ALI時MicroRNA-21通過PTEN調(diào)控PI3KAKT途徑影響MSC存活的研究

邵建平 蔡施霞 孫運波 方巍 劉冰 李連弟

感染、創(chuàng)傷、休克、輸血等均可造成肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性損傷、肺泡上皮細(xì)胞彌漫性損傷，進(jìn)而出現(xiàn)急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。急性肺損傷是以機械通氣為主的器官支持治療，肺損傷的修復(fù)主要依靠殘留肺組織自身的增殖和分化修復(fù)能力受到限制，且容易導(dǎo)致?lián)p傷后肺泡結(jié)構(gòu)的毀損和肺纖維化；因此，外源性給予間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）為ALI的損傷修復(fù)提供了新的途徑。外源性予以間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）源于中胚層，具有高度自我更新能力和多向分化潛能；臨床前期試驗證實予以外源性間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢至損傷肺組織，分化為肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)損傷肺組織的修復(fù)，提高急性肺損傷的生存率。但MSC移植后存活率極低，移植入肺自身細(xì)胞的數(shù)量少，MSC能表達(dá)多種microRNAs（miRNAs）在自身增殖及凋亡中發(fā)揮重要作用；因此，探討ALI時調(diào)節(jié)MSC凋亡、增殖相關(guān)的miRNAs及其作用機制有助于為增加移植后的細(xì)胞存活率找到新的治療靶點[2]。本研究觀察急性肺損傷時miRNA-21通過磷酸酯酶一張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology，PTEN）調(diào)控PI13K/AKT信號通路途徑影響間充質(zhì)干細(xì)胞存活的研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 試驗動物

2020年3 月—2020年9月中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供的清潔級SD大鼠120只，體質(zhì)量為50 g，雄性，許可證號SCXK（渝）2012-0005。根據(jù)隨機對照法分組，分為空白對照組（n=40）、ALI組（n=40）、MSC處理組（n=40），三組的平均體質(zhì)量、性別等資料大體一致（P＞0.05），差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)室、蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)的超凈工作臺、美國Thermo提供的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、德國Eppendorf Centrifuge高速冷凍離心機、實時定量熒光PCR儀、賽默飛Applied Biosystems基因擴增儀、Invitrogen微型水平電泳儀、美國BIO-RAD伯樂高壓電泳儀、日本OLYMPUS生產(chǎn)的TMS-1015型光學(xué)倒置顯微鏡、德國OLYMPUS生產(chǎn)的倒置熒光顯微鏡，廣州迪奧生物科技有限公司Deaou-380C恒溫?zé)晒鈾z測儀、Bio-Rad蛋白電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、德國Forma Scientic -80℃低溫冰箱、電子天平、德國 Forma Scientic A200S型電子分析天平、Spectre Max 250 酶標(biāo)儀等設(shè)備。武漢博士德生物公司生產(chǎn)的兔抗大鼠PTEN多克隆抗體、兔抗大鼠P-AKT多克隆抗體、兔抗大鼠T-AKT多克隆抗體，廣州銳博生物科技公司生產(chǎn)的Mir-21模擬物及陰性對照。

1.3 方法

（1）H2O2/SD刺激間充質(zhì)干細(xì)胞，明確miR-21對MSC凋亡和增殖的調(diào)節(jié)及其機制：分離培養(yǎng)SD大鼠脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），流式細(xì)胞學(xué)檢驗細(xì)胞表面標(biāo)志，誘導(dǎo)分化能力檢測，1 h、2 h、6 h或24 h后，Annexin V-FTTC+PI FCM分析細(xì)胞凋亡；MTS法分析細(xì)胞增殖；臺盼藍(lán)染色法LDH測定細(xì)胞活力；RT-PCR法檢測PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表達(dá)；westem blot檢測PTEN、PI13j、Akt Bcl2蛋白表達(dá)；（2）高表達(dá)miR-21的MSC在ALI小鼠體內(nèi)凋亡和肺保護(hù)作用的研究：分離培養(yǎng)SD大鼠脊髓MSC，流式細(xì)胞學(xué)檢驗細(xì)胞表面標(biāo)志，誘導(dǎo)分化能力檢測，分為野生型MSC、miR-21MSC、沉默PTEN的miR-21-MSC、LY294002處理的miR-21-MSC；SD雄性大鼠，分為三組，空白對照組：氣道注入NS；ALI組氣道注入LPS；MSC處理組氣道注入LPS；MSC處理組30 min后尾靜脈注射MSC；ALI組30 min后尾靜脈注入NS；1 h、6 h、24 h或3 d后處死；熒光顯微鏡觀察MSC存留率、免疫熒光共定位、Tunel法分析MSC細(xì)胞凋亡情況；活體發(fā)光熒光成像系統(tǒng)分析MSC移植后凋亡情況；損傷肺組織評分分析肺組織病理學(xué)；肺濕/干重比Evans藍(lán)檢測肺血管屏障通透性分析肺水滲出情況。

1.4 評估標(biāo)準(zhǔn)

陽性信號評估標(biāo)準(zhǔn)[3]：棕黃色顆粒狀為陽性表達(dá)信號，Bcl-2、AKT mRNA、PI3K陽性信號位于細(xì)胞質(zhì)，AKT位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，PI3K mRNA陽性信號位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。Tunel法表達(dá)評估標(biāo)準(zhǔn)[4]：陽性信號：黃綠色熒光，藍(lán)色熒光為無凋亡小體的細(xì)胞核，凋亡指數(shù)：每張切片在高倍鏡下選擇不同視野5個，觀察每個視野的100個細(xì)胞，計算凋亡細(xì)胞所占的百分比，并計算平均值，平均值為凋亡細(xì)胞計數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)傳輸至SPSS 21.0軟件處理分析，計量資料為t檢驗，采用（±s）表示，計數(shù)資料為χ2檢驗，采用（n，%）表示，P＜0.05則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對照組、ALI組、MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)水平分析

ALI組、MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表達(dá)低于ALI組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1～3。

表1 空白對照組、ALI組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)分析 （±s）

表1 空白對照組、ALI組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)分析 （±s）

指標(biāo) 空白對照組（n=40） ALI組（n=40） t值 P值PI3K 蛋白 0.003±0.002 0.198±0.027 45.552 5 ＜ 0.001 PI3KmRNA 0.009±0.003 0.186±0.036 30.988 3 ＜ 0.001 PTEN 蛋白 0.006±0.003 0.267±0.038 43.305 0 ＜ 0.001 PTENmRNA 0.010±0.004 0.365±0.034 65.583 5 ＜ 0.001 AKt蛋白 0.011±0.003 0.532±0.094 35.036 3 ＜ 0.001 AKtmRNA 0.013±0.002 0.646±0.026 153.525 1 ＜ 0.001 Bcl2 蛋白 0.012±0.004 0.798±0.026 188.972 9 ＜ 0.001 Bcl2mRNA 0.015±0.001 0.638±0.087 45.286 6 ＜ 0.001

2.2 不同MSC細(xì)胞表面標(biāo)記誘導(dǎo)分化的MSC存留率、MSC移植后細(xì)胞存活率分析

LY294002處理的miR-21-MSC標(biāo)記細(xì)胞、沉默PTEN的miR-21-MSC標(biāo)記細(xì)胞的MSC存留率、MSC移植后細(xì)胞存活率高于miR-21-MSC、野生型MSC細(xì)胞，肺濕/干重比低于miR-21-MSC、野生型MSC細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同MSC細(xì)胞標(biāo)記誘導(dǎo)分化的MSC存留率、MSC移植后細(xì)胞存活率分析（±s）

表4 不同MSC細(xì)胞標(biāo)記誘導(dǎo)分化的MSC存留率、MSC移植后細(xì)胞存活率分析（±s）

注：*P＜0.05，與其他組相比；#P＜0.05，與miR-21-MSC細(xì)胞、野生型MSC細(xì)胞相比

細(xì)胞表面標(biāo)記 MSC存留率（%） MSC移植后細(xì)胞存活率（%） 肺濕/干重比LY294002 處理的 miR-21-MSC 79.09±10.69* 76.36±9.78* 4.34±0.16*沉默的 PTENmiR-21-MSC 64.60±7.85# 60.89±6.25# 4.52±0.21#MiR-21-MSC 細(xì)胞 30.01±3.23 28.64±0.98 6.35±0.36野生型 MSC 細(xì)胞 20.01±2.36 18.83±1.53 8.40±0.43

3 討論

本研究觀察急性肺損傷（ALI）時miRNA-21通過磷酸酯酶一張力蛋白同源物（PTEN）調(diào)控PI13K/AKT信號通路途徑影響間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）存活情況，結(jié)果顯示：ALI組、MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MSC處理組的PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因表達(dá)低于ALI組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LY294002處理的miR-21-MSC標(biāo)記細(xì)胞、沉默PTEN的miR-21-MSC標(biāo)記細(xì)胞的MSC存留率、MSC移植后細(xì)胞存活率高于miR-21-MSC、野生型MSC細(xì)胞，肺濕/干重比低于miR-21-MSC、野生型MSC細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與張莉珊等[5]的研究結(jié)果大體一致，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過旁分泌調(diào)節(jié)內(nèi)皮和上皮的通透性，調(diào)節(jié)免疫減輕炎癥反應(yīng)，以及抑制細(xì)菌的生長[6-7]；體外模擬急性肺損傷時MSC的生存環(huán)境，觀察MSC的凋亡和增殖，miRNA-21及其靶基因PTEN和PI3K/Akt信號通路相關(guān)因子的表達(dá)，明確miRNA-21對ALI時MSC凋亡和增殖調(diào)節(jié)作用及其具體分子機制[8]；通過移植入高表達(dá)miR-21的MSC，在體實驗證實ALI時miR-21能通過靶基因PTEN和PI3K/Akt信號通路促進(jìn)MSC增殖、抑制凋亡，提高M(jìn)SC移植后存活效率，并能增強在體MSC修復(fù)肺損傷和保護(hù)肺功能的作用[9-10]。

本研究的創(chuàng)新點在于關(guān)注miR-21對ALI時MSC凋亡和增殖的作用及調(diào)節(jié)機制。首次提出miR-21通過其靶基因PTEN及PI3K/Akt信號途徑調(diào)控ALI時MSC的凋亡和增殖，增加ALI時MSC移植后存活率的假設(shè)[11-12]；通過轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)，測定其靶基因PTEN及PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵分子的變化，并觀察MSC的凋亡和增殖，闡明miR-21調(diào)控MSC存活的具體機制，為提高M(jìn)SC治療ALI的療效提供了理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠MSC中PTEN可能是miR-21潛在的作用靶基因；氧化應(yīng)激條件下，MSC的miR-21的表達(dá)與PTEN的蛋白表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)；MSC可減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的病理改變和肺水的滲出。

表2 空白對照組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)分析 （±s）

表2 空白對照組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)分析 （±s）

指標(biāo) 空白對照組（n=40） MSC處理組（n=40） t值 P值PI3K 蛋白 0.003±0.002 0.096±0.014 41.590 9 ＜ 0.001 PI3KmRNA 0.009±0.003 0.094±0.018 29.459 6 ＜ 0.001 PTEN 蛋白 0.006±0.003 0.135±0.018 44.709 3 ＜ 0.001 PTENmRNA 0.010±0.004 0.184±0.016 66.726 0 ＜ 0.001 AKt蛋白 0.011±0.003 0.226±0.017 78.769 9 ＜ 0.001 AKtmRNA 0.013±0.002 0.352±0.014 151.605 4 ＜ 0.001 Bcl2 蛋白 0.012±0.004 0.352±0.013 158.096 8 ＜ 0.001 Bcl2mRNA 0.015±0.001 0.319±0.015 127.893 8 ＜ 0.001

表3 ALI組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)分析 （±s）

表3 ALI組、MSC處理組PTEN、PI3K、Akt、Bcl2基因和蛋白表達(dá)分析 （±s）

指標(biāo) ALI組（n=40） MSC處理組（n=40） t值 P值PI3K 蛋白 0.198±0.027 0.096±0.014 21.210 9 ＜ 0.001 PI3KmRNA 0.186±0.036 0.094±0.018 14.456 4 ＜ 0.001 PTEN 蛋白 0.267±0.038 0.135±0.018 19.854 7 ＜ 0.001 PTENmRNA 0.365±0.034 0.184±0.016 30.464 3 ＜ 0.001 AKt蛋白 0.532±0.094 0.226±0.017 20.2598 ＜ 0.001 AKtmRNA 0.646±0.026 0.352±0.014 62.967 9 ＜ 0.001 Bcl2 蛋白 0.798±0.026 0.352±0.013 97.036 8 ＜ 0.001 Bcl2mRNA 0.638±0.087 0.319±0.015 22.852 9 ＜ 0.001

綜上所述，探討ALI時調(diào)節(jié)MSC凋亡、增殖相關(guān)的miRNAs及其作用機制有助于為增加移植后的細(xì)胞存活率找到新的治療靶點。