應(yīng)用宏基因組二代測序技術(shù)診斷結(jié)核病4例并文獻復(fù)習

張奕杰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 北京 100070)

結(jié)核病是由MTB復(fù)合群感染引起的慢性傳染病，不僅是世界十大致死原因之一，也是最致命的傳染病，隨著多耐藥、廣泛耐藥及全耐藥結(jié)核的日益增多，使得結(jié)核病的治療難度不斷增加，因此對于MTB的及時診斷、傳播致病及耐藥機制研究就顯得尤為重要[1]。應(yīng)用二代測序能夠鑒定結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌(NTM)以及檢測耐藥基因，可從基因組水平進行深入研究耐藥、毒力、致病機制。宏基因組學(xué)(metagenomics)是指直接從人類組織活檢和體液樣本中檢測出微生物組總DNA或RNA，分析全部微生物組成，基于二代測序的宏基因組學(xué)，簡稱mNGS。隨著測序流程優(yōu)化，成本降低，目前周期可縮短至24h以內(nèi)，可實現(xiàn)臨床快速診斷及精準治療，使得患者獲益，因此本文結(jié)合國內(nèi)外文獻以及我院4例應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷結(jié)核菌感染病例，對其應(yīng)用價值進行討論。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院呼吸與危重癥科收治的4例應(yīng)用mNGS技術(shù)作為重要臨床診斷依據(jù)確診為結(jié)核感染的患者作為病例資料，確診結(jié)核感染標準：上述送檢標本MTB培養(yǎng)陽性、涂片陽性、病理診斷為結(jié)核感染、mNGS檢測陽性等4項中至少1項符合即可確診。當至少1條read比對到種或復(fù)合群水平時，結(jié)果被認為是MTB陽性。

1.2方法:以“二代測序”或“NGS”和“結(jié)核”作為關(guān)鍵詞，在萬方數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫對2021年1月以前的中文文獻進行檢索，在PubMed數(shù)據(jù)庫以“NGS，tuberculosis”為關(guān)鍵詞檢索2021年12月以前的英文文獻，共154篇，排除會議、報紙、綜述，以文章提供了mNGS、傳統(tǒng)方法、Xpert結(jié)果為納入標準，最后共有453例確診或臨床診斷為MTB感染的臨床資料納入本研究。

2 結(jié) 果

2.1病例1:患者女性，47歲，2014年體檢時行胸部CT檢查發(fā)現(xiàn)右側(cè)胸腔積液，伴咳嗽、咳黃白痰及活動后氣短，未診治。2020年8月行胸腔超聲提示右側(cè)胸腔積液伴包裹入院?；疾∫詠頍o不適。查體：右肺呼吸音低，叩診濁音。輔助檢查：血常規(guī)提示白細胞計數(shù)12.37×109L-1，中性粒細胞絕對值10.62×109L-1，中性粒細胞相對值85.7%；2020年9月21日胸部CT：右側(cè)包裹性胸腔積液；右肺下葉局部肺組織含氣不良；右側(cè)胸膜局部增厚(圖1)；PPD試驗強陽性，胸水常規(guī)：外觀為乳糜樣渾濁液體，比重1.04，李凡他試驗陽性，胸水細胞總數(shù)27740/L，胸水白細胞數(shù)13740/L，多核細胞74%，單核細胞26%。胸水生化：腺苷脫氨酶(ADA)52U/L，乳酸脫氫酶862.8U/L，糖1.17mmoL/L，蛋白6260mg/dL；胸水甘油三酯1.74mmoL/L，胸水膽固醇10.37mmoL/L，胸水涂片抗酸染色及痰涂片抗酸染色3次均陰性；胸水mNGS提示MTB，序列數(shù)23，基因組覆蓋度6.746387%，豐度26.417%，深度1.12，考慮結(jié)核性膿胸，給予頭孢西丁聯(lián)合左氧氟沙星抗感染，口服異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，引流胸水沖洗胸腔，2020年9月27日復(fù)查胸部CT提示右側(cè)胸水明顯減少，兩肺炎癥，不除外肺結(jié)核(圖2)。

圖1 例1患者2020年9月21日胸部CT影像

圖2 例1患者2020年9月27日復(fù)查胸部CT影像

2.2病例2:患者男性，60歲，2018年體檢時發(fā)現(xiàn)胸腔積液，遂于外院行胸腔穿刺引流胸水，診斷未明確。2020年9月30日于我院體檢行胸部CT提示左肺上葉占位性病變伴周圍阻塞性炎癥，新生物不除外；右側(cè)大量胸腔積液；右肺下葉膨脹不全?；疾∫詠頍o不適。既往糖尿病史30年。查體：消瘦，營養(yǎng)不良，慢性病容，右肺叩診濁音，右側(cè)呼吸音減低。輔助檢查：血常規(guī)：白細胞絕對值3.56×109L-1，中性粒細胞絕對值2.4×109L-1；血生化：ALB 28.3g/L。于2020年10月23行右側(cè)胸腔穿刺置管引流，胸水常規(guī)：外觀黃色微濁，比重1.032，李凡他試驗陽性，細胞總數(shù)5113/L，白細胞613/L，多核細胞87%，單核細胞13%。胸水生化：ADA 14.8U/L，蛋白2000.7mg/dL，乳酸脫氫酶430.2U/L，糖0.7mmoL/L。PPD試驗陽性。2020年10月27日胸部CT：左肺上葉占位較前增大，內(nèi)伴有空洞形成，考慮肺癌不除外(圖3)。行氣管鏡檢查于右上葉前、后段及左上葉后段生理鹽水灌洗。經(jīng)超聲小探頭探查左上葉后段，遠端可見管周不規(guī)則低回聲區(qū)，于此處活檢送檢病理，未見癌細胞。2020年11月3日，BALF mNGS：MTB復(fù)合群(序列數(shù)62，豐度2.53%)，嗜肺軍團菌(序列數(shù)1，基因組覆蓋度0.002237%，豐度0.041，深度1)。后氣管鏡刷片涂片抗酸染色：抗酸染色3+。給予美羅培南聯(lián)合左氧氟沙星抗感染，考慮臨床診斷“肺結(jié)核，結(jié)核性胸膜炎”。

圖3 例2患者2020年10月27日胸部CT影像

2.3病例3:患者男性，25歲，2020年11月無誘因出現(xiàn)干咳，伴午后發(fā)熱，體溫波動在37.5～38.5℃之間，伴乏力、納差、盜汗。就診于我院發(fā)熱門診，2020年11月16日胸部CT：左肺下葉炎性實變，左側(cè)胸腔積液，心包少量積液?？紤]“肺炎”，給與“左氧氟沙星”0.5g，每日一次，口服4d，患者發(fā)熱、咳嗽未見好轉(zhuǎn)，收入我科?；颊咦园l(fā)病以來體重減輕5Kg。吸煙指數(shù)50。查體：體溫38.5℃，左下肺叩診濁音，左下肺呼吸音減低。輔助檢查：紅細胞沉降率85mm/60min，C反應(yīng)蛋白141.9mg/L，血常規(guī)：白細胞絕對值8.87×109L-1，中性粒細胞絕對值6.23×109L-1。降鈣素原0.137ng/mL，血清CA125 401.6U/mL，2020年11月24日復(fù)查胸部CT：較11月16日胸部CT左肺下葉炎性病變基本吸收，雙側(cè)胸腔積液，左側(cè)較前增多，右側(cè)新出現(xiàn)；雙側(cè)胸膜增厚；雙肺下葉部分膨脹不全，新出現(xiàn)；心包積液較前增多(圖4)。胸水常規(guī)：外觀橘黃色渾濁，比重1.036，李凡他試驗陽性，細胞總數(shù)1742/L，白細胞數(shù)1442/L，多核細胞14%，單核細胞83%。胸水生化：腺苷脫氨酶74.3U/L，蛋白4182.9mg/dL，乳酸脫氫酶1017.2U/L，白蛋白30.8g/L，糖5.9mmoL/L。2020年11月26日胸水mNGS：MTB復(fù)合群(序列數(shù)1，豐度100%)。胸水涂片抗酸染色陰性。胸水病理未見癌細胞。PPD試驗強陽性。2020年12月1日行左側(cè)內(nèi)科胸腔鏡檢查，術(shù)中可見胸膜腔臟、壁層胸膜廣泛粘連，以下肺為著，臟、壁層胸膜輕度充血，散在白色粟粒樣結(jié)節(jié)，部分胸膜表面有纖維素樣物附著(圖5)。給予左氧氟沙星、乙胺丁醇、利福平、異煙肼、吡嗪酰胺口服抗結(jié)核治療。患者體溫逐漸降至正常。胸腔鏡病理：(壁層胸膜小結(jié)節(jié))上皮樣肉芽腫性炎，小灶壞死，可見纖維素滲出，可疑結(jié)核。免疫組化結(jié)果：抗酸(+)，結(jié)合胸水mNGS結(jié)果，明確診斷為結(jié)核性胸膜炎。2020年12月9日復(fù)查胸部CT雙側(cè)胸水較前明顯吸收(圖6)。

圖4 例3患者2020年11月24日胸部CT影像

圖5 例3患者胸腔鏡下表現(xiàn)依次為：胸膜粘連；臟層胸膜白色粟粒樣結(jié)節(jié)及粘連；壁層胸膜白色粟粒樣結(jié)節(jié)

圖6 例3患者2020年12月9日胸部CT影像

2.4病例4:患者男性，77歲，2020年3月因“腸梗阻”于我院保守治療后癥狀部分好轉(zhuǎn)，此后出現(xiàn)咳嗽、咳白痰，伴憋氣、乏力，2020年4月22日突發(fā)言語不清及左側(cè)肢體無力，CRP 139.37mg/L，白細胞絕對值4.86×109L-1，中性粒百分比86.3%。胸部CT：右主支氣管痰栓；兩肺感染；左肺上葉多發(fā)磨玻璃密度結(jié)節(jié)，雙側(cè)胸膜增厚(圖7)。頭顱MRI未見異常。給予頭孢唑肟聯(lián)合依替米星抗感染?；颊呓?月體重下降10Kg。既往高血壓、糖尿病，吸煙指數(shù)800。入院后患者體溫最高38.4℃，給予美羅培南聯(lián)合甲硝唑抗感染治療，體溫未見下降，伴寒戰(zhàn)，肝功能惡化、I型呼吸衰竭，病情危重，轉(zhuǎn)入呼吸重癥監(jiān)護室，無創(chuàng)呼吸機輔助通氣，將抗生素調(diào)整為美羅培南聯(lián)合左氧氟沙星，2020年4月27日行支氣管鏡檢查，肺泡灌洗液送mNGS檢測，鏡下間左下葉外后基底段間嵴處新生物，支氣管感染，氣道內(nèi)痰栓?；顧z病理：鱗狀上皮乳頭狀增生，部分細胞中-重度異性增生，局灶呈原位癌，不除外浸潤。T-SPOT檢測陽性。BALF送檢mNGS：肺炎克雷伯菌(序列數(shù)117，豐度0.8%)，金黃色葡萄球菌(序列數(shù)11，豐度0.1%)，白色念珠菌(序列數(shù)2906，豐度93.3%)，MTB復(fù)合群(序列數(shù)4337，豐度99%)，其后化驗回報氣管鏡吸痰培養(yǎng)：白色念珠菌，BALF涂片抗酸染色(+)?；颊叱霈F(xiàn)DIC，考慮肺結(jié)核診斷明確，合并真菌、細菌多重重癥感染。

圖7 例4患者2020年4月22日胸部CT影像

2.5文獻復(fù)習

2.5.1一項前瞻性研究納入臨床懷疑活動性結(jié)核病的患者34例，根據(jù)mNGS測序、傳統(tǒng)方法、Xpert結(jié)果分析，以臨床診斷為金標準，共19例確診活動性結(jié)核患者，其中結(jié)核性腦膜炎8例，結(jié)核性胸膜炎3例，肝臟結(jié)核2例，皮膚軟組織結(jié)核2例，腰椎關(guān)節(jié)結(jié)核2例，結(jié)核性腹膜炎1例，肺結(jié)核2例。mNGS敏感度為57.9%(11/19)，傳統(tǒng)方法敏感度為31.6%(6/19)，特異度均為100%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(McNemar檢驗，P=0.180)。mNGS和Xpert兩者的敏感度分別為50.0%(8/16)與37.5%(6/16)，特異度均為100%(15/15)。兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(McNemar檢驗，P=0.727)[2]。

2.5.2一項回顧性分析208例肺外標本涂片陰性但提示肺外結(jié)核(EPTB)的患者，從患者疑似感染部位收集標本進行結(jié)核培養(yǎng)、Xpert和mNGS檢測。最終診斷為EPTB患者180例(結(jié)核性淋巴結(jié)炎47例，結(jié)核性腦膜炎45例，結(jié)核性胸膜炎42例，骨關(guān)節(jié)/脊柱結(jié)核15例，結(jié)核性腹膜炎12例，泌尿生殖系結(jié)核11例，結(jié)核性心包炎8例)。傳統(tǒng)培養(yǎng)、Xpert和mNGS靈敏度分別為：13.89%(25/180,95%CI 9.36～20.01)、36.11%(65/180,95%CI 29.19～43.63) 和 56.11% (101/180,95%CI 48.53～63.43)。培養(yǎng)和Xpert聯(lián)合診斷靈敏度為37.78%，mNGS比傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert聯(lián)合診斷的靈敏度還要提高18.3%。 不同類型EPTB的mNGS敏感性差異顯著，mNGS在結(jié)核性腦膜炎中檢測敏感性最高(38/45，84.44%)。

2.5.3一項包括確診和臨床診斷結(jié)核患者共125例，肺外標本最多[57.6%(72/125)]，其中，漿膜腔積液34例(27.2%，胸腔積液31例，腹腔積液3例)，肺外組織22例(17.6%)，膿液標本10例(8.0%)，其他標本6例(4.8%，血液3例，分泌物2例，腦脊液1例)。肺內(nèi)標本中痰液23例(18.4%)，BALF 21例(16.8%)，肺組織9例(7.2%)。mNGS總體敏感度為49.6%(95%CI 40.6～58.6%),特異度為98.3% (95%CI 96.9～99.1%)，肺組織mNGS檢測敏感度最高，達到88.9%(95%CI 50.7～99.4%)，其次為肺泡灌洗液(BALF)為55.0%(95%CI 32.0～76.2%)，再次為漿膜腔積液為50.0%(95%CI 32.8～67.2%)。mNGS結(jié)核菌檢出的總體敏感度優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法(35.2%，95%CI 27.0～44.3)，但對痰液標本mNGS的敏感性與傳統(tǒng)培養(yǎng)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(mNGS：52.3%，95%CI 31.1%～72.6%；傳統(tǒng)培養(yǎng)方法： 60.9%，95%CI 38.8～79.5%)。在確診和臨床診斷50%的病例中，mNGS檢測結(jié)果MTB復(fù)合群序列數(shù)都偏低，在小于5條的范圍內(nèi)。mNGS將MTB檢測周期縮短至32～36h[3]。

2.5.4一項前瞻性研究對105例疑似活動性結(jié)核感染患者的痰，腦脊液、膿液等樣本同步進行傳統(tǒng)培養(yǎng)、Xpert和mNGS檢測。有45人最終臨床診斷為活動性結(jié)核感染，包括了13例肺結(jié)核和32例肺外結(jié)核病例。以臨床最終診斷為標準，mNGS對活動性結(jié)核診斷的敏感度為44%，與Xpert方法的敏感度(42%)相似，但遠高于傳統(tǒng)方法的敏感度(29%)。mNGS對活動性結(jié)核診斷的特異度達98%，只有一個假陽性結(jié)果。mNGS對治療前取得的臨床樣本診斷的敏感度顯著高于治療后，分別為76%和31%(P=0.005)，Xpert和傳統(tǒng)培養(yǎng)也是如此。Xpert和mNGS聯(lián)合診斷活動性結(jié)核的敏感度可達到60%，明顯高于傳統(tǒng)方法(McNemar檢驗，P<0.001)。

2.5.5在另一項收集了70例疑似結(jié)核病例的研究中，評估了mNGS、傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和Xpert之間的診斷性能、關(guān)系和一致性。研究提示在最終確診的36例樣本中，mNGS的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)分別為66.7%(95%CI:0.489～0.809)、97.1%(95%CI:0.829～0.998)、96.0%(95%CI:0.777～0.998)、73.3%(95%CI:0.578～0.849)、63.8%。mNGS的敏感性明顯優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)法(66.7%，95%CI:0.489～0.809 vs.36.1%，95%CI:0.213～0.538)和Xpert(76.9%，95%CI:0.460～0.938 vs.61.5%，95%CI:0.323～0.849)。與肺外結(jié)核相比，肺內(nèi)結(jié)核病例 mNGS、傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert都顯示出更好的結(jié)核診斷能力。在所有方法和樣本分類中，肺內(nèi)樣本平行診斷試驗的Youden指數(shù)表現(xiàn)突出(mNGS/培養(yǎng)88.2%；mNGS/Xpert100%)。各類型標本mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)的相關(guān)性及一致性均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)[4]。

2.5.6一項前瞻性單中心研究，收集疑似為活動性肺結(jié)核共110例患者，對BALF同時進行mNGS和Xpert、抗酸染色(AFS)、傳統(tǒng)培養(yǎng)，臨床最終確診為肺結(jié)核患者為48例。mNGS診斷的敏感性為47.92%，與Xpert(45.83%)和培養(yǎng)(46.81%)相似，但遠高于AFS(29.17%)；mNGS還可檢測出肺結(jié)核患者混合感染，其中真菌3例，細菌1例。同時，mNGS對63.63%(14/22)的NTM、7例真菌、1例病毒及其他常見致病菌進行了有效鑒定；mNGS在3d內(nèi)可鑒別67.23%的感染病原菌，而常規(guī)微生物檢測方法(包括培養(yǎng)、血清學(xué)方法、PCR等)在90d內(nèi)只能識別49.58%的病原菌[5]。

3 討 論

長久以來，結(jié)核的診斷依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)、涂片抗酸染色，但傳統(tǒng)培養(yǎng)法周期較長，通常2～8周，而且需要生物安全防護Ⅲ級的實驗室。而NTM、奴卡菌屬、micdadei軍團菌抗酸染色也可陽性，因此涂片抗酸染色陽性并不能確定一定為結(jié)核菌感染，近年來Xpert被WHO強烈推薦應(yīng)用于疑似結(jié)核檢測，僅需5個純化DNA基因片段或131個菌落/mL即可檢出，2h就可出報告，還可同時檢測利福平耐藥，且目前研究認為NTM感染不會導(dǎo)致Xpert假陽性[6]。本研究病例1及2患者臨床癥狀不典型，最終依據(jù)胸腔積液或BALF mNGS測序得以診斷MTB感染。病例3患者病理提供結(jié)核確診依據(jù)，胸水mNGS檢出MTB復(fù)合群序列數(shù)僅為1，但根據(jù)多篇文獻報道，由于MTB為胞內(nèi)細菌，胞內(nèi)生長為其特性，釋放較少的胞外核酸，同時細胞壁堅韌，DNA提取困難，因此mNGS檢測起始DNA量即偏低，導(dǎo)致了檢測困難，但其環(huán)境污染風險低，因此即使在檢測報告中序列數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物的可能[7]。病例4患者mNGS同時檢測到細菌、真菌、MTB，為混合重癥感染，mNGS檢測可敏感、快速、精準、無偏倚的捕捉混合感染病原體，縮短了危重感染患者的診斷周期，為積極救治爭取了寶貴的時間。并且在樣本抗酸染色陽性時，mNGS可高效鑒別MTB與NTM，避免誤診誤治。由于MTB菌群內(nèi)的菌株內(nèi)部同源性高，本研究病例2、3和4由于mNGS檢測基因組覆蓋度不高，MTB復(fù)合群陽性，但無法定位到特定種。

綜合本研究文獻復(fù)習，mNGS無論是對肺外或肺內(nèi)標本，其總體敏感度優(yōu)于傳統(tǒng)結(jié)核菌培養(yǎng)法，在檢測臨床樣本時不需要根據(jù)高度懷疑的某些病原體選擇特定的檢測方法。mNGS檢測結(jié)核菌敏感度及特異度與Xpert相似或優(yōu)于Xpert，但需要強調(diào)的是抗結(jié)核治療可顯著降低mNGS、Xpert、傳統(tǒng)培養(yǎng)三種診斷方法的敏感度，因此在經(jīng)驗性治療前收集樣本是非常重要的。與肺外結(jié)核病例相比，肺內(nèi)結(jié)核病例采用mNGS、傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert方法三者均顯示出更好的診斷能力。肺外結(jié)核患者中，mNGS診斷的敏感度最高，甚至高于傳統(tǒng)培養(yǎng)聯(lián)合Xpert。尤其是當mNGS與Xpert聯(lián)合時，可提高結(jié)核菌檢出率，無論時從時間周期還是敏感度及特異度方面，均可達到較高水平。在確診病例中，mNGS結(jié)核菌檢出陽性率明顯高于臨床診斷病例。

mNGS對肺內(nèi)樣本結(jié)核菌檢測更為敏感，肺組織標本敏感度最高，其次為BALF，再次為漿膜腔積液，但在痰標本中與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，因此選取肺內(nèi)標本時，在病情允許情況下應(yīng)優(yōu)先考慮肺組織，其次為BALF，再次為胸腔積液，最后選擇痰標本。mNGS在對標本量的要求方面也更加具備優(yōu)勢，分別為：無菌體液最少2mL；BALF最少4mL；深部痰液最少2mL；靜脈血最少2～5mL；組織標本新鮮組織2g左右。而Xpert要求腦脊液至少3.4mL，且往往要高于這個臨界值檢測效能才會理想，而胸腹水至少80mL。因此mNGS方法更適用于稀有樣本的檢測。

綜上所述，mNGS技術(shù)對于診斷MTB感染具有較高的價值，mNGS敏感度較高，優(yōu)于Xpert及傳統(tǒng)培養(yǎng)，三者或mNGS分別與Xpert或傳統(tǒng)培養(yǎng)聯(lián)合應(yīng)用不僅可顯著提高結(jié)核菌檢測的敏感度，而且可縮短檢測周期，無偏倚檢測混雜、新發(fā)或再發(fā)病原體感染，精準治療，避免抗生素濫用。