基于多酚類(lèi)和嘌呤類(lèi)代謝表型的沿河古茶樹(shù)紅茶適制性評(píng)估

方仕茂，戴宇樵，楊 婷，田小強(qiáng)，田洪軍，劉忠英，潘 科*

1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；

2. 沿河土家族自治縣生態(tài)茶發(fā)展和技術(shù)指導(dǎo)中心，貴州 沿河 565300

沿河縣擁有豐富的古茶樹(shù)資源。2016年，中國(guó)茶葉流通協(xié)會(huì)授予沿河縣“中國(guó)古茶樹(shù)之鄉(xiāng)”稱(chēng)號(hào)，全縣茶葉面積達(dá)1.33萬(wàn)hm2[1]。根據(jù)已有古茶樹(shù)資源調(diào)查結(jié)果，該縣下轄思渠、黃土、新景、客田、塘壩、后坪和洪渡等8個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）35個(gè)村共有古茶樹(shù)4萬(wàn)余株[2]。該地區(qū)古茶樹(shù)類(lèi)型主要分為喬木型和灌木型[3]。不同樹(shù)型古茶樹(shù)鮮葉內(nèi)含成分具有一定差異[4-5]。目前沿河縣茶企利用古茶樹(shù)資源開(kāi)發(fā)古樹(shù)紅茶、古樹(shù)綠茶和古樹(shù)白茶等產(chǎn)品，對(duì)部分古茶樹(shù)鮮葉加工技術(shù)進(jìn)行了探究[6-8]，但對(duì)縣域內(nèi)不同區(qū)域古茶樹(shù)鮮葉內(nèi)含成分及區(qū)域內(nèi)產(chǎn)品差異缺乏分析。

茶鮮葉中的多酚類(lèi)與嘌呤類(lèi)物質(zhì)是評(píng)估其適制性的重要物質(zhì)，同時(shí)也是影響茶葉色香味品質(zhì)形成的關(guān)鍵物質(zhì)[9-10]，多酚含量等指標(biāo)通常用于品種的選育[4]。古茶樹(shù)由于其樹(shù)齡及管護(hù)條件不同（如修剪等）呈現(xiàn)一定代謝差異[11]，且在基因表達(dá)方面亦有不同[12]。此外，不同季節(jié)茶樹(shù)新梢積累的多酚和嘌呤堿影響著茶葉的適制性；一般而言，夏茶或秋茶較春茶含有更高的酯型兒茶素和咖啡堿，制成相同的茶類(lèi)其茶湯苦澀味更重。將夏秋茶鮮葉用于加工發(fā)酵類(lèi)型茶類(lèi)（如紅茶、黑茶或白茶等），可避免苦澀味重影響茶葉價(jià)值。古茶樹(shù)資源稀缺，古樹(shù)春茶產(chǎn)量有限，為提高資源利用程度，增加古茶樹(shù)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)秋季灌木型古茶樹(shù)鮮葉加工紅茶品質(zhì)進(jìn)行評(píng)估十分必要。

本研究利用HPLC技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析不同樹(shù)型（喬木型和灌木型）、區(qū)域及季節(jié)的古茶樹(shù)茶鮮葉和干茶中多酚類(lèi)、嘌呤類(lèi)等物質(zhì)含量差異，以評(píng)估古茶樹(shù)鮮葉的紅茶適制性，可為沿河縣古茶樹(shù)資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 茶樣收集

2020年4月1 ～ 17日于后坪鄉(xiāng)和客田鎮(zhèn)收集喬木型一芽二葉鮮葉，于塘壩鎮(zhèn)和新景鎮(zhèn)收集灌木型一芽二葉鮮葉。每次從收集茶青中代表性扦取450 g，并均分3份，用鋁箔紙裝裹，浸入液氮5 min，隨后轉(zhuǎn)入干冰，保存于-80℃冰箱，直至真空冷凍干燥45 h。干茶為收集的部分古茶樹(shù)鮮葉經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥加工而成，生物學(xué)取樣3份，每份約250 g。同年9月20 ～ 23日收集沿河縣塘壩鎮(zhèn)秋季紅茶樣，加工和取樣方法與春茶取樣一致。所有樣品均經(jīng)研磨，過(guò)40目篩。

1.2 主要儀器與試劑

LC2030C Plus 高效液相色譜儀（日本Shimadzu公 司）， 配 備XBridge BEH C18 Column, 130?, 5μm, 4.6 mm×250 mm, 1/pkg 色譜柱（美國(guó)Waters公司）。乙腈和甲醇均為色譜級(jí)（美國(guó)Tedia公司）。沒(méi)食子酸（GA）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、(+) -兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、咖啡堿（CAF）、綠原酸（CA）和可可堿（TB）標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Cato Research Chemicals Inc.）。茶黃素（TF1）、茶黃素-3-單沒(méi)食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3'-單沒(méi)食子酸酯（TF-3'-G）和茶黃素-3,3'-雙沒(méi)食子酸酯（TFDG）（上海源葉生物技術(shù)公司）。乙腈、甲醇和乙酸（色譜級(jí)，美國(guó)Tedia公司）。

1.3 HPLC分析

兒茶素類(lèi)、酚酸類(lèi)和嘌呤堿類(lèi)化合物提取、檢測(cè)基于GB/T 8313—2018方法執(zhí)行。茶黃素類(lèi)化合物提取檢測(cè)基于GB/T 30483—2013方法執(zhí)行。繪制濃度（x軸）與同一保留時(shí)間的峰值面積（y軸）的關(guān)系，構(gòu)建每一單標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖?？們翰杷兀═Cs）含量等于各兒茶素即C、GC、EGCG、GCG、EC、EGC、ECG含量之和。茶黃素類(lèi)（TFs）含量等于TF1、TF-3-G、TF-3'-G和TFDG含量之和。

1.4 感官審評(píng)

參照GB/T 23776—2009進(jìn)行。審評(píng)人員5人，其中3女2男，均為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所研究人員，且均具有高級(jí)審評(píng)員資格。

1.5 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)均基于LabSolutions工作站獲取，進(jìn)一步的分析和圖表可視化通過(guò)Excel、IBM SPSS Statistics和Origin 2017 64Bit軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 不同樹(shù)型古茶樹(shù)茶鮮葉內(nèi)含成分差異

如圖1，喬木型古茶樹(shù)鮮葉中咖啡堿（41.04±3.62）和可可堿（4.31±0.47）含量均分別顯著高于灌木型的38.44±2.63 mg/g和3.22±0.97 mg/g。綠原酸和沒(méi)食子酸是茶葉中兩個(gè)典型的酚酸化合物，其含量在喬木和灌木鮮葉中的含量無(wú)顯著差異，值得注意的是在喬木鮮葉中綠原酸的組內(nèi)含量差異較大（2.73±0.79 mg/g）。

兒茶素是茶葉中含量最豐富的物質(zhì)[13]，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和貢獻(xiàn)的滋味特征不同，分酯型兒茶素和非酯型兒茶素[14]。檢測(cè)結(jié)果表明：?jiǎn)棠拘凸挪铇?shù)鮮葉中兒茶素總量為210.32±15.42 mg/g，灌木型為213.29±19.66 mg/g，p = 0.612。其中，喬木型古茶樹(shù)鮮葉中酯型和非酯型兒茶素分別為 169.49±9.88 mg/g和 40.82±6.21 mg/g， 而在灌木型古茶樹(shù)鮮葉中則分別為165.60±11.61 mg/g和47.69±8.88 mg/g。對(duì)比分析EGCG、ECG和GCG三個(gè)酯型兒茶素含量（圖1），灌木型古茶樹(shù)鮮葉中EGCG含量（128.71±9.33 mg/g）與ECG含量（34.61±4.60 mg/g）分別顯著高于喬木型古茶樹(shù)鮮葉（119.44±9.12 mg/g、25.71±4.26 mg/g），而GCG在喬木型古茶樹(shù)鮮葉中的含量（24.34±4.26 mg/g）則顯著高于灌木型古茶樹(shù)鮮葉（2.28±1.09 mg/g）。灌木型古茶樹(shù)鮮葉中非酯型兒茶素EGC與EC顯著高于喬木，C含量則相反，GC在兩種樹(shù)型鮮葉中差異明顯。

圖1 喬木型和灌木型茶樹(shù)鮮葉多酚和嘌呤類(lèi)物質(zhì)的含量差異（獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，雙尾）Figure 1 Differences in the content of polyphenols and purines in fresh leaves of arbor type and shrub type tea trees （Independent samples t-test, two-tailed）

2.2 不同區(qū)域古樹(shù)紅茶內(nèi)含成分差異及品質(zhì)特征

對(duì)收集的新景鎮(zhèn)、客田鎮(zhèn)、后坪鄉(xiāng)和塘壩鎮(zhèn)的古樹(shù)紅茶樣中酚類(lèi)和嘌呤類(lèi)含量結(jié)合主成分方法進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。如圖2D可知，基于19個(gè)化合物×69個(gè)樣品數(shù)據(jù)矩陣的主成分分析，共提取特征值大于1的有效主成分3個(gè)，其特征值分別為9.978、3.379和2.247（圖2D-b）。前三個(gè)主成分累計(jì)解釋方差大于82%，其中第一主成分PC1解釋方差為52.515%，第二主成分PC2=17.785%，第三主成分PC3=11.825%（圖2D-a）。由載荷圖2A、圖2B可知，PC1主要由茶黃素（正相關(guān)）和酯型兒茶素（負(fù)相關(guān)）貢獻(xiàn)，PC2則由非酯型兒茶素貢獻(xiàn)（圖2A中的圓點(diǎn)即陰影部分），PC3對(duì)于區(qū)域樣品的區(qū)分不明顯（圖2A、圖2B中的三角形）。由圖2C可知，沿河縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)由于古茶樹(shù)鮮葉加工的紅茶內(nèi)含成分存在差異，且后坪鄉(xiāng)和塘壩鎮(zhèn)紅茶樣得到明顯的區(qū)分。新景鎮(zhèn)的茶樣與塘壩鎮(zhèn)樣品接近，客田鎮(zhèn)的樣品則與后坪鄉(xiāng)的樣品聚類(lèi)明顯。

圖2 主成分分析Figure 2 Principal component analysis

根據(jù)我們收集的樣品類(lèi)型可以推測(cè)后坪鄉(xiāng)和客田鎮(zhèn)的古茶樹(shù)鮮葉為大葉種或形態(tài)學(xué)接近喬木，而新景鎮(zhèn)和塘壩鎮(zhèn)以灌木型為主，因此在鮮葉內(nèi)含成分上有一定差異（圖1）。其次，不同區(qū)域的加工工藝差異，或進(jìn)一步促進(jìn)不同區(qū)域古樹(shù)紅茶樣的內(nèi)含成分差異[15]，使得后坪鄉(xiāng)和塘壩鎮(zhèn)的古樹(shù)紅茶樣品在PC1上得到很好的區(qū)分，即后坪鄉(xiāng)的紅茶樣相較于塘壩鎮(zhèn)的紅茶樣含有更高的茶黃素類(lèi)物質(zhì)和含量較少的酯型兒茶素。

2.3 不同季節(jié)古茶樹(shù)鮮葉紅茶適制性

咖啡堿是賦予茶湯苦澀味和收斂性的重要物質(zhì)[15]。由表2可知，咖啡堿含量在春、秋兩季的古樹(shù)紅茶中無(wú)差異（p＞0.05），但顯著高于當(dāng)季的福鼎大白茶品種制成的紅茶。已有研究表明，采用栽培型茶樹(shù)品種的春（36.558 ±5.024 mg/g）、夏（38.721 ± 6.059）茶鮮葉制成的綠茶的咖啡堿無(wú)顯著差異[16]，這可能是由于古茶樹(shù)與栽培種茶樹(shù)代謝差異導(dǎo)致的[19]，因此可推測(cè)灌木型古茶樹(shù)積累咖啡堿受不同季節(jié)影響較小，且咖啡堿積累代謝較栽培種茶樹(shù)強(qiáng)。

表2 春季和秋季古樹(shù)紅茶內(nèi)含成分差異（干重 mg/g）Table 2 Differences in the contents of ancient tree black tea in spring and autumn（dry weight mg/g）

春季古茶樹(shù)紅茶中非酯型兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量和茶黃素總量顯著高于同季福鼎大白茶和秋季茶樣，進(jìn)一步的對(duì)比分析古茶樹(shù)秋茶的非酯型兒茶素和茶黃素總量與春茶沒(méi)有顯著差異，由于茶黃素對(duì)于紅茶茶湯的色澤和豐富度貢獻(xiàn)較大[17]，秋茶在茶湯湯色豐富度方面與春茶接近（表3）。此外，古茶樹(shù)秋茶酯型兒茶素（16.72±0.16 mg/g）顯著低于古茶樹(shù)春茶（44.20±10.74 mg/g），這與已有的夏秋季鮮葉酯型兒茶素積累較春茶多的研究報(bào)道不一致[15,18]。感官審評(píng)結(jié)果表明，夏秋古茶樹(shù)鮮葉加工的紅茶滋味特征與春茶均表現(xiàn)為甜醇等特點(diǎn)，無(wú)明顯的苦澀味。值得注意的是，古茶樹(shù)春茶中由于取樣數(shù)量較多（7次加工收集樣品），組內(nèi)差異較大，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，從而使得部分組間比較結(jié)果差異不明顯或明顯?？偠灾?，試驗(yàn)結(jié)果表明，夏秋古茶樹(shù)鮮葉具有潛在的利用價(jià)值，但仍需進(jìn)一步評(píng)估春、秋季紅茶鮮味物質(zhì)和香氣特征。

表3 春、秋季節(jié)灌木型古樹(shù)紅茶感官審評(píng)Table 3 Sensory evaluation results of shrub type ancient tree black tea in spring and autumn

3 結(jié)論和討論

沿河縣古茶樹(shù)資源豐富，資源利用潛力大。但由于該縣域內(nèi)古茶樹(shù)分布廣，各區(qū)域品質(zhì)差異較大。此外，由于樹(shù)型差異，茶鮮葉質(zhì)量不均勻，限制了資源的開(kāi)發(fā)利用。本研究明確了喬木型和灌木型古茶樹(shù)鮮葉中的多酚類(lèi)和嘌呤堿類(lèi)物質(zhì)的代謝差異特點(diǎn)，并以灌木型古茶樹(shù)鮮葉加工紅茶探究不同區(qū)域紅茶的品質(zhì)特征，對(duì)比分析了不同季節(jié)加工成的紅茶品質(zhì)差異。

大尺度區(qū)域條件下古茶樹(shù)資源的品質(zhì)成分分析已得到報(bào)道[5,19]，同時(shí)從基因水平分析古茶樹(shù)的代謝特點(diǎn)[12]。由于古茶樹(shù)的樹(shù)齡及環(huán)境影響，使得其代謝特征與栽培中有所差異[20]。此外，古茶樹(shù)在不同季節(jié)的代謝物變化與栽培種亦有差異，研究表明栽培種在春、夏、秋三季的苦澀類(lèi)物質(zhì)增加，而鮮味物質(zhì)減少[17]。本研究結(jié)果表明，古茶樹(shù)鮮葉酯型兒茶素和咖啡堿等物質(zhì)隨著季節(jié)變化不顯著。加工是影響古茶樹(shù)品質(zhì)的另一重要因素，通過(guò)合適的加工方式可以重塑茶葉產(chǎn)品品質(zhì)，因而可以規(guī)避不同茶鮮葉品質(zhì)、區(qū)域以及季節(jié)影響，實(shí)現(xiàn)品質(zhì)保障。對(duì)古茶樹(shù)資源的適制性評(píng)估，僅從多酚及嘌呤類(lèi)含量評(píng)估是不完備的，還需評(píng)估古茶樹(shù)中游離氨基酸、糖類(lèi)及揮發(fā)性物質(zhì)等在不同樹(shù)型、區(qū)域和季節(jié)的差異，同時(shí)還需系統(tǒng)評(píng)估加工因素對(duì)其品質(zhì)的影響。