殺鮭氣單胞菌溶血素和菌毛蛋白的重組表達(dá)及其免疫保護(hù)效果研究*

李 樂，刁 菁，于曉清，王曉璐，王友紅，葉海斌，吳海一

(山東省海洋科學(xué)研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266104)

0 引言

殺鮭氣單胞菌是魚類養(yǎng)殖過程中危害比較嚴(yán)重的一種細(xì)菌性病原，包括殺鮭亞種Aeromonassalmonicidasubsp.salmonicida、無色亞種A.salmonicidasubsp.achromogenes、殺日本鮭亞種A.salmonicidasubsp.masoucida(ASM)、史氏亞種A.salmonicidasubsp.smithia和溶果膠亞種A.salmonicidasubsp.pectinolytica[1]，其中殺鮭亞種能引起冷水魚的“癤瘡病”，發(fā)病率和死亡率高，其他亞種致病力相對(duì)較弱，但是具有更廣泛的宿主范圍，能感染鯉魚、河鱸、六線魚、大菱鲆、大西洋鱈、裸蓋魚等多種重要養(yǎng)殖魚類[2,3]，并且可與其他氣單胞菌屬混合感染，對(duì)我國魚類養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)我國冷水魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展造成重大的潛在威脅，因此有關(guān)該病的防治技術(shù)研究亟待開展。在養(yǎng)殖魚類病害防控方面，以疫苗免疫技術(shù)為基礎(chǔ)的綜合防控技術(shù)體系是目前被國際上認(rèn)可、接受并積極推廣的病害防治技術(shù)[4]，挪威、美國等發(fā)達(dá)國家均有商品化的殺鮭氣單胞菌疫苗，該疫苗的使用大大降低了抗生素的使用，并有效控制疾病的發(fā)生[5]。目前，我國殺鮭氣單胞菌疫苗的研制大多仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，而且主要以福爾馬林滅活的滅活疫苗為主[6]，雖然能使魚體獲得一定的免疫保護(hù)力，但在安全性方面存在一定的隱患，隨著對(duì)該菌病原特性和致病機(jī)理的深入研究以及蛋白體外重組表達(dá)技術(shù)的成熟，研發(fā)安全高效的亞單位疫苗也越來越受到重視和推進(jìn)。

生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使基于反向疫苗學(xué)開發(fā)殺鮭氣單胞菌基因工程亞單位疫苗具備了理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段[7]，迄今已有多株殺鮭氣單胞菌的全基因組被系統(tǒng)解析，并對(duì)其重要的毒力相關(guān)基因與蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)[8-10]，通過對(duì)重要候選靶標(biāo)蛋白進(jìn)行原核重組表達(dá)和免疫保護(hù)性試驗(yàn),篩選到多個(gè)具有較高免疫保護(hù)率的亞單位候選蛋白，其中溶血素型鈣結(jié)合區(qū)蛋白表現(xiàn)出較高的潛在開發(fā)價(jià)值[11]。本課題組前期也針對(duì)多個(gè)殺鮭氣單胞菌外膜蛋白研究篩選具有免疫保護(hù)效果的亞單位候選蛋白，結(jié)果顯示重組外膜蛋白C可以有效誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答，并提供最佳的免疫保護(hù)效果[12]。因而，基于反向疫苗學(xué)研究篩選殺鮭氣單胞菌亞單位疫苗切實(shí)可行。

溶血素(Hemolysin)是一類具有溶血活性的蛋白質(zhì)，是氣單胞菌重要的毒力因子，而菌毛(Pilin)在細(xì)菌的侵染和定植過程中也發(fā)揮重要作用。因此，本研究擬利用體外重組表達(dá)技術(shù)，對(duì)殺鮭氣單胞菌兩個(gè)潛在毒力相關(guān)蛋白溶血素和菌毛蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，以虹鱒為研究對(duì)象檢測(cè)其免疫保護(hù)效果，并分析其對(duì)虹鱒免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用，以期為魚類細(xì)菌亞單位疫苗的研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及試驗(yàn)動(dòng)物

致病性殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種Aeromonassalmonicidasubsp.masoucida由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從患病虹鱒中分離保存[13]；健康虹鱒購自濰坊某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(13±2) cm，體質(zhì)量為(60±5)g，實(shí)驗(yàn)前循環(huán)水暫養(yǎng)15 d，養(yǎng)殖水溫為(17±1)℃。

1.1.2 試劑和耗材

重組表達(dá)試劑盒pDE2 Directional Expression Kit Ver.2購自北京擎科生物科技有限公司；DNA提取試劑盒MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、RNA提取試劑盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、cDNA合成試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit及熒光定量PCR試劑SYBR? Premix Ex Taq Mix均購于TaKaRa公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和PVDF膜購自德國Merk Millipore；虹鱒抗滅活A(yù).salmonicida血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；鼠抗虹鱒IgM單克隆抗體購自Aquatic Diagnostics；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷購自南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE等其它試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶血素和菌毛蛋白的原核重組表達(dá)與純化

采用試劑盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit方法提取殺鮭氣單胞菌總DNA，以此為模板，依據(jù)Genbank庫中殺鮭氣單胞菌溶血素及菌毛的基因序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(表1)，對(duì)目的基因擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序。序列驗(yàn)證無誤后將2種蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收進(jìn)行純化，利用pDE2 Directional Expression Kit分別構(gòu)建pET28-hly及pET28-Pln表達(dá)載體，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，于不含卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇并轉(zhuǎn)接于LB平板培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行T7和T7ter雙向測(cè)序比對(duì)序列，將序列正確的重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli細(xì)胞(BL21，DE3)，涂布含卡那霉素的平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR并對(duì)陽性菌落進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的陽性菌用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以Ni2+親和層析柱(GE)分別純化重組溶血素和重組菌毛蛋白，將純化蛋白以0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.2)重懸并以Bradford法測(cè)定蛋白濃度，將濃度調(diào)整至1 mg/mL凍存?zhèn)溆?。同時(shí)，利用SDS-PAGE分析蛋白重組表達(dá)及純化結(jié)果。

表1 溶血素及菌毛蛋白基因擴(kuò)增引物信息

1.2.2 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫原性測(cè)定

利用Western-blotting分析重組蛋白的免疫原性。將上述純化后的重組溶血素和重組菌毛蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，然后浸泡于含4%牛血清白蛋白的PBS溶液中，4℃封閉過夜，用PBST(含0.05%Tween-20的PBS溶液)洗滌3次后，分別用虹鱒抗滅活A(yù)SM血清和健康虹鱒血清(1∶50)于37℃孵育1 h，洗滌后加入鼠抗虹鱒IgM單克隆抗體(1∶50)于37℃孵育1 h，洗滌后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶5 000)于37℃孵育1 h，最后將PVDF膜置于NBT-BCIP發(fā)色液中發(fā)色，以去離子水洗滌終止反應(yīng)，觀察并拍照。

1.2.3 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫保護(hù)效果測(cè)定

將健康虹鱒隨機(jī)分為5組，每組30尾魚，用上述純化后的重組溶血素、重組菌毛蛋白及兩者1∶1(W∶W)混合物、甲醛滅活的殺鮭氣單胞菌全菌分別與弗氏完全佐劑1∶1(V∶V)混合后，免疫健康虹鱒，以注射PBS和佐劑混懸液作為陰性對(duì)照，每尾腹腔注射100 μL。免疫6周后，依據(jù)前期毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]，選擇濃度為5×107CFU/mL殺鮭氣單胞菌進(jìn)行攻毒，每尾腹腔注射100 μL，連續(xù)觀察21 d并記錄攻毒后魚體的死亡情況，計(jì)算免疫組的相對(duì)免疫保護(hù)率(Relative Percentage Survival,RPS)。

1.2.4 虹鱒對(duì)重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫應(yīng)答特性

1.2.4.1 免疫、攻毒及取樣

將健康虹鱒隨機(jī)分為4組，每組20尾魚，分別用上述純化后的重組溶血素、重組菌毛蛋白及兩者1∶1 (W∶W)混合物、PBS與弗氏完全佐劑等體積混合后，免疫健康虹鱒。在免疫后2，4，6周，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3尾魚制備抗血清用于特異性抗體水平檢測(cè)，血清的取樣方式為尾靜脈取血，室溫放置2 h后，轉(zhuǎn)入4℃過夜，次日于4℃下3 000 g離心15 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，在免疫后6周用殺鮭氣單胞菌對(duì)虹鱒進(jìn)行攻毒，方法同1.2.3節(jié)。攻毒后24 h，每組取樣6尾魚，用無菌剪刀剪下脾臟并切成0.5 cm小塊置于RNA later中-80℃保存，用于免疫相關(guān)基因表達(dá)特性研究。

1.2.4.2 ELISA檢測(cè)虹鱒外周血特異性抗體水平變化

分別將重組溶血素和重組菌毛蛋白包被于96孔酶標(biāo)板中，每孔50 μg，4℃靜置過夜，次日用含4%牛血清白蛋白的PBS溶液于37℃封閉1 h，PBST洗滌3次后，分別加入100 μL免疫后不同時(shí)間點(diǎn)收集的虹鱒血清(1∶100)，37℃孵育1 h，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，洗滌后依次加入100 μL鼠抗虹鱒IgM單克隆抗體(1∶50)和100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶5 000)，孵育條件均為37℃，1 h，最后加入100 μL pNPP底物發(fā)色液室溫避光發(fā)色30 min，每孔加入50 μL 2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀(Tecan) 405 nm處讀取OD值。以PBS免疫組血清作為陰性對(duì)照，吸光值P/N>2時(shí)的待測(cè)血清最大稀釋度作為各時(shí)間點(diǎn)血清樣品的效價(jià)。

1.2.4.3 熒光定量PCR檢測(cè)虹鱒脾臟免疫相關(guān)基因表達(dá)情況

利用熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)各免疫組虹鱒在殺鮭氣單胞菌攻毒后24 h，脾臟中9種免疫相關(guān)基因表達(dá)情況。9種免疫相關(guān)基因白介素1β (IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、干擾素(TNFα)、主要組織相容復(fù)合物Ⅱα(MHC-Ⅱα)、免疫球蛋白M重鏈(IgM)、T淋巴細(xì)胞受體α鏈(TCRα)、T細(xì)胞CD4分子和CD8分子以及內(nèi)參基因18S rRNA的引物信息如表2所示。利用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，提取虹鱒脾臟組織的總RNA，以High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit參照說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，qPCR反應(yīng)體系為SYBR? Premix Ex Taq Mix，反應(yīng)在CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio rad，USA)中進(jìn)行，以各免疫組攻毒前脾臟樣品作為參照，按照2-ΔΔCt法分析各基因在攻毒后24 h的相對(duì)表達(dá)情況。

表2 熒光定量PCR所用引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(Version 20.0，IBM)，通過單因素方差分析(ANOVA)分析差異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，在所有情形中，若P<0.05，則認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶血素和菌毛蛋白的原核重組表達(dá)與純化結(jié)果

將擴(kuò)增獲得的A.salmonicida溶血素和菌毛蛋白基因分別插入表達(dá)載體pET28，構(gòu)建了pET28-hly及pET28-Pln表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，最終篩選獲得表達(dá)工程菌各4株，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，最終獲得分子量分別為70,10 kDa的目的蛋白，與理論分子量大小相符。經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，獲得了高純度的重組溶血素和重組菌毛蛋白(圖1，泳道1，2)，可用于后續(xù)免疫。

2.2 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫原性分析

為了驗(yàn)證2種重組蛋白的免疫原性，利用Western-blotting實(shí)驗(yàn)分析了重組溶血素和重組菌毛蛋白與虹鱒抗ASM血清的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的虹鱒抗滅活A(yù)SM血清可與兩種重組蛋白發(fā)生陽性反應(yīng)(圖1，泳道3，4)，說明這兩種重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，能有效誘導(dǎo)魚體分泌產(chǎn)生特異性抗體。

2.3 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫保護(hù)效果比較分析

免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，在攻毒后4 d PBS對(duì)照組魚體開始死亡，死亡率在兩周內(nèi)迅速升高，累積死亡率于16 d達(dá)到最高96%，而免疫組與對(duì)照組相比死亡率顯著降低，注射重組溶血素、重組菌毛蛋白及兩者1∶1 (W∶W)混合物、甲醛滅活全菌魚體的最終累積死亡率分別為34%、60%、24%和20%，其對(duì)虹鱒的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為64.6%、37.5%、75.0%和79.2%(圖2)，其中重組溶血素對(duì)虹鱒的免疫保護(hù)效果顯著高于重組菌毛蛋白，將兩者混合共免疫虹鱒的免疫保護(hù)效果最高。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化的重組溶血素；2：純化的重組菌毛蛋白；3：虹鱒抗滅活A(yù)SM血清與重組溶血素的反應(yīng)結(jié)果；4：虹鱒抗滅活A(yù)SM血清與重組菌毛蛋白的反應(yīng)結(jié)果

圖2 不同免疫組對(duì)虹鱒抗殺鮭氣單胞菌感染的免疫保護(hù)效果

2.4 ELISA檢測(cè)免疫后特異性抗體水平變化

ELISA結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，重組溶血素和重組菌毛蛋白單獨(dú)免疫組虹鱒均能有效誘導(dǎo)抗各自抗原的特異性抗體水平，在免疫后2周兩者的特異性抗體水平均顯著高于對(duì)照組(P>0.05)，其水平在免疫后6周內(nèi)逐漸升高；重組溶血素和重組菌毛蛋白共免疫組虹鱒血清中抗重組溶血素或重組菌毛蛋白特異性抗體水平在免疫后6周內(nèi)也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，其中抗重組菌毛蛋白抗體水平與重組菌毛蛋白單獨(dú)免疫組不存在顯著性差異變化，但抗重組溶血素抗體水平顯著高于重組溶血素單獨(dú)免疫組(圖3)。

不同字母標(biāo)注代表組間存在顯著性差異(P<0.05)

2.5 重組溶血素和重組菌毛蛋白誘導(dǎo)虹鱒的免疫相關(guān)基因表達(dá)特性

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)免疫組中IL-6、IL-8、TCR及CD4基因的表達(dá)水平均高于PBS對(duì)照組，其中重組溶血素與重組菌毛蛋白共免疫組中IL-6、CD4、MHC-Ⅱ及IgM基因表達(dá)水平顯著高于其他免疫組，另外發(fā)現(xiàn)重組菌毛蛋白免疫組中IL-6和IL-8基因表達(dá)水平顯著高于重組溶血素免疫組(圖4)。

*代表表達(dá)水平顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.05)，不同字母代表各免疫組組間表達(dá)水平存在顯著性差異(P<0.05)，水平基線表示將PBS對(duì)照組各基因的表達(dá)水平設(shè)定為1

3 討論

亞單位由于其抗原組分特異單一，可誘導(dǎo)宿主針對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)抗原產(chǎn)生特異性抗體，且具有安全性高、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，已成為疫苗研究重要方向之一[14]。利用生物信息學(xué)分析病原微生物的毒力相關(guān)因子，結(jié)合運(yùn)用反向疫苗學(xué)技術(shù)研究篩選具有免疫保護(hù)效果的候選靶標(biāo)抗原，已成為亞單位疫苗研發(fā)的重要技術(shù)途徑[15,16]。目前，在該技術(shù)的應(yīng)用下已針對(duì)弧菌、遲緩愛德華氏菌、鏈球菌、氣單胞菌等水產(chǎn)動(dòng)物重要病原菌，研究篩選到一大批具有較好免疫保護(hù)效果與開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的亞單位候選抗原[17-20]。本研究基于殺鮭氣單胞菌全基因組信息，分別克隆表達(dá)了與菌體毒力相關(guān)的溶血素蛋白和菌毛蛋白，通過免疫保護(hù)性試驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的免疫保護(hù)力，其中重組溶血素蛋白表現(xiàn)出較高的免疫保護(hù)效果，且能誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生較高的特異性抗體水平。溶血素作為病原菌的重要毒力因子之一，可通過與紅細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，進(jìn)而使紅細(xì)胞破裂溶解，同時(shí)能夠引起魚體明顯的細(xì)胞免疫和體液免疫[21,22]。與本研究相似，對(duì)斑點(diǎn)叉尾免疫接種重組嗜水氣單胞菌溶血素蛋白也可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生顯著的免疫保護(hù)效果[23]。另外，利用無乳鏈球菌的重組溶血素蛋白免疫羅非魚也能誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生70%的免疫保護(hù)率，免疫魚體在28 d后血清抗體效價(jià)高達(dá)1∶4 096[24]。以上結(jié)果均表明，殺鮭氣單胞菌溶血素蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果，是亞單位疫苗研發(fā)的重要候選抗原之一。

亞單位疫苗由于其組分單一，單獨(dú)免疫往往難以取得高效的免疫效果，需要輔以一定的佐劑分子以提升其免疫保護(hù)效果[25]。菌毛作為菌體重要表面抗原，參與細(xì)菌的粘附定植，與致病力有直接的相關(guān)性[26]。本研究利用殺鮭氣單胞菌重組菌毛蛋白免疫虹鱒后，能有效刺激魚體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，說明其具有一定的免疫原性，同時(shí)也能誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)效果，這與前期有關(guān)嗜水氣單胞菌菌毛蛋白的研究相似[27]，但是對(duì)比重組溶血素來說，重組菌毛蛋白誘導(dǎo)的免疫保護(hù)率相對(duì)較低。本研究還發(fā)現(xiàn)，以重組菌毛蛋白與重組溶血素混合免疫魚體后，可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生更高水平的免疫保護(hù)效果，以及更高水平抗溶血素特異性抗體，表明重組菌毛蛋白具有一定的佐劑效應(yīng)。前期研究顯示，菌毛蛋白可激活Toll樣受體信號(hào)通路，從而影響機(jī)體免疫應(yīng)答水平[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組菌毛蛋白與重組溶血素共免疫時(shí)，不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗體水平和免疫保護(hù)效果，IL-6、CD4、MHC-Ⅱ等多個(gè)參與炎癥響應(yīng)和抗原遞呈的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平也顯著高于其他免疫組，結(jié)果表明共免疫菌毛蛋白可有效提升亞單位疫苗的免疫效果。但是，本研究對(duì)兩種重組蛋白僅采用1∶1的比例進(jìn)行混合免疫，未能進(jìn)一步細(xì)化不同配比研究，以獲得更佳的免疫保護(hù)效果，這方面仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種的重組溶血素對(duì)虹鱒具有較好的免疫保護(hù)效果，是具有亞單位疫苗開發(fā)應(yīng)用前景的潛在靶標(biāo)抗原。重組菌毛蛋白與重組溶血素蛋白共免疫魚體可顯著提升免疫保護(hù)效果及魚體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，提示菌毛蛋白具有開發(fā)成為佐劑分子的潛在價(jià)值。研究結(jié)果將為殺鮭氣單胞菌亞單位疫苗的研究提供重要參考。