電針對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓背角CB2R、p-P38和p-ERK表達的影響

李楊樂，楊鋒，樊靜杰，鄭曉慧，朱芮，鄭潔，3

1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西省針藥結(jié)合重點實驗室，陜西 咸陽 712046

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是始于關(guān)節(jié)軟骨退變，并逐漸累及滑膜、軟骨下骨、肌腱及韌帶等關(guān)節(jié)周圍多種組織的復雜性退行性關(guān)節(jié)疾病，我國尤以膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）高發(fā)。OA患病率與年齡呈正相關(guān)，我國60歲以上人群OA患病率為50%，75歲以上人群患病率高達80%。疼痛是OA的首要癥狀，隨著病情發(fā)展，出現(xiàn)長期持續(xù)性慢性疼痛，也是引起患者關(guān)節(jié)功能障礙及生活質(zhì)量下降的重要因素。OA長期持續(xù)性疼痛并非關(guān)節(jié)局部損害引起的單純感受傷害性疼痛，還包括神經(jīng)病理性疼痛。脊髓背角是痛覺信息傳遞與調(diào)控的第一站，脊髓水平的中樞敏化是感受傷害性疼痛發(fā)展為神經(jīng)病理性疼痛的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，KOA慢性疼痛大鼠脊髓背角痛覺反射通路異常活躍，大鼠患側(cè)足底皮膚對機械刺激表現(xiàn)出較強的脊髓反應，這一過程可能與MAPK 信號通路活化密切相關(guān)。大麻素受體2（CB2R）是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的重要組成部分，脊髓CB2R激活后可通過抑制MAPK信號通路發(fā)揮抑制神經(jīng)病理性疼痛作用。電針可緩解KOA慢性疼痛及綜合癥狀，提高患者生活質(zhì)量。本實驗以谷氨酸鈉碘乙酸（MIA）誘導KOA慢性疼痛大鼠模型，觀察電針“陽陵泉”“內(nèi)膝眼”對大鼠痛性行為學、脊髓背角CB2R、p-P38和p-ERK表達的影響，從脊髓水平揭示電針治療KOA慢性疼痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量220～260 g，成都達碩實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2020-030。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度24～26 ℃，濕度50%～60%，12 h光/暗循環(huán)，自由攝食飲水。實驗過程嚴格遵守科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑與儀器

谷氨酸鈉碘乙酸（MIA，貨號S30680，上海源葉生物科技有限公司），CB2R阻斷劑AM630（貨號HY-15421，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CB2R一抗（貨號PA1-746A，美國Invitrogen公司），p-ERK一抗（貨號ab0011，英國Abcam公司），p-P38一抗（貨號9216S，美國CST公司），NeuN一抗（貨號A0951，美國Abclonal公司），F(xiàn)ITC標記羊抗小鼠IgG、Cy3標記羊抗兔IgG（貨號分別為BA1101、BA1032，武漢博士德）。病理切片機（型號RM2016，德國Leica公司），熒光顯微鏡（型號BX53，日本Olympus公司），Von Frey 測痛儀（型號IITC 2391，美國生命科學儀器公司），雙足平衡測痛儀（型號IITC390，美國生命科學儀器公司），小動物吸入麻醉機（型號ABM，上海玉研科學儀器有限公司），華佗牌電針儀（型號SDZ-II，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），華佗牌一次性針灸針（0.18 mm×13 mm，吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 分組與造模

48只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為空白組、鹽水組、模型組、電針組、CB2R阻斷組、CB2R阻斷＋電針組，每組8只。除空白組和鹽水組外，其余各組采用膝關(guān)節(jié)腔注射MIA 法制備KOA 慢性疼痛大鼠模型。用無菌生理鹽水將MIA配制成濃度為80 mg/mL溶液，置于-20 ℃避光保存。用小動物吸入麻醉機對大鼠進行異氟烷吸入麻醉，剔除大鼠左后肢毛發(fā)，局部常規(guī)消毒后，用微量注射器向大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射50 μL MIA，注射完畢后屈伸膝關(guān)節(jié)10次，使MIA均勻分布于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，鹽水組向膝關(guān)節(jié)腔注射50 μL無菌生理鹽水?？瞻捉M不予處理。

1.4 干預

注射后第15日，對電針組和CB2R阻斷＋電針組大鼠“陽陵泉”“內(nèi)膝眼”行電針干預，參照《實驗針灸學》和《腧穴名稱與定位》進行定位，取穴均為左側(cè)（造模側(cè)）。使用0.18 mm×13 mm一次性針灸針于“陽陵泉”“內(nèi)膝眼”直刺3～5 mm，常規(guī)提插捻轉(zhuǎn)后，分別接電針正、負極，疏密波2/100 Hz，強度1～2 mA，以大鼠局部肌肉輕微抖動、安靜不掙扎為度，每次15 min，1次/d，5次為1個療程，共2個療程（10次），每個療程結(jié)束后間歇1 d，進行痛性行為學測定，再進行下一療程的治療。CB2R阻斷＋電針組先按2 mg/kg腹腔注射AM630（1.6 μg/μL），10 min后再進行電針干預，干預方式同電針組。CB2R阻斷組僅予2 mg/kgAM630腹腔注射。空白組、鹽水組、模型組和CB2R阻斷組不予干預。

1.5 痛性行為學測定

分別于MIA注射前1 d，注射后7、14 d，以及電針干預1個療程后（20 d）、2個療程后（26 d）進行大鼠痛性行為學測定，包括機械痛超敏測定和后肢負重能力測定。機械痛超敏測定：安靜環(huán)境中，室溫（24±2）℃，將大鼠置于底為不銹鋼網(wǎng)格、籠體為有機塑料的足底測試平臺，待大鼠適應20 min后，使用直徑為0.8 mm的電子測試探頭垂直刺激大鼠左后足底中心區(qū)域，刺激力度均勻且逐漸增大，直至大鼠出現(xiàn)縮爪躲避反應，記錄電子屏讀數(shù)，即為大鼠左側(cè)機械痛縮足閾，每只大鼠間隔10 min測1次，連續(xù)測量3次，取平均值作為最終結(jié)果。后肢負重能力測定：安靜環(huán)境中，室溫（24±2）℃，將大鼠置于特制的有機玻璃格子內(nèi)，前肢趴在格子斜面上，后肢分別放在2個獨立的重量測試傳感器上，待大鼠安靜后，采用后肢平衡測痛儀測定后肢負重能力，記錄左、右后肢負重值。每只大鼠連續(xù)測量3次，取平均值進行計算，以左后肢負重值÷右后肢負重值×100%表示大鼠左后肢負重能力。

1.6 取材

最后一次行為學測定結(jié)束后，大鼠禁食24 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸，暴露心臟，將鈍性注射針頭經(jīng)左心室插入升主動脈根部，同時剪開右心耳，經(jīng)注射針頭快速滴入預冷的生理鹽水進行灌注，待大鼠肺完全變白后，用4%多聚甲醛灌注固定，取L～L左側(cè)脊髓組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm）、制片，用于免疫熒光檢測。

1.7 免疫熒光單標法檢測

石蠟切片脫蠟，水化，枸櫞酸緩沖液熱修復法抗原修復15 min，血清室溫封閉30 min，滴加CB2R一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加FITC標記羊抗小鼠IgG（1∶100），37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI 避光孵育5 min染細胞核，PBS沖洗后加抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下采集圖像，每張切片隨機選取3～5個視野，Image J軟件計算CB2R平均光密度。

1.8 免疫熒光雙標法檢測

石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復、血清封閉（方法同前）后，滴加NeuN 一抗（1∶50），4 ℃孵育過夜，滴加Cy3標記羊抗兔IgG（1∶100），37 ℃避光孵育1 h。滴加CB2R、p-P38、p-ERK 一抗（均為1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加FITC標記羊抗小鼠IgG（1∶100），37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，PBS沖洗后加抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下采集圖像，每張切片隨機選取3～5 個視野，以CB2R/NeuN、p-P38/NeuN、p-ERK/NeuN雙染陽性細胞數(shù)分別表示CB2R、p-P38和p-ERK在脊髓背角神經(jīng)元的定位表達。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 電針對模型大鼠痛性行為學的影響

MIA注射后，大鼠左側(cè)機械痛縮足閾及左后肢負重能力持續(xù)下降，14 d后維持在較低水平，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）；電針干預后（20 d、26 d），與模型組比較，電針組、CB2R阻斷＋電針組大鼠左側(cè)機械痛縮足閾及左后肢負重能力明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01），且電針組明顯優(yōu)于CB2R 阻斷＋電針組（＜0.05，＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠不同時點左側(cè)機械痛縮足閾和左后肢負重能力比較（，每組8只）

2.2 電針對模型大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R陽性表達（免疫熒光染色，×400）

圖3 各組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R表達比較（，每組4只）

2.3 電針對模型大鼠左側(cè)脊髓背角神經(jīng)元CB2R、p-P38、p-ERK表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R/NeuN、p-P38/NeuN、p-ERK/NeuN雙染陽性細胞數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R/NeuN雙染陽性細胞數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01），電針組和CB2R阻斷＋電針組大鼠左側(cè)脊髓背角p-P38/NeuN 和p-ERK/NeuN 雙染陽性細胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01，＜0.05）。見圖4～圖7。

圖4 各組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R/NeuN、p-P38/NeuN、p-ERK/NeuN陽性表達比較（，每組4只）

圖5 各組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R/NeuN陽性表達（免疫熒光染色）

圖6 各組大鼠左側(cè)脊髓背角p-P38/NeuN陽性表達比較（免疫熒光染色）

圖7 各組大鼠左側(cè)脊髓背角p-ERK/NeuN陽性表達（免疫熒光染色）

3 討論

KOA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，現(xiàn)代醫(yī)家多稱其為“膝痹”。因發(fā)病機制不明，目前尚缺乏能夠控制關(guān)節(jié)退變的有效措施，治療集中在改善癥狀方面。電針可有效緩解KOA患者疼痛癥狀，改善關(guān)節(jié)功能。多選取膝關(guān)節(jié)局部穴位以疏通經(jīng)氣，如陽陵泉、內(nèi)膝眼、犢鼻、血海、足三里、陰陵泉、鶴頂、梁丘、阿是穴等。

KOA初期主要表現(xiàn)為急性疼痛，以關(guān)節(jié)局部病理變化及傷害性感受器外周敏化為主。隨著病情發(fā)展，病變關(guān)節(jié)炎性刺激不斷傳入，脊髓背角感覺神經(jīng)元處于超敏狀態(tài)，導致來自關(guān)節(jié)局部或遠離關(guān)節(jié)部位的正常刺激也可引發(fā)劇烈疼痛，這一過程稱為脊髓中樞敏化，是KOA慢性疼痛形成的重要神經(jīng)學基礎。KOA慢性疼痛患者多表現(xiàn)出脊髓中樞敏化的特征，其疼痛范圍往往超出關(guān)節(jié)區(qū)域，且關(guān)節(jié)及整個下肢的壓痛閾顯著下降。MIA關(guān)節(jié)腔注射是復制嚙齒類動物KOA慢性疼痛模型的經(jīng)典方法，注射14 d后可出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛性質(zhì)的痛性行為。本研究結(jié)果顯示，MIA誘導后，模型大鼠左側(cè)機械痛縮足閾和后肢負重能力明顯降低，電針組大鼠左側(cè)機械痛縮足閾及后肢負重能力明顯升高，提示電針可抑制大鼠痛性行為。

研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在KOA大鼠脊髓痛覺通路敏化中呈現(xiàn)出適應性變化，表現(xiàn)為脊髓內(nèi)源性大麻素含量顯著升高，并通過作用于CB2R發(fā)揮疼痛抑制作用，CB2R高表達的轉(zhuǎn)基因KOA小鼠痛性行為明顯減少，表明CB2R活化對脊髓痛覺通路敏化具有抑制作用。MAPK家族的P38和ERK在神經(jīng)病理性疼痛過程中具有調(diào)控作用，MIA誘導的KOA大鼠痛性行為與大鼠脊髓p-P38和p-ERK高表達密切相關(guān)。本實驗中，模型組大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R表達呈適應性上調(diào)，電針可上調(diào)模型大鼠左側(cè)脊髓背角CB2R表達及CB2R在脊髓背角感覺神經(jīng)元表達，同時下調(diào)p-P38和p-ERK在脊髓背角感覺神經(jīng)元的表達。阻斷CB2R后，電針對模型大鼠痛性行為及脊髓背角感覺神經(jīng)元p-P38和p-ERK表達仍有抑制作用，且與電針組比較差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05，＜0.01），表明電針可能通過激活CB2R抑制p-P38和p-ERK表達。

綜上，電針“陽陵泉”“內(nèi)膝眼”可抑制KOA大鼠痛性行為，減輕脊髓中樞敏化，其作用機制與激活脊髓背角CB2R、抑制P38/ERK活化有關(guān)。