特異性檢測卵形鯧鲹源哈維氏弧菌的核酸適配體的篩選與鑒定*

余 慶，劉明珠，李夢夢，黃帥帥,3，徐鳳巧，李鵬飛,3**

(1.廣西科學院，廣西壯族自治區(qū)漁業(yè)重大疫病防控與高效健康養(yǎng)殖產業(yè)技術工程研究中心，廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007；2.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007；3.北部灣大學海洋學院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西欽州 535011)

0 引言

我國是水產養(yǎng)殖大國，但近年來水產病害的暴發(fā)和流行給水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失[1,2]。其中，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是海水養(yǎng)殖動物的主要致病菌之一，常見于廣西等華南沿海地區(qū)，嚴重威脅著該地區(qū)水產養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3-5]。目前主要采用抗生素等化學藥物治理水產養(yǎng)殖中的弧菌病，但化學藥物抗菌效果的持續(xù)時間短，且近年來抗生素的濫用加劇了病原菌耐藥性的產生，帶來了水產品有害藥物殘留等重大食品安全問題[6]。針對哈維氏弧菌的檢測方法主要包括：基于細菌生理生化反應的檢測方法、基于抗體的免疫學檢測技術，以及聚合酶鏈式反應(PCR)等[7-9]。這些方法雖然能精確診斷哈維氏弧菌，但存在操作繁瑣、檢測耗時長、試劑保存條件苛刻等不足，從而難以滿足在養(yǎng)殖現場快速、準確檢測哈維氏弧菌的要求。弧菌病的防治一直是水生病害防控技術研究的重點，而發(fā)展成本低、耗時短、操作便捷、靈敏度高的致病菌快速檢測技術，有助于及早發(fā)現、確定病原，進而制定精確的治療方案來控制病原擴散，降低水產養(yǎng)殖業(yè)的經濟損失[10]。

指數富集的配基系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)是一種生物文庫篩選技術，該技術使用容量高達1×1014-1×1015的隨機寡核苷酸文庫，在體外經過多輪篩選，最終獲得能夠特異性識別靶物質的單鏈寡核苷酸，即核酸適配體[11]。核酸適配體作為一種新型的識別分子，具有易篩選、易修飾、穩(wěn)定性強、高特異性識別靶標分子等優(yōu)點，目前已廣受關注并發(fā)展成為一類新型的檢測和治療工具[12-16]。通常，篩選核酸適配體只需要6-30個SELEX循環(huán)，時間僅為3-8周，遠低于制備生物抗體的時間(3-8個月)，而且可避免生物抗體存在的成本高、易失活、保存條件苛刻、批次間的抗體質量存在差異等問題。另外，SELEX技術是在體外進行的化學篩選過程，因此靶標分子范圍廣范，包括金屬離子、有機染料等簡單體系，以及病毒、細胞、組織等復雜體系；特別是具有細胞毒性、無免疫原性或者弱免疫原性的靶標分子，使用SELEX技術可實現體外高特異性核酸適配體的篩選[11]。鑒于SELEX技術的優(yōu)點，核酸適配體的研究已受到國內外學者的廣泛關注，并在生物化學、生物醫(yī)學、納米材料、蛋白質科學等多學科得到迅速發(fā)展。但是，我國對核酸適配體應用于水產病害防治領域的研究尚顯不足，待發(fā)展空間巨大。

本研究以哈維氏弧菌為靶標，利用SELEX技術篩選獲得可高特異性、高親和性識別哈維氏弧菌的核酸適配體，并對其性質進行系統(tǒng)性分析，包括核酸適配體的特異性、細胞毒性和靶位點的性質等，從而為水產病害的檢測和防控提供新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)從廣西北海市鐵山港海域網箱養(yǎng)殖的發(fā)病卵形鯧鲹中分離得到，編號為GT-V.harveyi1[17]。溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)從廣西欽州灣網箱養(yǎng)殖的發(fā)病卵形鯧鲹中分離得到，編號為TOQZ01[18]。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)從廣西南寧池塘養(yǎng)殖的發(fā)病草魚中分離獲得。

實驗儀器：TS2倒置光學顯微鏡(日本Nikon公司)，ACSAria Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司),Nano Drop one超微量分光光度計(美國Thermo公司),Mastercycler nexus gradient PCR儀(德國Eppendorf公司),AC2-4S1生物安全柜(新加坡ESCO公司),Centrifuge 5417R離心機(德國Eppendorf公司),Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),DK-8D水浴鍋(博訊公司)。試劑材料：鏈酶親和素標記的磁珠(美國Thermo公司)；PCR純化回收試劑盒、膠回收試劑盒、DL2000 Marker、DL50 bp Marker(日本TakaRa公司)。磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)：2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L Na2HPO4，137 mmol/L NaCl，pH值為7.2。

1.2 方法

1.2.1 隨機單鏈DNA文庫(ssDNA Library)和引物的設計合成

用于核酸適配體篩選的隨機單鏈DNA文庫(ssDNA Library)、引物和核酸適配體均委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。隨機起始單鏈DNA文庫中每條核酸單鏈均由中間50 bp的隨機核苷酸序列(N50)和兩端的固定核苷酸序列構成(5′-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-N50-CGAA-GGACGCAGAGAAGTCTC-3′)。上游引物(Forward Primer,FP):5′-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3′，下游引物(Reverse Primer,RP)：5′-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3′。其中，上游引物5′端標記著羥基熒光素(6-carboxy-fluorescein labeled FP,FAM-FP)，下游引物5′端引物標記著生物素(Biotin labeled RP,biotin-RP)。

1.2.2 SELEX技術篩選特異性識別哈維氏弧菌的核酸適配體

以羥基熒光素(FAM)標記的隨機單鏈DNA文庫與哈維氏弧菌的孵育結合為對照(Con)，利用流式細胞術進行FAM熒光值檢測。4 nmol的起始文庫溶于1 000 μL PBS中，在92℃高溫變性10 min，然后迅速插入到冰中復性10 min；起始文庫與哈維氏弧菌在冰上孵育結合1 h；用PBS緩沖液離心清洗3次，隨后將其在92℃水浴中處理5 min，離心分離得到與哈維氏弧菌結合的ssDNA；將分離得到的ssDNA作為模板進行PCR擴增。PCR程序：預變性94℃ 2 min，擴增20個循環(huán)(94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min)，終延伸72℃ 5 min。將100 μL鏈酶親和素標記的納米磁珠與PCR擴增所得的雙鏈DNA在常溫下孵育20 min，利用生物素與鏈酶親和素的親和作用，將雙鏈DNA結合到磁珠表面；將離心管放在磁性分離器上除去上清，用1 mL PBS洗滌磁珠；然后在離心管中加入200 μL NaOH (200 mmol/L)溶液，室溫反應15 min，利用磁性分離器分離回收上清；用PCR純化回收試劑盒回收上清液中的正向ssDNA單鏈核酸，收集到含有ssDNA文庫的溶液用于下一輪的篩選。為提高篩選得到的ssDNA文庫的特異性和親和力，在隨后的篩選中，逐步縮短文庫與哈維氏弧菌的結合時間，同時減少哈維氏弧菌和ssDNA文庫的使用量，增加PBS緩沖液清洗靶標細胞的次數。

1.2.3 核酸適配體的序列分析

對最終獲得的核酸適配體庫進行克隆、測序，確定各適配體的DNA序列。具體操作如下：將最終得到的核酸適配體庫經PCR擴增成dsDNA；切膠純化后連接到pMD18-T載體并轉化到大腸桿菌DH5α中；菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基(氨芐抗性)上，倒置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；挑取100個單菌落并交由基因公司測序分析，得到核酸適配體序列。使用MFOLD(http://mfold.rna.albany.edu/?q=Mfold/DNA-Folding-Form)在線預測篩選得到核酸適配體的二級結構。

1.2.4 核酸適配體識別結合哈維氏弧菌的特異性分析

使用流式細胞術分析核酸適配體與哈維氏弧菌的特異性結合。本研究中使用FAM對核酸適配體進行標記，羥基熒光素激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為535 nm。將FAM標記的核酸適配體與哈維氏弧菌孵育結合，然后使用流式細胞儀進行熒光分析。在相應波長范圍內檢測熒光信號，根據信號強弱判斷核酸適配體與哈維氏弧菌的特異性識別結合情況。具體操作如下：FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)經過92℃恒溫水浴變性、冰浴復性處理，然后與哈維氏弧菌4℃結合1 h，孵育結束后離心重復清洗3次，并混勻在500 μL PBS中，使用流式細胞儀進行熒光檢測。對照組共4組，對照組1 (Con1)是FAM標記的非特異性起始庫(200 nmol/L)和哈維氏弧菌的孵育結合；對照組2 (Con2)是FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)和溶藻弧菌的孵育結合；對照組3 (Con3)是FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)和嗜水氣單胞菌的孵育結合；對照組4 (Con4)是FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)和維氏氣單胞菌的孵育結合。每個反應均做3個重復。

1.2.5 核酸適配體的細胞毒性分析

在96孔板中接入石斑魚脾臟細胞(Grouper spleen cell line,GS)，28℃培養(yǎng)18 h。然后將核酸適配體在細胞培養(yǎng)基中稀釋至不同濃度(0,100,500,1 000 nmol/L)。將不同濃度的核酸適配體分別與GS細胞于28℃條件下孵育48 h，對細胞進行光鏡觀察、拍照。然后在各孔中加入10 μL CCK-8溶液，室溫孵育4 h后，利用酶標儀檢測450 nm的吸光值來檢測細胞活性，以未與核酸適配體孵育的正常GS細胞作為對照組，做3個平行實驗。將測得的吸光值代入如下公式(1)，計算各組的細胞存活率(Survival Rate,SR)[19]：

SR (%) =OD450(實驗組)/OD450(對照組)×100%。

(1)

1.2.6 核酸適配體的靶標性質分析

將哈維氏弧菌用胰酶消化處理10 min，離心并使用500 μL PBS重復清洗3次，然后與FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)在4℃孵育1 h，然后離心重復清洗3次，并混勻在500 μL PBS中，使用流式細胞儀進行熒光檢測，該組為實驗組(Test)。對照組為FAM標記的200 nmol/L核酸適配體(Con)與未經胰酶消化處理的哈維氏弧菌孵育結合。每個反應均做3個重復。

1.2.7 數據統(tǒng)計方法

應用Excel 2010及SPSS 26軟件進行數據處理及統(tǒng)計，采用非參數T檢驗及卡方檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 SELEX技術篩選哈維氏弧菌的特異性核酸適配體

隨著篩選輪數(共10輪)增加，ssDNA文庫的特異性逐步升高(圖1)，其中，第9輪的ssDNA文庫對哈維氏弧菌的特異性結合豐度最高。因此對第10輪的ssDNA文庫進行克隆測序，得到2條核酸適配體H10和H13 (表1)。

Con表示FAM標記的隨機單鏈核酸ssDNA文庫與哈維氏弧菌的結合；**P<0.01表示差異極顯著,NS表示無顯著性差異

表1 核酸適配體的核苷酸序列

2.2 核酸適配體H10和H13的二級結構預測與分析

核酸適配體H10和H13的二級結構均能夠形成獨特復雜的莖環(huán)結構(圖2)，且H10的吉布斯自由能(ΔG=-32.4 KJ/mol)低于H13 (ΔG=-14.46 KJ/mol)，表明H10的結構比H13穩(wěn)定。

圖2 核酸適配體H10和H13的二級結構預測

2.3 核酸適配體H10和H13的特異性分析

使用流式細胞術對篩選獲得的核酸適配體H10和H13的特異性進行檢測(圖3)，結果顯示，實驗組中哈維氏弧菌分別與核酸適配體H10和H13孵育后所檢測到的熒光值高，并顯著高于4組對照組(Con1、Con2、Con3、Con4)，表明核酸適配體H10和H13能夠高特異性識別結合哈維氏弧菌。

Con1、Con2、Con3和Con4表示FAM標記的非特異性起始庫(200 nmol/L)分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌的孵育結合; **P<0.01表示差異極顯著

2.4 核酸適配體H10和H13的細胞毒性分析

核酸適配體H10和H13的細胞毒性光鏡觀察結果顯示(圖4)，不同濃度的核酸適配體與細胞孵育48 h后，與對照組(0 nmol/L)相比，細胞形態(tài)正常，無明顯病變。當核酸適配體H10和H13的濃度為1 000 nmol/L時，實驗組細胞的存活率均高于99%，并且實驗組細胞存活率與對照組細胞無顯著性差異(圖5)，表明核酸適配體H10、H13無明顯的細胞毒性，這與此前報道核酸適配體無細胞毒性的研究結果一致[10,13,16,19]。

圖4 不同濃度的核酸適配體孵育細胞后的光鏡結果

NS表示組間差異不顯著

2.5 核酸適配體H10和H13的靶標性質分析

與對照組相比，實驗組中胰酶消化處理后哈維氏弧菌的熒光值均顯著降低(圖6)，表明核酸適配體H10和H13對哈維氏弧菌表面的靶位點均為膜蛋白或膜蛋白相關結構。

Con表示FAM標記的非特異性起始庫(200 nmol/L)和哈維氏弧菌的孵育結合；**P<0.01表示差異極顯著

3 討論

哈維氏弧菌是危害卵形鯧鲹、石斑魚、對蝦等大宗海水養(yǎng)殖動物的主要弧菌病原之一，其所導致的疾病具有高發(fā)、頻發(fā)、死亡率高等特點，嚴重危害著我國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[1-4,17]。而針對哈維氏弧菌的快速檢測診斷技術和抑菌技術等進行系統(tǒng)研究，并開發(fā)出具有市場發(fā)展?jié)摿Φ目焖贆z測試劑盒和抗病害功能產品，將有助于高效控制海水養(yǎng)殖中哈維氏弧菌的危害。

目前，已報道了一些針對水生病原微生物的特異性核酸適配體[11]，包括溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[20-22]，創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[23]，沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)[24]，卵形鯧鲹源神經壞死病毒(Trachinotusovatusnervous necrosis virus)[25]，病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus)[26]，中華鱉虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus)[14]，赤點石斑魚神經壞死癥病毒(Red spotted grouper nervous necrosis virus)[27,28]，牙鲆彈狀病毒(hirame rhabdovirus)[29]，石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus)[16,19]，草魚呼腸孤病毒(Salmonellatyphimurium)[30,31]等。當前，SELEX技術尚未實現自動化和標準化，因此將不同物質作為靶標進行核酸適配體的篩選時，由于靶物質大小、性質等諸多差異，造成所需的SELEX技術篩選輪數和參數均顯著不同，這就使得篩選高特異性識別靶物質的核酸適配體的難度顯著提升。例如，Liang等[22]經過多達35輪的反復篩選，最終獲得高特異性識別狂犬病病毒感染細胞的核酸適配體，而Yu等[16]僅通過11輪的SELEX篩選就獲得了特異性識別石斑魚虹彩病毒的核酸適配體。在本研究中，以哈維氏弧菌活菌為靶標進行核酸適配體的篩選，綜合運用SELEX技術、磁性分離技術、流式細胞術等，經過9輪篩選獲得能夠高特異性、高親和性識別哈維氏弧菌活菌的兩條ssDNA核酸適配體H10和H13，隨后二級結構預測分析表明H10和H13均能夠形成獨特復雜的莖環(huán)結構，而且核酸適配體H10和H13對哈維氏弧菌均具有較好的特異性結合能力(圖3)，并且對細胞無毒副作用(圖4)。進一步研究發(fā)現，核酸適配體H10和H13對哈維氏弧菌表面的靶位點均為膜蛋白或膜蛋白相關結構(圖6)。據報道，核酸適配體能夠在二級結構的基礎上，通過氫鍵、G四聯體、范德華力、疏水作用力、堿基堆積等折疊形成更復雜的三級結構，進而與靶物質發(fā)生特異性識別和結合[11]。目前，大規(guī)模應用核酸適配體的限制條件之一是合成成本較高。然而，考慮到原代核酸適配體中兩端的引物序列等核苷酸序列或結構域對于其特異性是必需的，因此在未來研究中，有必要對核酸適配體的高特異性識別靶物質的核苷酸序列等必需序列進行分析鑒定，這對于優(yōu)化核酸適配體結構、降低其合成成本、研發(fā)基于核酸適配體的市場化功能產品具有重要意義[32]。

核酸適配體作為新型的核酸分子探針，具有特異性高、親和性強、無免疫原性、穩(wěn)定性高、高溫導致的結構變性具有可逆性、易于合成和化學修飾、批次間質量穩(wěn)定等諸多優(yōu)點，因此核酸適配體已成為廣受關注的新型檢測和治療工具，并廣泛應用于病原檢測、疾病診斷、靶向藥物開發(fā)和細胞功能分析等生命科學各領域的研究中[11,33-37]。例如，利用核酸適配體能夠高特異性識別病原微生物的特性，構建高靈敏的檢測技術，用于病原快速檢測和疾病精確診斷[11]。Li等[38]利用高特異性識別結合石斑魚虹彩病毒感染細胞的核酸適配體Q3構建出新型的酶聯核酸適配體吸附檢測技術(Aptamer-based Enzyme-Linked Apta-Sorbent Assay,ELASA)，成功檢測出樣品中石斑魚虹彩病毒，靈敏度可媲美PCR技術。Yu等[39]利用特異性識別溶藻弧菌的核酸適配體VA2構建了VA2-ELASA技術，該技術可用于致病性溶藻弧菌的快速檢測，具有特異性強、靈敏度高的特點。Zhou等[40]以石斑魚神經壞死病毒的衣殼蛋白(Coat Protein,CP)為靶標，篩選獲得特異性識別CP蛋白的核酸適配體A10，并建立了適配體-衣殼蛋白-適配體的“三明治”夾心酶聯吸附檢測技術，能夠用于魚類神經壞死病毒的精確快速檢測。余慶等[41]利用核酸適配體Q5構建出核酸適配體Q5熒光分子檢測探針(Aptamer Q5-based fluorescent molecular probe,Q5-AFMP)，并證實Q5-AFMP能夠高特異性、高靈敏性識別石斑魚虹彩病毒，有望開發(fā)出實用的病毒快速檢測功能產品。此外，基于核酸適配體開發(fā)的高靈敏生物傳感器，已成功應用于金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和沙門氏菌等多種致病菌的快速精確檢測[34]。基于本研究篩選得到核酸適配體H10和H13，具有高特異性和高親和性識別結合哈維氏弧菌的特性，因此，未來可利用核酸適配體H10和H13開展哈維氏弧菌快速檢測診斷技術的研究，以期實現對哈維氏弧菌病的快速診斷、實時監(jiān)控和有效預防。

4 結論

本研究以重要的水生病原哈維氏弧菌為靶標，運用SELEX技術篩選獲得ssDNA核酸適配體H10和H13，這兩種核酸適配體在識別哈維氏弧菌過程中顯現出高特異性、高親和性，并且細胞無毒性等優(yōu)點。該成果有望用于構建成本低、快速便捷、靈敏度高的哈維氏弧菌檢測技術，并在水生病原快速檢測技術研發(fā)領域展現出良好的應用前景。