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    高原鏈帶藻抗氧化蛋白分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

    2021-08-27 04:50:55孔婉瑩李旭洪瑜胡云龍
    中國食品 2021年15期
    關(guān)鍵詞:緩沖溶液高原質(zhì)譜

    孔婉瑩 李旭 洪瑜 胡云龍

    眾所周知,人類一切疾病的根源都是因?yàn)樽杂苫?,自由基會影響?xì)胞的活性,嚴(yán)重的還會殺滅細(xì)胞,因此,要想保證人體健康,就必須要清除自由基,而抗氧化物則可以有效地解決這一問題??寡趸锿ㄟ^清除體內(nèi)的自由基,同時(shí)減少組織氧化,以此來達(dá)到保護(hù)機(jī)體的最終目的。天然的抗氧化物相較于合成物而言,有著更好的應(yīng)用效果,其副作用小,同時(shí)能夠降低免疫系統(tǒng)活性的干擾,因而有著更好的促氧化效果。

    高原鏈帶藻是從我國西藏那曲青龍鄉(xiāng)普保巴村巴木錯湖分離得到的,經(jīng)過初步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),高原鏈帶藻在常溫常壓的條件下進(jìn)行培養(yǎng),其在培養(yǎng)基中生長6d之后,藻類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到了71.68%,同時(shí)對蛋白粗提取物進(jìn)行測試后發(fā)現(xiàn),其蛋白具有一定的抗氧化性,能夠有效地對氫氧根離子以及DPPH自由基進(jìn)行清除,且清除能力較強(qiáng)。本文中主要針對高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行分析,利用柱層析方法進(jìn)行高原連帶藻蛋白的分離純化,并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的測試,以此來對高原鏈帶藻抗氧化蛋白進(jìn)行更為深入的檢測研究。

    一、材料與方法分析

    1.高原鏈帶藻的培養(yǎng)及蛋白粗提取。在進(jìn)行高原鏈帶藻的培養(yǎng)過程中,首先在500mL的搖瓶中加入250mL的BG11培養(yǎng)液,進(jìn)行接種時(shí)其濃度為1×106個(gè)/mL,同時(shí)培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃,光照條件為108μmol/(㎡·s),光暗周期則為12L。在該培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6天后進(jìn)行抽濾操作,收集所需要的高原鏈帶藻細(xì)胞,將之進(jìn)行冷凍處理,備用。

    在進(jìn)行高原鏈帶藻抗氧化蛋白的粗提取時(shí),首先需要取凍干的微藻細(xì)胞粉末50mg放入研缽中,在冰水浴的條件下進(jìn)行研磨,取其上清液,利用緩沖溶液定容,最后加入硫酸銨直到其飽和度的80%,攪拌均勻后待用。靜置30min之后,收集蛋白沉淀并用磷酸緩沖液進(jìn)行再次溶解,再經(jīng)過后續(xù)一系列的操作后便完成了蛋白的粗提取。

    2.高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化。進(jìn)行抗氧化蛋白的分離純化時(shí),需要使用到AKTA Prime蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行操作。在此過程中,首先將蛋白的濃縮液濃度調(diào)節(jié)為20mg/mL,并在填料柱上樣1mL,使用氯化鈉溶液溶于磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,控制好洗脫的流速,由此來收集各峰的組分。收集到各個(gè)部分的組分之后,需要使用磷酸緩沖溶液進(jìn)行再次溶解,將蛋白的濃度控制在8mg/mL,再用1mol/L的氯化鈉和氫氧化鈉溶液分別沖洗,由此便將所得到的抗氧化蛋白進(jìn)行了再次的分離純化,所得到的最終產(chǎn)品也更為純凈。

    3.高原鏈帶藻結(jié)構(gòu)的鑒定分析。進(jìn)行高原鏈帶藻抗氧化蛋白結(jié)構(gòu)的鑒定分析時(shí),首先需要將10μg純化后的抗氧化蛋白用50mmol/L的TEAB緩沖溶液復(fù)溶,之后加入0.2μg的混合酶液,在37℃的條件下進(jìn)行酶解,6h之后將產(chǎn)物多肽進(jìn)行低溫真空干燥,并使用乙腈溶液進(jìn)行復(fù)溶,產(chǎn)物進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,即利用相關(guān)軟件對質(zhì)譜圖所對應(yīng)的多肽段序列進(jìn)行分析。在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上還可以使用Phyre2在線程序進(jìn)行高級結(jié)構(gòu)的模擬分析。

    二、結(jié)果與分析

    1.高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化。高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化都是在4℃的條件下進(jìn)行的,經(jīng)過離子交換柱的分離之后,得到了3個(gè)主要的蛋白峰,且洗脫體積為22-77mL時(shí)洗脫液顯示了抗氧化活力。在此過程中,抗氧化蛋白也得到了較好的分離,其總質(zhì)量為5.7mg。

    2.抗氧化蛋白處理對于細(xì)胞MDA水平和SOD、CAT活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,氧化脅迫能夠促使產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)MDA,由此便破壞了細(xì)胞膜的完整性,同時(shí)也會導(dǎo)致SOD和CAT失活,這三方面的指標(biāo)都能在一定程度上反映出細(xì)胞受到自由基攻擊的程度,經(jīng)過過氧化氫處理后的細(xì)胞中,MDA、SOD以及CAT的含量都有所變化,其具體的影響如表1所示。

    3.高原鏈帶藻抗氧化蛋白結(jié)構(gòu)。通過質(zhì)譜分析可知,高原鏈帶藻抗氧化蛋白主要是由408個(gè)氨基氨基酸按照一定序列所組成的,且經(jīng)過ExPasy在線程序的分析顯示,其蛋白質(zhì)分子量為44.8kD。

    本文中對于高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行了分析探討,由此對于高原鏈帶藻有了更為深入的認(rèn)識。

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