基于靶向代謝組學(xué)檢測探討瀑布森林環(huán)境療養(yǎng) 對亞健康患者脂肪酸水平的變化情況

朱紫馨 歐陽秋月 趙雪珂 程明亮 羅新華 (1.貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室；.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科；3.貴州省人民醫(yī)院感染科)

亞健康是指人體處于健康和疾病之間的一種狀態(tài)[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對此病的治療主要采用營養(yǎng)支持、心理治療等，但大多為對癥治療，確能緩解其中一部分的臨床癥狀，但長期療效并不理想，且消耗著大量的醫(yī)療資源[2-5]。隨著對環(huán)境和健康問題認(rèn)識水平的深化 ,醫(yī)學(xué)地理學(xué)得到蓬勃發(fā)展。越來越多的研究證實(shí)自然環(huán)境可促進(jìn)人體健康，形成了自然康養(yǎng)的雛形。研究表明大型瀑布周邊的高負(fù)氧離子環(huán)境對皮膚過敏或哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病患者有輔助治療的功效[6-7]。目前對于天然瀑布森林環(huán)境對亞健康人群的改善作用，尤其在脂肪酸方面，國內(nèi)研究甚少。本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)代謝組學(xué)這一手段，研究亞健康受試者處于天然瀑布森林環(huán)境對機(jī)體脂肪酸代謝物的變化水平。以期對瀑布森林環(huán)境對于人體健康的機(jī)制進(jìn)行更深入的揭示。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間 本研究在中國貴州省安順市黃果樹瀑布核心景區(qū)進(jìn)行。黃果樹大瀑布坐落于東經(jīng)105°40′,北緯25°59.5′。平均海拔約950 m，常年平均溫度15.6℃，溫度最高的7月份平均溫度23.2℃，溫度最低的1月份平均溫度5.9℃。年平均降水量為1 307 mm。全年相對濕度為80%左右，日照率30%。大瀑布附近負(fù)氧離子含量達(dá)每立方米2 000個(gè)以上，比一般地區(qū)高出10倍左右。瀑布周圍植被茂密，苔蘚地衣豐富，為理想的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)。根據(jù)氣候及環(huán)境特點(diǎn)6月到9月的這段時(shí)間顯示出最高水平的空氣中負(fù)氧離子含量。為了使人群在自然環(huán)境干預(yù)效果最大化，本次實(shí)驗(yàn)選擇在8月份進(jìn)行。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，通過網(wǎng)絡(luò)及海報(bào)廣告招募方式篩選出符合本次實(shí)驗(yàn)研究標(biāo)準(zhǔn)的32名20至55歲的亞健康人群。后經(jīng)課題組嚴(yán)格篩選出12名符合調(diào)查選擇標(biāo)準(zhǔn)并自愿同意參與研究的受試者納入研究。亞健康疲勞屬于生理性疲勞和病理性疲勞之間的中間狀態(tài)，因此確定亞健康疲勞，一方面要排除生理性疲勞(休息后容易恢復(fù)的特點(diǎn)，即短期的疲勞)，另一方面還要排除器質(zhì)性疾病、精神性疾病(如抑郁癥)等有關(guān)疾病。在專業(yè)心理科醫(yī)生的輔助幫助下對受試者的感知力及心理變化描能力進(jìn)行入組前評估。納入標(biāo)準(zhǔn)：①20～50歲 每日城市環(huán)境中等及以上強(qiáng)度勞動(dòng)工作者，居住地為城市地區(qū)男女不限;②BMI指數(shù)：19～25之間;③近期(6個(gè)月及以上)出現(xiàn)精神倦怠、抑郁、失眠健忘、睡眠質(zhì)量下降、注意力降低等情況;④伴或不伴有伴頸部、腋窩淋巴結(jié)輕度腫痛，但體檢和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①準(zhǔn)備妊娠或孕期、哺乳期婦女;②排除精神疾病、甲狀腺功能減退癥、糖尿病等相關(guān)心血管、消化、內(nèi)分泌、神經(jīng)等方面疾病，需長期服藥及定期復(fù)診的患者。;③近期(6個(gè)月內(nèi))進(jìn)行過麻醉手術(shù)的患者。中途退出標(biāo)準(zhǔn):①受試者不能適應(yīng)環(huán)境變化，出現(xiàn)睡眠質(zhì)量顯著下降、食欲欠佳，且迫切想通過退出實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改善。②受試者在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)嚴(yán)重急性病變(呼吸系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)炎癥)需用藥治療，或需住院治療的外傷等病變。主要試劑和儀器為：正己烷(國藥 優(yōu)級純) ；正十九酸甲酯(TCI>99.0%)；甲醇(國藥 HPLC) ；Agilent 7890/5975C 氣-質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫,美國) ；Electronic Balance (WT3003N) ；渦旋儀(QL-866) ；冷凍離心機(jī)(湘儀,H1650-W) ；電熱恒溫水浴鍋(長安科學(xué)儀器) ；色譜柱Agilent DB-WAX 毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm ID×0.25um 。

1.2方法 本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間選擇為8月19日-25日，總計(jì)7 d，景區(qū)為夏季豐水期，水流量50 m2/s，平均氣溫23℃。前往貴州省安順市黃果樹風(fēng)景區(qū)進(jìn)行瀑布森林環(huán)境綜合干預(yù)。并將實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮统绦虺浞指嬷惺茉囌?。受試者的控制變量如?(1)參與實(shí)驗(yàn)前24 h及整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中限制飲酒及吸煙;(2)每次實(shí)驗(yàn)抽血前8 h內(nèi)限制食物攝入;(3)未實(shí)施過包含其他自然環(huán)境的治療方案;(4)限制在試驗(yàn)區(qū)域以外的過度活動(dòng);(6)限制過度使用電子移動(dòng)設(shè)備(大于8h/日)或熬夜等不良生活作息;(7)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)參與期間提供規(guī)律飲食在此基礎(chǔ)上所有受試者前往黃果樹瀑布景區(qū)進(jìn)行自然環(huán)境干預(yù)。期間入住黃果樹核心景區(qū)附近(500 m)酒店住宿,海拔為1 024 m，為了盡量避免飲食變化對于脂肪酸的改變情況。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間一日三餐統(tǒng)一酒店托管安排，確保每日統(tǒng)一菜品制作用油，并由營養(yǎng)醫(yī)師提供每日均衡食譜?；顒?dòng)強(qiáng)度為中等活動(dòng)強(qiáng)度，并確保受試者每日在瀑布?xì)馊苣z環(huán)境內(nèi)活動(dòng)時(shí)間為8 h。實(shí)驗(yàn)開始前1 日(A組)和實(shí)驗(yàn)第3日(B組)，第7日(C組)抽取所有受試者肘靜脈血10.0 mL，以3 000×g離心15 min，取上清，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品配制 采用40種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制成0.5 mg/L,1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L,250 mg/L,500 mg/L,1 000 mg/L10個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度,其中濃度為各組分的總濃度。40個(gè)脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)品中,各組分濃度占總濃度的比例有2%,4%兩個(gè)梯度,其中,30種組分占2%,10種組分占4%。取500 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品,加入25 μL濃度為500 ppm的正十九酸甲酯作為內(nèi)標(biāo),混勻加入進(jìn)樣瓶,進(jìn)入GC-MS 檢測,進(jìn)樣量 1 μ L,分流比 10:1,分流進(jìn)樣。

1.2.2代謝物提取 將樣品冰上解凍,取200ul樣品于2 mL玻璃離心管中。加入1 mL的氯仿甲醇溶液,超聲30 min,取上清液,加入1%的硫酸-甲醇溶液2 mL,放在80℃水浴上,甲酯化半小時(shí),再加1 mL的正己烷萃取,加5 mL的純水洗滌,吸取上清液500 μL,加入25 μL加入25 μL的水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo),混勻加入進(jìn)樣瓶,進(jìn)入GC-MS 檢測,進(jìn)樣量1 μ L,分流比10:1,分流進(jìn)樣。

1.2.3色譜-質(zhì)譜分析 (1)氣相色譜條件：樣品采用Agilent DB-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm)氣相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。程序升溫:初始溫度50℃;保持3 min,以10℃/min升溫至220℃;并維持5 min。載氣為氦氣,載氣流速 1.0 mL/min。(2)質(zhì)譜分析:采用Agilent 7890/5975C 氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)樣口溫度 280℃;離子源溫度230℃;傳輸線溫度 250℃。電子轟擊電離(EI)源,SIM 掃描方式,電子能量 70eV。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 采用MSD ChemStation軟件提取色譜峰面積及保留時(shí)間。繪制標(biāo)曲曲線,計(jì)算樣品中中長鏈脂肪酸的含量。

1.2.5質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzXML格式,然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級譜圖匹配的方式,檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié) 果

2.1受試者人口學(xué)特征和血生化結(jié)果 統(tǒng)計(jì)亞健康人群年齡、身高、體重等情況。見表1。

表1 受試人員人口學(xué)特征表

2.2不同干預(yù)時(shí)間受試者AST、ALT及TG、TBA的影響 機(jī)體中脂肪酸的調(diào)節(jié)常常受肝臟狀態(tài)的影響?？偰懼?total bile acid，TBA)是膽固醇在肝臟分解及腸-肝循環(huán)中的一組代謝產(chǎn)物，是膽固醇在肝臟分解代謝的最終產(chǎn)物，與膽固醇的吸收、代謝及調(diào)節(jié)關(guān)系密切。肝臟則為合成甘油三酯(TG)的場所。ALT、AST是目前臨床診斷肝損傷的常用血清生化指標(biāo), 本實(shí)驗(yàn)通過生化指標(biāo)評價(jià)瀑布森林環(huán)境不同干預(yù)時(shí)間對于血液中脂肪酸含量的影響。從減壓結(jié)果可知，瀑布森林環(huán)境隨著時(shí)間的延長AST、ALT及TG、TBA數(shù)值均呈現(xiàn)下降趨勢，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3主成分分析(PCA) 以脂肪酸量為 X 變量，共A、B、C組共 24個(gè)樣本，采用XCMS軟件對代謝物離子峰進(jìn)行提取。將所有實(shí)驗(yàn)樣本和QC樣本提取得到的峰,經(jīng)Pareto-scaling得到的PCA模型,如下圖代表所示正模式下，瀑布森林環(huán)境干預(yù)前(A組)較干預(yù)后B、C組分開，PCA 分析結(jié)果表明瀑布森林環(huán)境前后血清脂肪酸代謝輪廓差異明顯。

2.4差異代謝物結(jié)果 抽取受試者環(huán)境干預(yù)前(A組)，環(huán)境干預(yù)第3 d(B組)，環(huán)境干預(yù)第7 d(C組)的血液進(jìn)行GC-MS中長鏈脂肪酸代謝分析。不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)，差異物有所不同。瀑布森林環(huán)境干預(yù)3 d后，油酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等含量下降(P<0.05)。7 d后出現(xiàn)癸酸、十一烷酸等脂肪酸含量下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 A組與B組比較差異代謝物

表3 A組與C組比較差異代謝物

2.5KEGG代謝通路分析 將三組不同時(shí)間點(diǎn)的瀑布森林環(huán)境比較分析得到的全部差異代謝物提交到 KEGG 網(wǎng)站，進(jìn)行相關(guān)通路分析。結(jié)果顯示，所有差異性代謝物共參與81條代謝通路，其中3種及以上差異性代謝物同時(shí)參與的代謝通路共 13條。下圖為相關(guān)性最大的信號通路氣泡圖。提示天然高負(fù)氧離子瀑布森林環(huán)境可能參與了膽堿、氨基酸代謝，HIF-1信號通路等信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 討 論

現(xiàn)代城市化進(jìn)程加快，人類亞健康及心理疾病患病率逐步上升。運(yùn)用瀑布森林環(huán)境作為一種寶貴的自然資源，這一非臨床的環(huán)境理療方式也逐步得到重視。 Carina Grafetst?tter 等研究表明瀑布小氣候的暴露療法對兒童哮喘具有良好的輔助治療效果[8-10]。大型瀑布及其附近輻射環(huán)境因落差較大，水分子裂解充分的原因，負(fù)氧離子含量常持續(xù)在較高濃度。單純森林環(huán)境則受到晝夜節(jié)律及溫度的影響較大。瀑布森林綜合環(huán)境中，靠近水源地帶，環(huán)境優(yōu)越，植物多樣性 更加豐富，使得芳香類物質(zhì)等植物殺菌素在水霧環(huán)境中播散更廣泛，粘附皮膚及粘膜時(shí)間持續(xù)，更加有利于健康屏障的建立。

本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用GC-MS質(zhì)譜分析瀑布森林環(huán)境對于亞健康受試者脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。血生化結(jié)果表明瀑布森林環(huán)境可下調(diào)轉(zhuǎn)氨酶水平，雖未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但筆者推測其對于肝臟微炎癥環(huán)境有改善作用。而油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸等在瀑布森林環(huán)境干預(yù)后出現(xiàn)下降趨勢。彭克楠等研究表明，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肉豆蔻酸、棕櫚酸等水平較健康受試者升高[11]。因此本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)過瀑布森林環(huán)境康養(yǎng)干預(yù)受試者有降低患脂肪肝的可能，可能為一個(gè)潛在的輔助治療手段。其機(jī)制主要在于對飽和脂肪酸的調(diào)控。筆者猜測亞健康人群因環(huán)境作息等綜合因素導(dǎo)致機(jī)體處于微炎癥、免疫力降低的狀態(tài)。瀑布森林環(huán)境干預(yù)后，機(jī)體抗氧化活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)上脂肪酸脂質(zhì)氧化作用增強(qiáng)，提示三羧酸循環(huán)受到觸發(fā)，故血液中脂肪酸水平降低。值得注意的是，瀑布森林環(huán)境干預(yù)第7 d后，油酸等水平出現(xiàn)小范圍升高，筆者猜測這與肝臟肝糖原儲(chǔ)備完成，機(jī)體氧化水平穩(wěn)定，肝細(xì)胞損傷修復(fù)，肝臟糖原儲(chǔ)備已修復(fù)相關(guān)。這可能與KEGG聚類分析中m TOR通路調(diào)控發(fā)揮作用相關(guān)。PI3K/Akt/m TOR是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在細(xì)胞的生長、增殖、分化及蛋白合成的過程中發(fā)揮著重要作用。m TOR上游的磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)屬于細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶的一種，同時(shí)具備絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性，PI3K激活后，可以把細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇家族成員磷酸化，募集和激活下游信號分子蛋白激酶 B(Akt)，Akt被PI3K激活后可以通過磷酸化一系列底物，如mTOR，NF-kB等來影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡、代謝、血管生成等。同時(shí)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬水平，與KEGG富集中的膽堿代謝、帕金森通路等進(jìn)一步產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。有研究表明，空氣中污染顆粒增加會(huì)使得肝糖原儲(chǔ)存受損、葡萄糖不耐受和胰島素抵抗。因此天然瀑布森林環(huán)境有可能增強(qiáng)肝臟對肝糖原儲(chǔ)備受損的修復(fù)能力。但具體干預(yù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，和具體調(diào)控的基因靶點(diǎn)和蛋白表達(dá)影響仍需要進(jìn)一步探究。本研究從脂肪酸代謝的層面上初步探索了瀑布森林環(huán)境對亞健康人群脂肪酸水平的影響,為深入研究環(huán)境對肝臟代謝的影響奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝貴州省氣象局生態(tài)氣象與衛(wèi)星遙感中心和貴州省安順市黃果樹旅游區(qū)教育事務(wù)管理中心。