牛耳楓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

唐靖雯 彭政忠 潘梅 李嬌嬌 楊桃 潘婷 王歡

【摘 要】 目的：提升牛耳楓藥材質(zhì)量控制方法。方法：對(duì)牛耳楓形態(tài)、顯微特征進(jìn)行鑒定;薄層鑒別法（TLC）定性鑒別蘆丁;《中國(guó)藥典》方法測(cè)定水分、總灰分和浸出物含有量;高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定蘆丁含有量。結(jié)果：TLC斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好;蘆丁在0.200～1.403μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.9996），平均加樣回收率為101.65%，RSD為2.42%。20批樣品水分、總灰分、浸出物含有量范圍分別為4.35%～12.81%、3.06%～6.13%、11.19%～23.37%。結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠，可用于牛耳楓藥材的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 牛耳楓;薄層鑒別;含量測(cè)定;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）13-0069-06

Abstract：Objective To improve the quality standards of Daphniphyllum calycinum Benth. Methods The morphological and microscopic characteristics of Daphniphyllum calycinum Benth were identified; Rutin was used for qualitative identification by TLC; Chinese pharmacopoeia method for the determination of moisture， total ash and extract content; Content of rutin was determined by HPLC.Results TLC spots were clear and repeatable. Rutin had a good linear relationship in the range of 0.200～1.403 μg （r=0.9996）. The average sample recovery was 101.65% and the RSD was 2.42%. The contents of water， total ash and extractables in 20 batches of samples ranged from 4.35% to 12.81%， 3.06% to 6.13%， 11.19% to 23.37%. Conclusion The method is stable and reliable， and can be used for quality control of Daphniphyllum calycinum Benth.

Keywords：Daphniphyllum Calycinum Benth;TLC;Content Determination;Quality Standard

牛耳楓為虎皮楠科交讓木屬植物牛耳楓Daphniphyllum calycinum Benth的干燥帶葉莖枝，收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，具有清熱解毒、活血舒筋的功效，分布于湖南、廣東、江西等地[1-2]。主要含有黃酮類(lèi)化合物及少量的生物堿、三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)和酚酸類(lèi)等其它化合物，其中黃酮類(lèi)化合物蘆丁不僅具有調(diào)節(jié)毛細(xì)血管壁的滲透性和脆性、防止血管破裂、止血的作用，還具有抗菌消炎、抗氧化等作用[3-4]。牛耳楓可治療糖尿病、心血管疾病和高血壓等多種疾病，其葉和種子中含有的生物堿具有抗腫瘤的作用[5]，種子可榨油做肥皂、潤(rùn)滑油等[6]。牛耳楓作為臨床上常用中藥，其質(zhì)量真?zhèn)?、?yōu)劣嚴(yán)重影響臨床療效，但目前只有《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[7]的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀、顯微鑒別，缺少具有代表性的薄層鑒別和含量測(cè)定，不夠全面反映牛耳楓藥材的內(nèi)在質(zhì)量，達(dá)不到判斷質(zhì)量?jī)?yōu)劣的目的。因此本研究在牛耳楓的性狀、顯微鑒別的基礎(chǔ)上增加薄層鑒別、含量測(cè)定，并考察了水分、總灰分和浸出物，以更有效地鑒定牛耳楓藥材質(zhì)量，為牛耳楓藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供鑒定依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀Agilent-1260型（美國(guó)Agilent公司）;檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器;萬(wàn)分之一電子天平AY120型（日本島津公司）;十萬(wàn)分之一電子天平AG135型（瑞士梅特勒公司）。

1.2 藥品與試劑 乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司）;娃哈哈純凈水;水合氯醛、間苯三酚、濃鹽酸、稀甘油均為分析純;牛耳楓對(duì)照藥材（批號(hào)：121660-201201），中國(guó)食品藥品檢定研究院;蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201409;含量：91.9%），中國(guó)食品藥品檢定研究院。

研究所用的牛耳楓藥材均來(lái)源于廣西、湖南和廣東等地，詳見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒別 主干呈類(lèi)圓柱形，直徑0.8～4.0cm，切后呈斜切片，切片橢圓形，直徑1.0～5.0cm，厚0.3～1.0cm，皮表面具皮孔，灰褐色至褐色，質(zhì)堅(jiān)硬，不易折斷;枝呈圓柱形，直徑0.3～2.0cm，切后呈斜切片狀或枝段，切片橢圓形，直徑0.3～3.0cm，厚0.2～0.8cm，枝段直徑0.3～0.5cm，長(zhǎng)0.5～1.5cm，表面灰綠色或淺灰棕色，具稀疏皮孔，體輕質(zhì)硬，較難折斷，斷面灰白色或淺棕色，髓部疏松或形成髓腔。葉片基部寬楔形，全緣;上表面草綠色至淺灰棕色，下表面淺綠色至灰棕色;葉脈下表面突起，側(cè)脈明顯;葉柄長(zhǎng)3～8cm，革質(zhì)。偶見(jiàn)果實(shí)，果實(shí)卵圓形，具有不規(guī)則的皺紋。氣微，味苦澀。如圖1所示。

2.2 顯微鑒定 莖橫切面：表皮具表皮細(xì)胞1列，外被厚角質(zhì)層;有的老枝可見(jiàn)木栓層。皮層由數(shù)列至十余列薄壁細(xì)胞組成，內(nèi)含眾多草酸鈣簇晶，有的薄壁細(xì)胞含黃褐色塊狀物。韌皮部由1～2列細(xì)胞組成韌皮射線(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)草酸鈣簇晶。木質(zhì)部寬廣，導(dǎo)管類(lèi)方形或多角形，多單個(gè)或 2～3個(gè)成群，木纖維胞腔較大，木射線(xiàn)為1～2列細(xì)胞組成。髓部薄壁細(xì)胞類(lèi)圓形;中央多成空隙。葉表面觀：上表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲，部分細(xì)胞含草酸鈣簇晶，常并列或成群分布。下表皮細(xì)胞垂周壁較平直，乳頭狀突起呈小圓圈狀，氣孔平軸式;草酸鈣簇晶較多，常并列或成群分布。粉末：粉末灰褐色或黃灰色。內(nèi)含草酸鈣簇晶較多，直徑10～30μm，大多存在于細(xì)胞內(nèi)。石細(xì)胞類(lèi)圓形或類(lèi)長(zhǎng)多角形，胞腔內(nèi)含紅棕色內(nèi)含物。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管和梯紋導(dǎo)管，直徑23～45μm。纖維束狹長(zhǎng)，長(zhǎng)短不一。粉末中偶有破碎的細(xì)胞塊，如葉下表皮細(xì)胞垂周壁較平直，乳頭狀突起呈小圓圈狀，氣孔平軸式。如圖2所示。

2.3 薄層鑒別 取牛耳楓粉末1g，加甲醇25mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取牛耳楓對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液;再取蘆丁對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1.0mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視，結(jié)果如圖3所示。在供試品、對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.4 檢查項(xiàng)及浸出物 采用2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0832水分測(cè)定法第二法（烘干法）測(cè)定含水量，通則2302灰分測(cè)定法測(cè)定總灰分，通則2201項(xiàng)下醇溶性浸出物測(cè)定法（熱浸法）測(cè)定浸出物含量（溶劑：稀乙醇），平行3份，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，初步擬定含水量不超過(guò)11.0%，總灰分含有量不得超過(guò)5.0%，浸出物含有量不得少于14.0%。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18 （250mm×4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（54∶46，V/V）;流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：354nm;柱溫：25℃;進(jìn)樣量：10μL;理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.5.2 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備：取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)二號(hào)篩）約2g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，稱(chēng)定重量，加熱回流1h，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.5.2”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液及缺牛耳楓藥材的陰性空白溶液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分離度R=1.8，理論塔板數(shù)為5500。色譜如圖4所示。

2.5.4 線(xiàn)性關(guān)系 精密吸取蘆丁對(duì)照品貯備液（200.34μg/mL） 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分別置10mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別進(jìn)樣10μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10μL， 記錄峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸?；貧w方程：A=1696.9C-21.296，r=0.9996。結(jié)果表明，蘆丁在0.200～1.403μg范圍內(nèi)，其質(zhì)量數(shù)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液（80.2μg/mL） 10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積。結(jié)果RSD為1.17%，表明儀器精密度較好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取牛耳楓藥材按“2.5.2”項(xiàng)下法制成供試品溶液，“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、3、6、9、15、24h測(cè)定其峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.41%，說(shuō)明牛耳楓藥材供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取牛耳楓藥材粉末（藥材編號(hào)：Y063-15-11-24-01）6份，按 “2.5.2”項(xiàng)下法制成供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外表一點(diǎn)法計(jì)算蘆丁含量。結(jié)果，蘆丁含量的RSD為1.47%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取9份已知含量的牛耳楓藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩） （藥材編號(hào)：Y063-15-11-24-01） 1g，置于具塞錐形瓶中，按蘆丁對(duì)照品與牛耳楓藥材中蘆丁含量1.5∶1、1∶1、0.5∶1加入蘆丁對(duì)照品，按“2.5.2”項(xiàng)下法制成供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：牛耳楓藥材中蘆丁平均回收率為101.65%，RSD為2.42%，說(shuō)明該方法可用于測(cè)定牛耳楓藥材中蘆丁的含量，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

2.5.9 樣品含量測(cè)定 取20批不同產(chǎn)地牛耳楓藥材，按“2.5.2”項(xiàng)下法制成供試品溶液和按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定其峰面積。以干燥品計(jì)算牛耳楓藥材中蘆丁的含量（%）。結(jié)果詳見(jiàn)表4。根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，初步擬定蘆丁含量不得低于0.07%。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的確定 牛耳楓主要成分為黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)和生物堿類(lèi)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，從牛耳楓枝干和葉中分離可得到羽扇豆酮、β-谷甾醇、胡蘿卜苷、deoxycalyciphylline B、daphiodhanins D、calyciphylline B、槲皮素、蘆丁等化合物，其蘆丁是牛耳楓中主要的黃酮類(lèi)成分;因此，本研究以蘆丁作為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 展開(kāi)劑的考察 本研究以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G板為載體，5%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，曾采用乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（20∶5∶1）[9]、甲苯（水飽和）-甲酸乙酯-甲酸（4∶4∶2）[10]作為展開(kāi)劑進(jìn)行研究，但因斑點(diǎn)不清晰，且存在拖尾現(xiàn)象;因此，研究中調(diào)整了展開(kāi)劑及比例，分別以丙酮-乙酸-水（9∶1∶1）、丙酮-甲酸-水（10∶1∶1）、乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑進(jìn)行考察研究，結(jié)果表明：以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑，斑點(diǎn)清晰，分離度好。

3.3 TLC法耐用性考察 本研究考察了溫度（25℃、4℃）、相對(duì)濕度（75%、52%） 、廠家、薄層硅膠板（G型、H型）對(duì)蘆丁TLC鑒別的影響，發(fā)現(xiàn)各廠家G 型硅膠板在不同溫度、相對(duì)濕度下，TLC 色譜圖中蘆丁斑點(diǎn)清晰，與相鄰斑點(diǎn)分離度較好，而H 型硅膠板效果較差，故選擇G 型板。

3.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色譜柱[Ultimate XB-C18（250×4.6mm）、Diamonsil C18 （250×4.6mm，5μm）、Agilent TC-C18 （2） （250×4.6mm，5μm）]，柱溫（25℃、30℃、40℃），流動(dòng)相比例[乙腈-0.1%磷酸（16∶84）、乙腈-0.1%磷酸（15∶85）、乙腈-0.11%磷酸（14∶86）]，流速（0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min），考察發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相比例和流速的改變對(duì)蘆丁的檢測(cè)影響較大。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)牛耳楓水分、灰分、浸出物的測(cè)定，為制訂牛耳楓藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);對(duì)牛耳楓顯微鑒別、薄層鑒別、含量測(cè)定進(jìn)行較為全面的研究，建立專(zhuān)屬性強(qiáng)的定性、定量測(cè)定方法，能夠準(zhǔn)確、科學(xué)地評(píng)價(jià)牛耳楓質(zhì)量，也為相關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)的制定以及現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

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（收稿日期：2020-12-09 編輯：陶希睿）