GLIS1基因多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系研究

周 梅,劉秋月,狄 冉,胡文萍,王翔宇,張效生,張金龍,儲明星?

(1中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,北京100193;2安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,豬分子數(shù)量遺傳學安徽省農(nóng)業(yè)科學院重點實驗室,畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室,合肥230001;3天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津300381)

產(chǎn)羔數(shù)是綿羊最重要的經(jīng)濟性狀之一,據(jù)報道,它對綿羊繁殖力遺傳進展的經(jīng)濟效益貢獻率為74%—96%,因此,尋找與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因一直是遺傳育種研究者關(guān)注的重點[1-3]。

GLIS1來源于轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族Kruppel樣鋅指蛋白,是一種在小鼠卵母細胞和受精卵一、二細胞期高表達的蛋白,在小鼠胚胎發(fā)育中的表達具有時空性[4]。GLIS1同時具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制活性,能夠?qū)ε咛グl(fā)育的特定階段進行調(diào)控,對于小鼠的胚胎發(fā)育尤為重要,同時Gli蛋白的表達或活性又受其上下游BMP和Wnt蛋白家族的成員調(diào)控[5]。Takahashi等[6]報道,在體外培養(yǎng)條件下GLIS1基因在卵母細胞以及胚胎發(fā)育不同階段的細胞中表達,且在牛胚胎發(fā)育過程中十分關(guān)鍵。王小海等[7]研究發(fā)現(xiàn),GLIS1基因在小鼠的胚胎發(fā)育以及成纖維細胞的重編程過程中均發(fā)揮重要作用。胚胎發(fā)育成功與否對動物的的生殖力會產(chǎn)生直接影響,因此對影響胚胎發(fā)育過程的重要因子進行研究很有必要。

前期,本實驗室對中國9個地方綿羊品種(分為單羔組和多羔組)共89只綿羊開展了全基因組重測序[8],篩選到綿羊產(chǎn)羔數(shù)候選基因GLIS1及相關(guān)多態(tài)位點。鑒于GLIS1在哺乳動物生殖中的作用還未見報道,本研究對該基因兩個單核苷酸多態(tài)位點g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G在不同綿羊群體中的多態(tài)性進行檢測,并與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析,以探討GLIS1基因與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間是否存在某種內(nèi)在聯(lián)系,以期為綿羊高效育種提供充分的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗動物共包含760只綿羊,具體信息如表1所示。

表1 綿羊樣本具體信息Table 1 Specific information of sheep sample

1.2 SNP位點檢測

由北京君諾德生物技術(shù)有限公司采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)[9]對GLIS1基因兩個多態(tài)性位點g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G在不同產(chǎn)羔數(shù)的綿羊品種中進行基因型檢測。分型樣品為DNA(樣本量20μL,樣品質(zhì)量濃度為40—80 ng∕μL)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS20統(tǒng)計軟件對GLIS1兩個SNP位點多態(tài)性與小尾寒羊各胎次產(chǎn)羔數(shù)分別進行差異顯著性分析,采用比較均值和一般線性模型單因素方差分析中的最小顯著差異(Least significant difference,LSD)法進行分析。使用的相關(guān)性分析模型與寸靜宇[10]和文禹粱[11]論文中報道的一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLIS1基因多態(tài)性分析

通過分型發(fā)現(xiàn),GLIS1基因2個SNP位點在分型的綿羊品種中共存在3種基因型,g.27775611 T＞C位點3種基因型分別是TT、CT和CC,g.27857114 T＞G位點分別是TT、GT和GG(圖1)。

圖1 GLIS1基因分型Fig.1 Genotyping of GLIS1 gene

根據(jù)分型結(jié)果,對2個SNP位點在單、多羔品種中的基因型頻率和等位基因頻率進行統(tǒng)計,并用卡方檢驗的方法驗證單、多羔綿羊品種間的基因型頻率和等位基因頻率之間的差異。

由表2可知,在不同產(chǎn)羔能力的2個綿羊品種之間,GLIS1基因2個SNP位點的等位基因和基因型頻率均達到極顯著水平(P＜0.01)。g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G位點在兩個綿羊品種中的優(yōu)勢等位基因分別為T和G。

表2 GLIS1基因SNP位點在2個綿羊品種中等位基因和基因型頻率分析Table 2 Analysis of allele and genotype frequencies of SNPs at GLIS1 gene in two sheep breeds

對2個SNP位點在6個綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率分別進行統(tǒng)計,并計算該位點在各群體中的多肽信息含量(反映某個等位基因在群體中受選擇的強度,其值大小與受選擇強度成正比)、雜合度和有效等位基因數(shù),并用卡方檢驗該位點在各群體中的平衡狀態(tài)。從表3可知,GLIS1基因g.27775611 T＞C位點在灘羊、薩福克羊和草原型藏羊這三個群體中呈中度多態(tài)(0.25≤PIC＜0.5),在小尾寒羊、蘇尼特羊和杜泊羊3個群體中均呈低度多態(tài)(PIC＜0.25);g.27857114 T＞G位點在薩?？搜蚝投挪囱?個群體中呈中度多態(tài)(0.25≤PIC＜0.5),在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊4個群體中均為低度多態(tài)(PIC＜0.25)。χ2檢驗結(jié)果表明,除了杜泊羊的g.27775611 T＞C位點以及草原型藏羊的g.27857114 T＞G位點外,其余位點在各品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P＞0.05)。

表3 GLIS1基因SNP位點的群體遺傳學分析Table 3 Population genetic analysis of SNPs at GLIS1 gene

2.2 GLIS1基因多態(tài)位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

將2個SNP位點分別與小尾寒羊3個胎次的產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果見表4。GLIS1基因g.27775611 T＞C位點突變顯著影響小尾寒羊第二胎產(chǎn)羔數(shù)(P＜0.05),但對第一胎和第三胎產(chǎn)羔數(shù)無明顯影響(P＞0.05),但總體而言,CC型產(chǎn)羔數(shù)最多,TT型其次,CT型最少;g.27857114 T＞G位點與各胎產(chǎn)羔數(shù)之間均無顯著關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。

表4 GLIS1基因2個SNP位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析Table 4 Analysis between the two SNP loci of GLIS1 gene and litter size in Small Tail Han Sheep

3 討論與結(jié)論

綿羊在我國家畜中占據(jù)重要地位,是三大家畜之一,但絕大多數(shù)綿羊產(chǎn)羔數(shù)低的特點成為我國綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素[12]。因此,如何適當提高綿羊每胎的產(chǎn)羔數(shù)是養(yǎng)羊業(yè)亟待解決的科學難題。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,高產(chǎn)羔數(shù)主效基因分子標記在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用可能是解決其產(chǎn)羔數(shù)低的有效方法。目前科學家已經(jīng)定位了一些與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因,其中最為著名的是BMPR1B[13-15]、BMP15[16-17]、GDF9[18-19]和B4GALNT2[20]。然而綿羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀是一個受微效多基因調(diào)控的復雜性狀,僅僅靠已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)羔數(shù)主效基因分子標記很難在整體上提高綿羊的產(chǎn)羔數(shù),繼續(xù)挖掘與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的基因仍十分必要。本實驗室前期通過全基因組重測序發(fā)現(xiàn)GLIS1基因在單、多羔綿羊之間FST值達到了顯著水平,雖然目前尚無GLIS1基因與動物繁殖性能之間關(guān)系的相關(guān)報道,但已有其在小鼠胚胎發(fā)育中的相關(guān)報道[5],而胚胎發(fā)育也是影響動物最終生殖力的重要階段。因此,本研究首次對候選基因GLIS1多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系進行研究,旨在探討其多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系,從而尋找與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因及關(guān)鍵位點。

通過對GLIS1基因2個SNP位點g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G進行分型分析發(fā)現(xiàn),在不同產(chǎn)羔能力的兩個綿羊品種之間,GLIS1基因2個SNP位點的等位基因和基因型頻率均達到極顯著水平(P＜0.01),表明這2個SNP位點很可能與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。群體遺傳學分析表明,g.27775611 T＞C位點在灘羊、薩福克羊和草原型藏羊中受到中等強度選擇(0.25≤PIC＜0.5),g.27857114 T＞G位點在薩?？搜蚝投挪囱蛑惺艿街械葟姸冗x擇,2個位點在其他綿羊品種中受到選擇的強度很低(PIC＜0.25),該結(jié)果表明不同位點在不同的綿羊品種中會受到不同強度的選擇,不過以上結(jié)果可能與某個綿羊品種遺傳多樣性較低有關(guān),另外,本試驗中有的品種樣本量較少可能也對結(jié)果有一定程度的影響。哈代溫伯格平衡分析結(jié)果表明,在長期的進化和選擇下,兩個位點在遺傳適應(yīng)性上可能具備一定的優(yōu)勢。杜泊羊的g.27775611 T＞C位點和草原型藏羊的g.27857114 T＞G位點均沒有任何突變型,小尾寒羊和灘羊的g.27857114 T＞G位點存在少數(shù)突變雜合個體,但均無突變純合個體,可能是因為純合突變型個體在胚胎發(fā)育過程中就死亡了,而突變雜合型的生存力可能相比野生型也削弱了很多,因此存在的個體很少。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,GLIS1基因的g.27775611 T＞C位點突變純合子在各胎次中產(chǎn)羔數(shù)最高,突變雜合子在各胎次中產(chǎn)羔數(shù)最低且低于突變純合子,且在第二胎中達到了差異顯著水平,但由于突變純合子在所選群體中個體較少,不具有很強的說服力,有待于增加樣本量進一步研究。g.27857114 T＞G位點沒有野生型個體且突變雜合型個體很少,說明該位點突變純合增加了個體的適應(yīng)性,但該位點突變是否增加了產(chǎn)羔數(shù),因沒有野生純合個體所以無法得知。突變純合子在第二胎和第三胎中產(chǎn)羔數(shù)均最高,但與突變雜合子之間未達到差異顯著水平,初步推測g.27857114 T＞G位點雖然對綿羊產(chǎn)羔數(shù)有一定影響,但可能并不是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)鍵位點。

本研究初步得出以下結(jié)論:GLIS1基因錯義突變位點g.27775611 T＞C(蘇氨酸→丙氨酸)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān),可能參與綿羊生殖調(diào)控;而錯義突變位點g.27857114 T＞G(蘇氨酸→脯氨酸)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)。