上海地區(qū)葡萄病毒種類及傳毒介體檢測鑒定

田沂民,朱雅君,羅金燕,陳 磊,余 慧,易建平,葉 軍,于 翠?

(1上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心,上海200135;2上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,上海201103)

葡萄(Vitis.viniferaL.)是世界上最古老的果樹品種之一,具有較高的經(jīng)濟價值,在我國種植面積較大。葡萄病害是影響葡萄生產(chǎn)的主要原因,有超過70種病原菌可侵染葡萄,包括65種病毒、5種類病毒、8種植原體和1種木質(zhì)部細(xì)菌[1]。傳統(tǒng)的病原鑒定主要依靠典型癥狀、寄主類別和原有的經(jīng)驗來大致確定病原種類,然后根據(jù)確定的病原種類選擇合適的血清、引物或探針進行檢測和確認(rèn)。傳統(tǒng)檢測方法使用的一個重要前提是對病原的生物學(xué)特性、理化特性、血清特性等有預(yù)先了解,而在對未知病原物缺乏了解的情況下,傳統(tǒng)檢測方法則出現(xiàn)耗時長、效率低、易假陰性或假陽性等問題[2]。此外,因病毒株系可能存在較大的序列差異,血清或特異性引物很容易造成檢測結(jié)果陰性;電鏡與生物學(xué)接種方法又難以將病原物鑒定至病毒種類。近年來,小RNA測序技術(shù)成為植物病毒學(xué)研究的強有力工具,該技術(shù)具有非序列依賴性的優(yōu)勢,已在非典型癥狀病原鑒定、混合侵染病原鑒定、病原侵染早期檢測、新病原發(fā)現(xiàn)、環(huán)境中病原種群鑒定等方面應(yīng)用,對于病原的流行病學(xué)和生態(tài)學(xué)研究起到了非常重要的推動作用。2010年之后,在葡萄上也發(fā)現(xiàn)了多種新病毒,如葡萄脈明病毒(Grapevine vein clearing virus,GVCV)與葡萄明脈癥狀相關(guān),葡萄灰皮諾病毒(Grapevine Pinot gris virus,GPGV)引起葡萄葉片產(chǎn)生褪綠、畸形,葡萄紅葉相關(guān)病毒(Grapevine redleaf-assoicated virus,GRLaV)引起葡萄紅葉病等均是通過該技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)的[3-5]。對表現(xiàn)葡萄扇葉病類似癥狀的葡萄樣品進行小RNA測序,發(fā)現(xiàn)葡萄漿果內(nèi)壞死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)和葡萄蠶豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)與癥狀發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。

葡萄是上海地區(qū)重要的水果種類之一,為明確上海地區(qū)葡萄相關(guān)的病毒種類,本試驗采集帶有病毒癥狀的樣品進行小RNA測序以確定侵染病毒種類,并對葡萄園中及周邊的昆蟲進行病毒檢測,以期找到病毒與傳毒介體之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2017年5—6月,在上海市奉賢區(qū)、嘉定區(qū)、寶山區(qū)和浦東新區(qū)5年生以上葡萄園進行病毒病調(diào)查,并采集斑點黃化的葉片(圖1)作為試驗材料,進行病毒檢測。2018年4—7月,根據(jù)葡萄病毒病檢測結(jié)果,從浦東新區(qū)的葡萄園內(nèi)通過掃網(wǎng)方式捕捉昆蟲,在解剖鏡下觀察其形態(tài)特征進行種類鑒定,取蟲口數(shù)量較多的植食性昆蟲分別檢測蟲體帶毒情況。

圖1 感染病毒的葡萄葉片癥狀Fig.1 Symptoms of grape leaves infected by viruses

1.2 小RNA測序及分析

采集的樣品用Trizol(Aldrich-sigma)提取植物總RNA,操作步驟參照說明書進行。提純的總RNA加入1∕2體積的8 mol∕L LiCl溶液,充分混勻,冰上放置1 h;4℃13 000g離心15 min,沉淀的RNA用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌;加入20—50μL無RNase的雙蒸水,用槍頭吸打數(shù)次使之溶解。使用分光光度計測定RNA濃度,并電泳檢測RNA質(zhì)量。

提取的RNA樣品委托上海昂樸生物科技有限公司利用Illumina HisSeqTM 2000高通量測序平臺進行小RNA測序。Illumina測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù);使用Cut adapt v1.4.2軟件切除reads尾部接頭和尾部質(zhì)量低于Q20的堿基,并對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制;對經(jīng)過質(zhì)量剪切前后的數(shù)據(jù)分別進行測序,對reads數(shù)、reads讀長、總堿基數(shù)、文庫平均插入長度進行統(tǒng)計。采用Velvet軟件對clean data中的小RNA進行拼接,設(shè)哈希長度(hash_length)值為17。將拼接得到的片段(contigs)序列與NCBI網(wǎng)站下載的病毒參考數(shù)據(jù)庫(ftp:∕∕ftp.ncbi.nlm.nih.gov∕refseq∕release∕viral∕)進行blastn和blastx,根據(jù)比對和注釋信息進行分析,確定感病葡萄可能攜帶的病毒種類。

1.3 核酸提取

取剩余樣品分別置于無菌自封袋中,用錘子將葉片盡可能敲擊破碎,加入適量PBS緩沖液,充分浸泡后分別取100μL上述制備液于1.5 mL離心管中,按照植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,DP432)或植物總DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,DP320)的操作步驟進行核酸提取。

分別取不同種昆蟲各10頭置于自封袋中,用錘子將蟲體盡可能敲擊破碎,加入適量PBS緩沖液,分別取100μL于1.5 mL離心管中,按照植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)或植物總DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的操作步驟進行核酸提取。

1.4 RT-PCR和PCR驗證

提取植物總RNA或DNA,根據(jù)注釋的病毒種類設(shè)計或使用相關(guān)文獻引物(表1),采用Takara公司one step RT-PCR Kit進行RT-PCR和PCR驗證。使用葡萄雙生病毒A(Grapevine geminivirusA,GGVA)、葡萄卷葉伴隨病毒2(Grapevine leafroll-associated virus2,GLRaV-2)、巖生葡萄莖痘伴隨病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)、葡萄斑點病毒(Grapevine fleck virus,GFkV)和葡萄蠶豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus,GFabV)特異性引物對樣品和蟲樣分別進行RT-PCR檢測,擴增得到的產(chǎn)物進行序列測定和分析,驗證小RNA測序結(jié)果并確定病毒種類。

表1 病毒檢測所用引物Table 1 Primers for virus detection

1.5 GGVA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于GGVA Rep∕C1基因設(shè)計擴增引物GGVA-978F∕R(表1),將DNA樣品進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳和測序驗證。采用NCBI中的BLAST(http:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕)進行相似性查找。通過MEGA 6.0軟件的Maximum likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap replications值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄葉片小RNA深度測序檢測

對葡萄葉片樣品進行測序,得到12 276 277個raw reads和11 758 213個clean reads。使用Velvet軟件對clean reads進行組裝,并利用NCBI nt庫和nr庫對拼接片段(contigs)進行blastn、blastx注釋,共得到與病毒相關(guān)的拼接片段5種21條,其中GGVA有17條,GFabV、GFKV、GLRaV-2、GRSPaV各有1條。GGVA所獲得的17個拼接片段可覆整個基因組。

2.2 葡萄葉片RT-PCR或PCR檢測

利用GGVA、GFabV、GFKV、GLRaV-2、GRSPaV的特異性引物對測序余樣進行擴增驗證,如圖2所示,從樣品中能擴增到5種病毒,且條帶大小與預(yù)期一致,測序結(jié)果也表明擴增條帶序列為目的病毒序列。同時對各區(qū)采樣點采集的葡萄樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)GGVA、GLRaV和GRSPaV在上海地區(qū)葡萄中普遍發(fā)生(表2)。

圖2 葡萄葉片的RT-PCR∕PCR檢測Fig.2 Detection of grape leaves by RT-PCR∕PCR

表2 不同葡萄園的病毒檢測結(jié)果Table 2 Virus detection results from different vineyards

2.3 GGVA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在國內(nèi)很少有對葡萄雙生病毒A的報道,NCBI GenBank中所含的序列信息較少。采用RT-PCR獲得GGVA Rep∕C1 978 bp序列。通過NCBI blastn比對發(fā)現(xiàn),GGVA-PD序列與GGVA網(wǎng)上序列KX570611、LC424098、KX570614、KX570607的同源性超過99%。利用MEGA 6.0軟件建立基于GGVA Rep∕C1基因的ML進化樹,可以看出GGVA-PD與GGVA形成一簇,而與其他雙生病毒關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3),表明本次采集的樣品GGVA-PD為GGVA的一個分離物。

2.4 昆蟲體內(nèi)病毒檢測

在發(fā)病的葡萄園內(nèi)捕捉到蟲口密度較大的6種植食性昆蟲,煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)、茶黃薊馬Scirtothrips dorsalisHood、狹領(lǐng)紋唇盲蝽Charagochilus angusticollis、菊方翅網(wǎng)蝽Corythucha marmorata(Uhler)、桃蚜Myzus persicae和寡脈蠅Asteia amoenaMeigen,分別提取核酸,采用RT-PCR或PCR方法分別對GGVA、GFabV、GFkV、GLRaV-2、GRSPaV 5種病毒進行檢測。GFabV、GLRaV-2和GRSPaV在上述6種昆蟲體內(nèi)均未檢出,GGVA在6種昆蟲體內(nèi)均能檢出,GFkV僅在狹領(lǐng)紋唇盲蝽體內(nèi)檢出(圖4)。GGVA在6種昆蟲體內(nèi)普遍存在,表明其存在較高蟲傳風(fēng)險。

圖4 昆蟲體內(nèi)病毒的RT-PCR∕PCR檢測Fig.4 Detection of viruses in insects by RT-PCR∕PCR

3 討論

在葡萄病害調(diào)查過程中,發(fā)現(xiàn)上海葡萄園主要采用精細(xì)化管理,表現(xiàn)明顯癥狀的植株相對較少,從4個滬郊葡萄園中采集的表現(xiàn)輕微黃化癥狀的葉片混合后進行小RNA測序,檢出GGVA、GFabV、GFkV、GLRaV-2和GRSPaV 5種葡萄病毒,利用RT-PCR和PCR方法進行驗證,二者結(jié)果一致。可見,上述5種病毒可能是上海地區(qū)葡萄病毒病的主要病源。但由于葡萄存在多種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象,還需通過分離接種等試驗進一步明確病毒與癥狀之間的關(guān)系。

GGVA是2017年美國在對韓國進口的2種鮮食葡萄上利用深度測序技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)的葡萄新病毒[10],研究者對加州地區(qū)葡萄園調(diào)查結(jié)果顯示GGVA發(fā)生率僅為1.74%。2018年Jo等[11]在韓國調(diào)查葡萄病害時,也在多個葡萄品種中首次檢出該病毒。其后,范旭東等[6]在山東、遼寧、四川、北京等地葡萄園進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)GGVA在一些引進的栽培品種如‘夏黑’上發(fā)生普遍,而本土品種則未檢出GGVA,說明我國境內(nèi)檢出的GGVA可能是近幾年葡萄品種引進隨種苗傳帶入境,需對葡萄等帶毒風(fēng)險高的種苗實施嚴(yán)格的檢疫。

在發(fā)病葡萄園進行昆蟲采集,并對其進行病毒檢測。利用PCR或RT-PCR方法在粉虱、薊馬、狹領(lǐng)紋唇盲蝽、菊方翅網(wǎng)蝽、蚜蟲和寡脈蠅體內(nèi)均檢出GGVA。GGVA為雙生病毒科病毒,是典型的蟲傳病毒,文獻報道雙生病毒的主要傳毒介體為粉虱、葉蟬等[12],薊馬、狹領(lǐng)紋唇盲蝽、菊方翅網(wǎng)蝽、寡脈蠅尚未見報道。因此,這幾種昆蟲雖然帶毒,是否傳毒、傳毒特點和危害程度需要進一步研究。對蟲傳病毒而言,由于昆蟲在葡萄園中普遍存在,數(shù)量龐大,通過采集傳媒昆蟲監(jiān)測田間病毒發(fā)生情況,可大大將病毒發(fā)生預(yù)警時間提前,以便采取必要的防控措施,減少農(nóng)作物的損失。