(zhuǎn)接至以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加至6-BA、2，4-D、NAA和KT的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根，觀察生根情況。

生根率=生根數(shù)/接種數(shù)×100%（5）

1.3.7 移栽。

在日平均溫度為20～30 ℃時(shí)進(jìn)行移栽。研究不同基質(zhì)、不同基質(zhì)消毒方式和不同肥料對溫郁金育苗的影響，選取長勢一致的溫郁金脫毒苗，采用正交試驗(yàn)的方法（表1）進(jìn)行試驗(yàn)，每50株作為一個(gè)處理。

基質(zhì)的原料有椰糠、表土、河沙。A1.椰糠;A2.椰糠∶表土=1∶1;A3.椰糠∶表土∶河沙=1∶1∶1。

基質(zhì)消毒法使用3種方法：B1.活性炭消毒法，是指將椰子殼燒成灰，灑在基質(zhì)表面;B2.雷公藤根粉+細(xì)土或草木灰消毒法，為該試驗(yàn)原創(chuàng)法，雷公藤的根粉碎成的細(xì)粉使用量為每株苗用2.5～3.0 g，細(xì)土或草木灰5.0～6.5 g;B3.多菌靈消毒法，每株苗施50%多菌靈可濕性粉劑0.015 g。

使用3種肥料：C1.農(nóng)家肥;C2.秸稈肥;C3.腐熟的菜籽餅、提取莪術(shù)油后產(chǎn)生的藥渣以質(zhì)量比為20～30∶1搗碎混合。3種肥料都是每株苗1.5～3.0 g通過穴施方法施肥。

采用“+”針對成活率、病蟲害、生長態(tài)勢進(jìn)行評價(jià)，5個(gè)“+”最優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對溫郁金莖頂芽（腋芽）培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），各種處理對接種材料都能起到良好的消毒作用，但不同消毒方法的脫毒率與莖尖成活率之間存在差異，其中處理②與處理③的脫毒率較高，但是處理③的成活率最低，處理②的成活率也是最高，適于溫郁金莖尖培養(yǎng)。

2.2 不同濃度激素配比對溫郁金頂芽（腋芽）誘導(dǎo)率的影響 從表3可以看出，隨著6-BA濃度的升高，誘導(dǎo)率逐漸升高后基本持平，且以3.0 mg/L為好;隨著NAA濃度的升高，誘導(dǎo)率逐漸升高后基本持平，且以1.0 mg/L為好。所以溫郁金莖尖誘導(dǎo)最佳的激素為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

2.3 不同濃度激素配比對溫郁金頂芽（腋芽）愈傷組織的影響

從表4可以看出，隨著2，4-D 濃度的升高，生成的愈傷組織個(gè)數(shù)逐漸升高后基本持平，且以2.0 mg/L為好;隨著KT濃度的升高，生成的愈傷組織個(gè)數(shù)逐漸升高，且以5.0 mg/L為好。所以溫郁金頂芽（腋芽）愈傷組織的最佳激素配比為MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L。

2.4 不同濃度激素配比對溫郁金頂芽（腋芽）繼代培養(yǎng)的影響

從表5可以看出，隨著2，4-D 濃度的升高，繼代培養(yǎng)成活率逐漸升高后開始下降，且以1.0 mg/L為好;隨著KT濃度的升高，成活率逐漸升高后有所下降，且以0.5 mg/L為好。所以溫郁金頂芽（腋芽）繼代培養(yǎng)的最佳激素配比為MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L。

2.5 不同濃度激素配比對溫郁金頂芽（腋芽）分化的影響

從表6可以看出，隨著NAA 濃度的升高，分化率逐漸升高后開始下降;隨著KT濃度的升高，分化率逐漸升高后基本持平。綜合考慮，以NAA 0.3 mg/L+KT 5.0 mg/L為好。所以溫郁金頂芽（腋芽）分化培養(yǎng)的最佳激素配比為MS+KT 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

2.6 不同激素配比對溫郁金頂芽（腋芽）分化后生根的影響

從表7可以看出，添加NAA激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率最高，為97.3%;添加6-BA激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率最低，為86.0%;最高最低相差11.3%。所以，添加NAA 1.0 mg/L激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根為最適培養(yǎng)基。

2.7 移栽 試驗(yàn)結(jié)果顯示（表8），任何含有A3、B2、C3因素的栽培方式都可以起到促進(jìn)溫郁金脫毒苗的生長，以A3B2C3為組合的移栽方式最優(yōu)，為“+++++”，幼苗成活率為最高（98.91%），病蟲害相比傳統(tǒng)栽培方法[11]最高能降低84%，生長態(tài)勢較傳統(tǒng)脫毒苗[12]也更為良好。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)以溫郁金根狀莖頂芽（腋芽）為材料，參考前人的研究[13-14]，尋找一種更合適溫郁金脫毒苗的制法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消毒方法為用流水沖洗溫郁金頂芽（腋芽）30～50 min，再用70%乙醇和10%過氧化氫先后消毒20～40 s和6～8 min，然后用無菌水重新沖洗3～4次，可以達(dá)到100%的脫毒率;脫毒后以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L為愈傷組織培養(yǎng)基，以MS+2，4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以MS+KT 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行分化，以MS+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行生根，得到脫毒試管苗成活率能達(dá)到100%。

另外，該試驗(yàn)參考前人的方法[5，15]在溫郁金脫毒苗的移栽方法中創(chuàng)新了對基質(zhì)的消毒方法和肥料的應(yīng)用，即采用雷公藤的根粉碎成的細(xì)粉加草木灰對土壤進(jìn)行消毒，選用腐熟的菜籽餅、提取莪術(shù)油后產(chǎn)生的藥渣作為肥料。

植物經(jīng)過幾代種植，品質(zhì)一般都出現(xiàn)不同程度的退化，使得植物成活率不高，生長態(tài)勢不好，而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是植物病毒的感染。為克服這一問題，獲得高產(chǎn)，脫毒苗在植物的種植上得到廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)在傳統(tǒng)溫郁金脫毒苗制備的方法上[12]，結(jié)合了其他的方法，尋找到一種更適合溫郁金脫毒苗制備的方法，在后續(xù)過程中，能培育出成活率更高的苗。

溫郁金是一種藥用價(jià)值極高的藥材，其含有的β-欖香烯[16]更是在抗癌方面表現(xiàn)出了很大的潛力。所以，尋找出一條能夠快速高效獲得溫郁金資源的途徑非常有必要。該試驗(yàn)為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，經(jīng)過多年試驗(yàn)，研制出一種溫郁金脫毒苗的制備方法及移栽方法，為溫郁金脫毒苗生產(chǎn)者提供技術(shù)參考，同時(shí)也為溫郁金GAP生產(chǎn)提供新的規(guī)范化種植模式。

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