基于多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)肉制品中6種動(dòng)物源性成分

趙志勇,朱少華,趙曉燕,索玉娟,陳愛亮,李曉貝,張艷梅,周昌艷?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,上海201403;2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部工程建設(shè)服務(wù)中心,北京100125;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,北京100081)

肉制品摻假是食品領(lǐng)域一直存在的質(zhì)量安全問題,也是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)之一[1-2]。由于肉類品質(zhì)和價(jià)格存在差異,個(gè)別企業(yè)和商販在利益驅(qū)動(dòng)下,用低價(jià)劣質(zhì)肉冒充高價(jià)優(yōu)質(zhì)的肉,尤以摻雜異種肉(如豬肉、鴨肉冒充牛、羊肉等)的行為最為常見[3]。近年來,該類摻假事件在國內(nèi)外屢有發(fā)生,引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。2011年新華網(wǎng)報(bào)道,很多大排檔為降低成本通過“牛肉膏”使豬肉變身“牛肉”,江西、福建、廣州及其周邊市場(chǎng)也存在這種狀況。2013年歐洲暴發(fā)“馬肉風(fēng)波”,在瑞典、英國和法國部分牛肉制品中發(fā)現(xiàn)了馬肉[4]。2018年,河北河間多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的黑作坊將騾子肉、馬肉、豬肉加工后冒充驢肉出售。這些摻假事件不僅損害了消費(fèi)者的利益、擾亂了市場(chǎng)秩序,也容易引發(fā)民族宗教等問題[5]。另外,摻假產(chǎn)品中經(jīng)常使用調(diào)味劑及調(diào)色劑,僅從產(chǎn)品的色澤和氣味上,很難判斷出肉制品中是否添加了其他肉類成分。為了嚴(yán)厲打擊肉類產(chǎn)品摻假售假等行為,建立肉制品中動(dòng)物源性成分鑒別檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。

從20世紀(jì)80年代開始,國內(nèi)外就已開展了動(dòng)物源性成分檢測(cè)相關(guān)的研究工作[1,6-9]。目前,主要的檢測(cè)方法包括:以顯微鏡觀察為基礎(chǔ)的物理方法[10]、以檢測(cè)蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法[8]、以檢測(cè)DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法[7,11]、以高效液相色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)方法[12]、以近紅外反射技術(shù)為基礎(chǔ)的光譜學(xué)方法[13]。其中,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)具有特異性高、成本較低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),已在微生物和動(dòng)植物的種質(zhì)鑒別中得到廣泛應(yīng)用,在肉制品摻假鑒別方面也顯示出良好的應(yīng)用前景[14-15]。我國政府監(jiān)管部門已頒布了利用PCR技術(shù)鑒定肉源性成分的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。然而,這些標(biāo)準(zhǔn)大多針對(duì)單種動(dòng)物源成分進(jìn)行鑒定,對(duì)于確證食品中是否摻雜有多種肉類成分,則需分別鑒定,檢測(cè)成本高、操作繁瑣且耗時(shí)。本研究旨在建立一種可同時(shí)檢測(cè)食品中牛、羊、雞、豬、鴨和驢等成分的六重PCR方法,以用于肉制品中6種動(dòng)物源性成分的同時(shí)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磁珠法基因組DNA抽提試劑盒和PCR Taq擴(kuò)增試劑盒(含染料或不含染料)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。牛肉(魯西黃牛、和牛、南陽牛和安多牦牛)、豬肉(太湖豬、三元豬、杜洛克豬、良雜豬和沂蒙黑豬)、兔肉和狗肉等由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所提供。羊肉(崇明白山羊和波爾山羊)、雞肉(白羽雞、三黃雞、烏骨雞和草雞)及草鴨等購自上海屠宰場(chǎng)或大型超市。樣本保存在-20℃條件下。

1.2 儀器與設(shè)備

T100 PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司),Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),Nanodrop 2000C超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司),PowerPac＠basic電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法

(1)鹽提取法 稱取肉樣50 mg,加入液氮研磨成粉末,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入400μL裂解液I(10 mmol∕L Tris-HCl,pH 8.0;2 mmol∕L EDTA,pH 8.0;0.4 mol∕L NaCl)和80μL 10%SDS。渦旋振動(dòng)后,加入2μL 20 mg∕mL蛋白激酶K,65℃條件下孵育1 h。渦旋后,加入20μL 10 mg∕mL Rnase酶,65℃下孵育10 min。加入300μL 5 mol∕L NaCl,渦旋30 s。10 000 r∕min下離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入等量異丙醇,渦旋后置于-20℃冰箱30 min,15 000 r∕min離心5 min后,移除上清液。向離心管中加入700μL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇,吸打或者點(diǎn)振混勻,15 000 r∕min離心5 min后,移除上清液,重復(fù)該步驟。室溫開蓋干燥15—20 min至管內(nèi)無液體殘留。向離心管中加入100μL滅菌水,劇烈振蕩。

(2)酚-氯仿提取法 稱取肉樣50 mg,加入液氮研磨成粉末,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入500μL裂解液II(50 mmol∕L Tris-HCl,pH 8.0;10 mmol∕L EDTA,pH 8.0;0.1 mol∕L NaCl)、30μL 10%SDS和2μL 20 mg∕mL蛋白激酶K,50℃條件下孵育1 h。渦旋后,加入20μL 10 mg∕mL Rnase酶,50℃下孵育10 min。加入等體積的酚∕氯仿∕異戊醇(24∕24∕1,V∕V∕V)至反應(yīng)體系中。渦旋3 min,10 000 r∕min下離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管,加入等體積氯仿∕異戊醇(24∕1,V∕V)。渦旋振蕩后,10 000 r∕min離心5 min。取上清液轉(zhuǎn)移至新的試管,加入等量冰浴過的乙醇,在10 000 r∕min離心5 min后,移除上清液。使用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液沖洗DNA,離心后去除上清液。殘?jiān)?00μL滅菌水溶解。

(3)試劑盒法參照基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

在GenBank中搜索牛、羊、雞、豬、鴨和驢等線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)的基因序列。釆用正反向引物特異的策略,通過Blast功能確保屬內(nèi)序列間具有較高的同源性后,將序列導(dǎo)入到DNAMAN軟件中,分析屬間基因組的差異。在此基礎(chǔ)上,用Primer 6設(shè)計(jì)各物種的特異性引物。經(jīng)過驗(yàn)證與篩選,6種動(dòng)物源性成分的引物信息見表1。

表1 牛、羊、雞、鴨、豬和驢等引物序列信息Table 1 The primer information of cattle,sheep,chicken,duck,pig and donkey

1.4 引物特異性驗(yàn)證

利用設(shè)計(jì)及篩選的6對(duì)引物,分別擴(kuò)增17種不同畜禽品種(牛、羊、雞、豬、鴨、驢、兔和狗)的基因組DNA,驗(yàn)證引物的特異性;并分別擴(kuò)增各動(dòng)物組織的DNA,考察多重PCR反應(yīng)體系的特異性與適用性。

1.5 多重PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系(50μL):5×PCR Buffer 10μL,dNTPMix濃度為0.2 mmol∕L,Taq DNA聚合酶2.5 U,MgCl23 mmol∕L,DNA模板1μL,最佳引物比例為牛∕羊∕雞∕豬∕鴨∕驢=2∕1∕1∕1∕0.5∕1[1代表10 pmol∕(50μL)],最后用滅菌水將體系補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,58.6℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后,取3μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.6 多重PCR體系的優(yōu)化

1.6.1 引物比例

設(shè)置5種引物比例[(1代表10 pmol∕(50μL)]:①牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=1∕1∕1∕1∕1∕1;②牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕1∕0.5∕1∕0.5;③牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕2∕0.5∕2∕1;④牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕1∕0.5∕1∕1;⑤牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕2∕0.5∕1∕2。根據(jù)凝膠電泳條帶數(shù)量及亮度,確定最佳引物比例。

1.6.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

在多重PCR反應(yīng)體系中,Mg2+的濃度依次設(shè)為1.0 mmol∕L、2.0 mmol∕L、3.0 mmol∕L、4.0 mmol∕L、5.0 mmol∕L,根據(jù)凝膠電泳條帶數(shù)量及亮度,確定體系中最優(yōu)的Mg2+濃度。

1.6.3 退火溫度的優(yōu)化

利用梯度PCR反應(yīng)程序,分別設(shè)定退火溫度為53.0℃、53.9℃、55.0℃、57.4℃、58.6℃、59.8℃、61.0℃和62.0℃,其他反應(yīng)條件不變。根據(jù)凝膠電泳條帶數(shù)量及亮度,確定最佳退火溫度。

1.7 檢測(cè)靈敏度

將100 ng∕μL的6種動(dòng)物源性成分的DNA模板混合稀釋至10 ng∕μL,然后用滅菌蒸餾水依次稀釋至1 ng∕μL、0.1 ng∕μL、0.01 ng∕μL、0.001 ng∕μL。利用1.5中多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,考察多重PCR方法的靈敏度。

1.8 市售樣品檢測(cè)

采集15份市售的肉類產(chǎn)品,包括5份肉丸、5份火腿及5份鮮肉卷等,利用建立的六重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí),使用現(xiàn)行頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法:《SN∕T 3731.5—2013食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法第5部分:鴨成分檢測(cè)PCR法》《SN∕T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》《SN∕T 2978—2011動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法》《SN∕T 3730.4—2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法》與本方法進(jìn)行對(duì)比確證。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉類DNA提取方法

如表2所示,對(duì)于羊、雞、豬、鴨和驢等源性成分,試劑盒法提取的DNA濃度最高,酚-氯仿法與鹽抽提法次之;對(duì)于牛源性成分,3種提取方法的DNA得率基本一致。鹽抽提法提取的DNA A260∕A280值在1.57—1.82,酚-氯仿抽提法的DNA A260∕A280值在1.78—1.91,試劑盒提取法的DNA A260∕A280值在1.98—2.06。相比較而言,試劑盒法提取的DNA純度更高。

表2 不同抽提方法對(duì)DNA濃度及純度的影響Table 2 Effects of different extraction methods on DNA concentration and purity

2.2 引物特異性驗(yàn)證

如圖1(a)所示,使用牛引物分別擴(kuò)增17種動(dòng)物組織的DNA。結(jié)果顯示:南陽牛、魯西黃牛及和牛均出現(xiàn)493 bp擴(kuò)增條帶,而安多牛和其他肉制品未出現(xiàn)特異性條帶。如圖1(b)—(f)所示,分別使用羊、雞、豬、鴨和驢的引物擴(kuò)增17種動(dòng)物組織。結(jié)果顯示:羊、雞、豬、鴨和驢的擴(kuò)增條帶分別為302 bp、400 bp、265 bp、239 bp和123 bp,其他種屬動(dòng)物DNA擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。表明所選擇的6對(duì)引物對(duì)同種屬動(dòng)物源性成分能擴(kuò)增出目的條帶,對(duì)其他肉源性成分均無擴(kuò)增現(xiàn)象,引物特異性良好。

圖1 單引物分別擴(kuò)增各動(dòng)物DNA的電泳圖Fig.1 The gel electrophorogram of DNA from different animal species by signal prime

同時(shí),考察了單引物分別擴(kuò)增含6種動(dòng)物源性成分的混合DNA模板。如圖2所示,每對(duì)引物僅擴(kuò)增出單一特征性的目的條帶。使用六重引物體系分別擴(kuò)增牛、羊、雞、豬、鴨和驢等動(dòng)物源性成分,也均擴(kuò)增出單一特征性條帶,表明所設(shè)計(jì)的引物可滿足多重PCR的特異性要求。

圖2 單重PCR和六重PCR反應(yīng)體系的凝膠電泳Fig.2 The gel electrophorogram of single and multiple PCR system

2.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 不同引物比例對(duì)多重PCR反應(yīng)的影響

引物濃度可影響PCR擴(kuò)增效率[19]。若引物濃度過低,則引物不能充分與DNA靶標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合,從而導(dǎo)致產(chǎn)物量降低;若引物濃度過高,則容易引起錯(cuò)配,導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加。在多重PCR反應(yīng)體系中,引物之間也可能會(huì)產(chǎn)生交叉結(jié)合,從而影響PCR反應(yīng)的效率。如圖3所示,當(dāng)牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕1∕0.5∕1∕1時(shí),各物種間無交叉反應(yīng),可出現(xiàn)6條清晰的目的條帶。

圖3 不同引物比例對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響Fig.3 Effects of different primer ratios on the PCR amplification efficiency

2.3.2 Mg2+濃度對(duì)多重PCR反應(yīng)的影響

Mg2+是TaqDNA聚合酶的活性因子,其濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量均有影響。當(dāng)其濃度過低時(shí),會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性,使擴(kuò)增產(chǎn)物量減少;當(dāng)濃度過高時(shí),可導(dǎo)致酶催化的非特異性擴(kuò)增增加。如圖4所示,當(dāng)Mg2+濃度為1 mmol∕L時(shí),豬、鴨和驢的目的條帶亮度十分低;當(dāng)Mg2+濃度增加至2—3 mmol∕L時(shí),可擴(kuò)增出6條目的條帶;當(dāng)Mg2+濃度高于3 mmol∕L時(shí),驢的目的條帶亮度較低。最終選擇Mg2+濃度為3 mmol∕L。

圖4 Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響Fig.4 Effects of Mg2+concentration on PCR amplification efficiency

2.3.3 退火溫度對(duì)多重PCR反應(yīng)的影響

退火溫度是引物與DNA模板結(jié)合的溫度,也是影響PCR反應(yīng)特異性的重要因素[20]。在PCR反應(yīng)中,退火溫度過低會(huì)增加非特異性擴(kuò)增,退火溫度過高則擴(kuò)增不出目的條帶。如圖5所示,當(dāng)退火溫度小于55℃時(shí),無法擴(kuò)增出豬源性成分的目的條帶,僅能擴(kuò)增出另外5種源性成分的目的條帶;當(dāng)溫度提高至55℃時(shí),可同時(shí)擴(kuò)增出6種源性成分的目的條帶。通過比較,本研究選擇58.6℃為最佳退火溫度。

圖5 退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響Fig.5 Effects of annealing temperature on PCR amplification efficiency

2.4 檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)

如圖6所示,當(dāng)添加1μL 0.1 ng∕μL混合DNA時(shí),仍可擴(kuò)增出6種動(dòng)物源性成分的目的條帶,表明該方法檢測(cè)6種動(dòng)物源性成分的靈敏度為0.1 ng∕μL DNA。

圖6 六重PCR方法的靈敏度Fig.6 The sensitivity of multiple PCR method

2.5 市售樣本分析

利用建立的六重PCR方法與現(xiàn)行頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)市售肉制品進(jìn)行檢測(cè)。如表3所示,5份肉丸中有2份檢出標(biāo)注成分之外的肉類,例如牛肉丸中檢出鴨和豬源性成分等;5份火腿樣品中有3份檢出標(biāo)注成分之外的肉類;5份鮮肉卷均為其標(biāo)注的肉類成分?？傮w來看,對(duì)于肉丸與香腸制品仍需加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管與抽查力度。

表3 15份市售肉制品分析結(jié)果Table3 Analysis results of 15 of meat products from market

3 討論

肉制品摻假是食品質(zhì)量安全領(lǐng)域一直存在的問題。我國監(jiān)管部門針對(duì)肉源成分的鑒定已頒布了約31個(gè)國家、行業(yè)或地方標(biāo)準(zhǔn)。然而,這些標(biāo)準(zhǔn)大多數(shù)僅能同時(shí)檢測(cè)2—3種動(dòng)物源性成分,尚未頒布可同時(shí)檢測(cè)4種以上肉制品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。另外,國內(nèi)外已有不少研究人員建立了基于PCR的動(dòng)物源性成分鑒定方法。唐修君等[21]以線粒體16SrRNA基因序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物,建立了可檢測(cè)羊、牛、豬、兔和雞源性成分的檢測(cè)方法。該方法在同一反應(yīng)體系中僅能檢測(cè)單種動(dòng)物源性成分,不能同時(shí)檢測(cè)多種源性成分。本研究建立了一種可同時(shí)鑒別食品中牛、羊、雞、豬、鴨、驢等源性成分的多重PCR方法。該方法可在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)鑒定6種動(dòng)物源性成分,極大地節(jié)省人力、時(shí)間和檢測(cè)成本。馮海永等[22]建立了檢測(cè)羊肉產(chǎn)品中7種動(dòng)物源性成分的PCR方法,該方法引物的設(shè)計(jì)采用上游引物共用、下游引物特異的策略,未針對(duì)不同動(dòng)物源性成分設(shè)計(jì)各自特異性的引物對(duì),也未考察反應(yīng)體系同時(shí)擴(kuò)增7種肉源成分的效果。同樣,Song等[23]建立了可同時(shí)檢測(cè)牛、羊和豬源性成分的檢測(cè)方法。該方法也采用上游引物共用、下游引物特異的引物選擇策略。本研究起初針對(duì)不同畜禽種類自行設(shè)計(jì)合成了6對(duì)特異性的引物,并在17種不同品種或品系的肉制品中進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明牛、羊、雞引物僅對(duì)本類肉制品擴(kuò)增出目的條帶,引物特異性高;豬、鴨和驢引物對(duì)其他肉類也可擴(kuò)增出目的條帶,引物特異性較差。鑒于此,本研究篩選并驗(yàn)證了已報(bào)道的豬、鴨和驢引物,并結(jié)合自行設(shè)計(jì)的牛、羊、雞引物,建立了六重PCR檢測(cè)方法。

多重PCR技術(shù)可極大節(jié)約檢測(cè)成本和簡(jiǎn)化操作步驟,但是多重PCR技術(shù)也存在一定的技術(shù)難題。例如,在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物,極有可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,產(chǎn)生拖尾和引物二聚體,從而造成目標(biāo)序列擴(kuò)增效率下降及靈敏度降低等情況,進(jìn)而使相關(guān)方法的推廣及標(biāo)準(zhǔn)化受到限制[24]。一般來講,影響擴(kuò)增效果的因素包括:引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度、模板濃度、循環(huán)參數(shù)等[25]。本研究通過對(duì)引物比例、Mg2+濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,提高引物反應(yīng)過程中的特異性和靈敏度,最終擴(kuò)增出6條特異性目的條帶,不同物種間無交叉反應(yīng),極大地節(jié)約了檢測(cè)成本、提高了檢測(cè)效率。

總體來說,本研究建立了一種可同時(shí)檢測(cè)肉制品中牛、羊、雞、豬、鴨和驢等源性成分的多重PCR方法。相較于已報(bào)道的方法,本研究自行設(shè)計(jì)了牛、羊和雞等源性成分的高特異性引物,并且在17種不同品種的畜禽產(chǎn)品中進(jìn)行驗(yàn)證,確保了所使用的引物在不同品種間依然有較強(qiáng)的特異性,避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外,相較于熒光定量PCR方法,該方法具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn),可在基層監(jiān)管部門中推廣應(yīng)用,為維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益,打擊肉制品摻假售假等問題提供技術(shù)支撐。