祁小麗， 王玉婷， 楊 杰

(新疆烏魯木齊市新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院放療二科， 新疆 烏魯木齊 830001)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高。目前，臨床上對(duì)中晚期宮頸癌主要是放射治療，治療早期能夠取得較好的療效，但后期隨著放療劑量的累積，可出現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性降低的現(xiàn)象，影響治療效果與預(yù)后[1]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)與細(xì)胞周期進(jìn)展密切相關(guān)，可有效調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，在維持有絲分裂穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中起著重要作用[2]。TPX2在多種惡性腫瘤疾病中存在高表達(dá)的現(xiàn)象，該表達(dá)與細(xì)胞的異質(zhì)性具有較高的相關(guān)性[3]。本研究旨在通過(guò)沉默宮頸癌細(xì)胞的TPX2基因探討其對(duì)宮頸癌細(xì)胞活性及放療敏感性的影響。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器：宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞系)購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司，質(zhì)粒載體來(lái)源于上?？吕咨锟萍加邢薰?，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)源于杭州弗德生物科技有限公司，蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)試劑盒來(lái)源于蘇州泓迅生物科技有限公司，TPX2的兔抗人抗體、羊抗兔抗體來(lái)源于南京霆瑞生物科技有限公司，Transwell小室來(lái)源于山東維真生物科技有限公司，CCK-8試劑盒來(lái)源于廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液來(lái)源于美國(guó)康寧生物科技有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀來(lái)源于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司，流式細(xì)胞儀來(lái)源于美國(guó)艾森生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、TPX2基因的干擾及分組：將宮頸癌Hela細(xì)胞系置于37℃、5% CO2、飽和濕度的環(huán)境中，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代3代以上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行研究，依據(jù)對(duì)載體的處理方式分為干擾組、陰性對(duì)照組(NC組)、空白對(duì)照組(CON組)，各自采取不同的處理手段。①干擾組：利用電穿孔法進(jìn)行TPX2基因的定向敲除[4]，將宮頸癌Hela細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，將30～50μg線性化的載體DNA加入懸液，于230V、300μF的環(huán)境下定向穿孔敲除TPX2基因，繼續(xù)培養(yǎng)48h備用。②NC組：對(duì)TPX2基因之外的無(wú)關(guān)序列采用相同的定向敲除方法。③CON組：不采用任何基因敲除方法，載體處理完畢后各自轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞。

1.3宮頸癌Hela細(xì)胞中TPX2 mRNA和蛋白表達(dá)的檢測(cè)：Hela細(xì)胞1×106個(gè)去掉培養(yǎng)基后，用PBS洗滌3次后，采用TRIZOL試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄呈cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TPX2的相對(duì)表達(dá)量。TPX2的引物序列：F：5′-ATGGTTTGAGGAGAAGGCCA-3′,R：5′-TATGGCTGCCTCAACTTCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為229bp。人GAPDH作為內(nèi)參，采用ΔΔCt法計(jì)算TPX2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用Western blot法檢測(cè)TPX2蛋白的表達(dá)，兔抗人TPX2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司(A01610-1)，抗人GAPDH一抗和山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司(BA1056)。

1.4宮頸癌Hela細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)：將各組細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h，培養(yǎng)結(jié)束前4h向每孔中加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后于光度計(jì)450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，擬制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5宮頸癌Hela細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)：將細(xì)胞以5×105/mL的密度接種于Transwell上室，每室100μL，下室中加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后移除剩余培養(yǎng)基及未遷移的細(xì)胞，固定下室細(xì)胞，滴入結(jié)晶紫液，記錄遷移細(xì)胞的數(shù)目。

1.6宮頸癌Hela細(xì)胞周期占比的檢測(cè)：各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后利用胰酶消化，隨后離心、洗滌、固定。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記，置入流式細(xì)胞檢測(cè)管，結(jié)合配套軟件測(cè)定并分析細(xì)胞周期中各期占比，包括G0/G1期、S期及G2/M期等。

1.7宮頸癌Hela細(xì)胞放療敏感性的檢測(cè)：采用克隆形成實(shí)驗(yàn)，L-Q線性平方模型曲線擬合。6孔板按照每孔接種500個(gè)細(xì)胞，接種12h后，按照梯度劑量0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy給予一次性照射，照射后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d，去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，1%的結(jié)晶紫染色30min，自來(lái)水沖洗干凈，拍照，照片采用IMAGE PRO plus計(jì)算克隆數(shù)。存活率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)，存活分?jǐn)?shù)=存活率/0劑量存活率，以梯度劑量對(duì)應(yīng)的存活分?jǐn)?shù)模擬曲線S=e^(αd+βd2)，計(jì)算α/β值。

2 結(jié) 果

2.1TPX2 mRNA及蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平：三組間TPX2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CON組相比，NC組細(xì)胞的TPX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05)；與CON組及NC組相比較，干擾組細(xì)胞的TPX2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。三組間TPX2 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與CON組相比較，NC組細(xì)胞的TPX2蛋白相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與CON組及NC組相比較，干擾組細(xì)胞的TPX2蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

圖1 TPX2基因mRNA及其蛋白的表達(dá)

2.2TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞增殖能力的影響：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞的細(xì)胞活性均呈升高趨勢(shì)，但自48h開(kāi)始干擾組細(xì)胞的細(xì)胞活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于NC組(P<0.05)，而NC組與CON組的細(xì)胞活性在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯改變(P>0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞增殖能力的影響

2.3TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞遷移能力的影響：與CON組(35.78±2.19)相比，NC組的遷移細(xì)胞數(shù)(36.44±1.63)無(wú)明顯變化。與NC組(36.44±1.63)及CON組比，干擾組細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)(22.47±2.19)明顯減少(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞遷移能力的影響

2.4TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞周期占比的影響：三組的G0/G1期、G2/M期及S期的細(xì)胞周期占比組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NC組相比，干擾組細(xì)胞的S及G2/M期細(xì)胞占比明顯增多，而G0/G1期細(xì)胞占比明顯減少(P<0.05)。而與CON組相比，NC組的上述指標(biāo)無(wú)明顯改變(P>0.05)。(見(jiàn)圖4、表1)。

圖4 TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞周期占比的影響

表1 TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞周期占比的影響(%)

2.5TPX2基因干擾對(duì)于宮頸癌Hela細(xì)胞放療敏感性的影響：CON組和干擾組放療后克隆形成(見(jiàn)圖5)，克隆形成率(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示，隨著放療劑量的提升，干擾組的生存率逐步低于CON組。與CON組相比，干擾組細(xì)胞在放療劑量為4Gy、6Gy、8Gy、10Gy的生存率降低(P<0.05)。LQ曲線擬合分析(見(jiàn)圖6)，干擾組α=0.14，β=0.021，L-Q方程Y=e-(0.14d+0.021*d2)(R2=0.996)，α/β=6.6；CON組α=0.088，β=0.0215，L-Q方程Y=e-(0.088d+0.0215*d2)(R2=0.995)，α/β=4.09。

表2 放療后克隆形成率情況

圖5 CON組和干擾組放療后克隆形成

圖6 LQ曲線擬合分析

3 討 論

對(duì)于中晚期宮頸癌患者，首選同步放化療，總體療效較好，但腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性可能存在劑量相關(guān)性，過(guò)高的照射劑量可能會(huì)降低腫瘤敏感性而影響療效[5,6]。TPX2是一種在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用的物質(zhì)，其可能在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象，且腫瘤的變異程度越高時(shí)表達(dá)越明顯。因此可考慮從抑制TPX2的角度治療惡性腫瘤，通過(guò)干擾抑制TPX2基因的表達(dá)，阻礙腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖[7]。

干擾宮頸癌Hela細(xì)胞TPX2基因可干擾其表達(dá)，阻礙其增殖、遷移等細(xì)胞活性，有效提高宮頸癌Hela細(xì)胞的放療敏感性。TPX2基因可在宮頸癌的診治中發(fā)揮重要作用[8]：可利用TPX2的表達(dá)水平早期篩查宮頸癌，且有效評(píng)價(jià)宮頸癌的惡性程度。因此可考慮從基因水平抑制TPX2基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期中蛋白的生成，阻滯腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移，可作為針對(duì)性治療的有效靶點(diǎn)。因此，TPX2基因可作為宮頸癌臨床診治的重要方向之一。

本研究采用電穿孔法干擾TPX2基因的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞的TPX2 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯降低，表明對(duì)Hela細(xì)胞中的TPX2基因已成功進(jìn)行了干擾，可以進(jìn)行后續(xù)研究。干擾TPX2基因的表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞的增殖能力及遷移能力均受到抑制，這表明TPX2基因在宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移過(guò)程中有重要的促進(jìn)作用，臨床上可以通過(guò)干擾TPX2基因的表達(dá)抑制宮頸癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)干擾TPX2基因的表達(dá)還能夠影響細(xì)胞周期，使處于S及G2/M期的宮頸癌細(xì)胞占比增多。這可能是由于TPX2蛋白可特異性結(jié)合紡錘體，促進(jìn)動(dòng)力蛋白吸附于微管結(jié)構(gòu)中，確保紡錘體結(jié)構(gòu)的延續(xù)性及功能的完整性[9]，與細(xì)胞周期關(guān)系密切，抑制TPX2基因的表達(dá)可中斷細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[10]。研究表明，高表達(dá)TPX2可阻礙放療生成γ-H2AX，降低放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，而腫瘤細(xì)胞中TPX2蛋白含量降低時(shí)接受放療γ-H2AX的生成水平會(huì)明顯提高，γ-H2AX在接受放療后的存續(xù)時(shí)間可能與腫瘤細(xì)胞的放療敏感性密切相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，干擾TPX2基因的表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞對(duì)于放療的敏感性明顯提高，這與以往的研究結(jié)果相吻合。

綜上所述，TPX2可作為宮頸癌基因診治的關(guān)鍵靶標(biāo)。干擾TPX2基因可有效干擾TPX2基因的表達(dá)，阻礙宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖、遷移等能力。干擾TPX2基因可有效提高宮頸癌Hela細(xì)胞的放療敏感性，增加療效并改善生存期。因此，從TPX2基因入手可考慮作為宮頸癌臨床診斷及救治的重要方向，但本研究納入的樣本量少，基因干擾成功率存在差異限制了研究的推廣，對(duì)于其他潛在基因靶標(biāo)的研究較少，仍存在一些不足之處。后續(xù)還需進(jìn)一步作長(zhǎng)時(shí)程、大樣本量研究。