基于靶向代謝組學(xué)檢測探討瀑布森林環(huán)境療養(yǎng) 對(duì)亞健康患者脂肪酸水平的變化情況

朱紫馨 歐陽秋月 趙雪珂 程明亮 羅新華 (1.貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室；.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科；3.貴州省人民醫(yī)院感染科)

亞健康是指人體處于健康和疾病之間的一種狀態(tài)[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)此病的治療主要采用營養(yǎng)支持、心理治療等，但大多為對(duì)癥治療，確能緩解其中一部分的臨床癥狀，但長期療效并不理想，且消耗著大量的醫(yī)療資源[2-5]。隨著對(duì)環(huán)境和健康問題認(rèn)識(shí)水平的深化 ,醫(yī)學(xué)地理學(xué)得到蓬勃發(fā)展。越來越多的研究證實(shí)自然環(huán)境可促進(jìn)人體健康，形成了自然康養(yǎng)的雛形。研究表明大型瀑布周邊的高負(fù)氧離子環(huán)境對(duì)皮膚過敏或哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病患者有輔助治療的功效[6-7]。目前對(duì)于天然瀑布森林環(huán)境對(duì)亞健康人群的改善作用，尤其在脂肪酸方面，國內(nèi)研究甚少。本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)代謝組學(xué)這一手段，研究亞健康受試者處于天然瀑布森林環(huán)境對(duì)機(jī)體脂肪酸代謝物的變化水平。以期對(duì)瀑布森林環(huán)境對(duì)于人體健康的機(jī)制進(jìn)行更深入的揭示。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間 本研究在中國貴州省安順市黃果樹瀑布核心景區(qū)進(jìn)行。黃果樹大瀑布坐落于東經(jīng)105°40′,北緯25°59.5′。平均海拔約950 m，常年平均溫度15.6℃，溫度最高的7月份平均溫度23.2℃，溫度最低的1月份平均溫度5.9℃。年平均降水量為1 307 mm。全年相對(duì)濕度為80%左右，日照率30%。大瀑布附近負(fù)氧離子含量達(dá)每立方米2 000個(gè)以上，比一般地區(qū)高出10倍左右。瀑布周圍植被茂密，苔蘚地衣豐富，為理想的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)。根據(jù)氣候及環(huán)境特點(diǎn)6月到9月的這段時(shí)間顯示出最高水平的空氣中負(fù)氧離子含量。為了使人群在自然環(huán)境干預(yù)效果最大化，本次實(shí)驗(yàn)選擇在8月份進(jìn)行。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，通過網(wǎng)絡(luò)及海報(bào)廣告招募方式篩選出符合本次實(shí)驗(yàn)研究標(biāo)準(zhǔn)的32名20至55歲的亞健康人群。后經(jīng)課題組嚴(yán)格篩選出12名符合調(diào)查選擇標(biāo)準(zhǔn)并自愿同意參與研究的受試者納入研究。亞健康疲勞屬于生理性疲勞和病理性疲勞之間的中間狀態(tài)，因此確定亞健康疲勞，一方面要排除生理性疲勞(休息后容易恢復(fù)的特點(diǎn)，即短期的疲勞)，另一方面還要排除器質(zhì)性疾病、精神性疾病(如抑郁癥)等有關(guān)疾病。在專業(yè)心理科醫(yī)生的輔助幫助下對(duì)受試者的感知力及心理變化描能力進(jìn)行入組前評(píng)估。納入標(biāo)準(zhǔn)：①20～50歲 每日城市環(huán)境中等及以上強(qiáng)度勞動(dòng)工作者，居住地為城市地區(qū)男女不限;②BMI指數(shù)：19～25之間;③近期(6個(gè)月及以上)出現(xiàn)精神倦怠、抑郁、失眠健忘、睡眠質(zhì)量下降、注意力降低等情況;④伴或不伴有伴頸部、腋窩淋巴結(jié)輕度腫痛，但體檢和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①準(zhǔn)備妊娠或孕期、哺乳期婦女;②排除精神疾病、甲狀腺功能減退癥、糖尿病等相關(guān)心血管、消化、內(nèi)分泌、神經(jīng)等方面疾病，需長期服藥及定期復(fù)診的患者。;③近期(6個(gè)月內(nèi))進(jìn)行過麻醉手術(shù)的患者。中途退出標(biāo)準(zhǔn):①受試者不能適應(yīng)環(huán)境變化，出現(xiàn)睡眠質(zhì)量顯著下降、食欲欠佳，且迫切想通過退出實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改善。②受試者在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)嚴(yán)重急性病變(呼吸系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)炎癥)需用藥治療，或需住院治療的外傷等病變。主要試劑和儀器為：正己烷(國藥 優(yōu)級(jí)純) ；正十九酸甲酯(TCI>99.0%)；甲醇(國藥 HPLC) ；Agilent 7890/5975C 氣-質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫,美國) ；Electronic Balance (WT3003N) ；渦旋儀(QL-866) ；冷凍離心機(jī)(湘儀,H1650-W) ；電熱恒溫水浴鍋(長安科學(xué)儀器) ；色譜柱Agilent DB-WAX 毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm ID×0.25um 。

1.2方法 本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間選擇為8月19日-25日，總計(jì)7 d，景區(qū)為夏季豐水期，水流量50 m2/s，平均氣溫23℃。前往貴州省安順市黃果樹風(fēng)景區(qū)進(jìn)行瀑布森林環(huán)境綜合干預(yù)。并將實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮统绦虺浞指嬷惺茉囌?。受試者的控制變量如?(1)參與實(shí)驗(yàn)前24 h及整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中限制飲酒及吸煙;(2)每次實(shí)驗(yàn)抽血前8 h內(nèi)限制食物攝入;(3)未實(shí)施過包含其他自然環(huán)境的治療方案;(4)限制在試驗(yàn)區(qū)域以外的過度活動(dòng);(6)限制過度使用電子移動(dòng)設(shè)備(大于8h/日)或熬夜等不良生活作息;(7)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)參與期間提供規(guī)律飲食在此基礎(chǔ)上所有受試者前往黃果樹瀑布景區(qū)進(jìn)行自然環(huán)境干預(yù)。期間入住黃果樹核心景區(qū)附近(500 m)酒店住宿,海拔為1 024 m，為了盡量避免飲食變化對(duì)于脂肪酸的改變情況。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間一日三餐統(tǒng)一酒店托管安排，確保每日統(tǒng)一菜品制作用油，并由營養(yǎng)醫(yī)師提供每日均衡食譜?；顒?dòng)強(qiáng)度為中等活動(dòng)強(qiáng)度，并確保受試者每日在瀑布?xì)馊苣z環(huán)境內(nèi)活動(dòng)時(shí)間為8 h。實(shí)驗(yàn)開始前1 日(A組)和實(shí)驗(yàn)第3日(B組)，第7日(C組)抽取所有受試者肘靜脈血10.0 mL，以3 000×g離心15 min，取上清，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品配制 采用40種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制成0.5 mg/L,1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L,250 mg/L,500 mg/L,1 000 mg/L10個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度,其中濃度為各組分的總濃度。40個(gè)脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)品中,各組分濃度占總濃度的比例有2%,4%兩個(gè)梯度,其中,30種組分占2%,10種組分占4%。取500 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品,加入25 μL濃度為500 ppm的正十九酸甲酯作為內(nèi)標(biāo),混勻加入進(jìn)樣瓶,進(jìn)入GC-MS 檢測,進(jìn)樣量 1 μ L,分流比 10:1,分流進(jìn)樣。

1.2.2代謝物提取 將樣品冰上解凍,取200ul樣品于2 mL玻璃離心管中。加入1 mL的氯仿甲醇溶液,超聲30 min,取上清液,加入1%的硫酸-甲醇溶液2 mL,放在80℃水浴上,甲酯化半小時(shí),再加1 mL的正己烷萃取,加5 mL的純水洗滌,吸取上清液500 μL,加入25 μL加入25 μL的水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo),混勻加入進(jìn)樣瓶,進(jìn)入GC-MS 檢測,進(jìn)樣量1 μ L,分流比10:1,分流進(jìn)樣。

1.2.3色譜-質(zhì)譜分析 (1)氣相色譜條件：樣品采用Agilent DB-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm)氣相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。程序升溫:初始溫度50℃;保持3 min,以10℃/min升溫至220℃;并維持5 min。載氣為氦氣,載氣流速 1.0 mL/min。(2)質(zhì)譜分析:采用Agilent 7890/5975C 氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)樣口溫度 280℃;離子源溫度230℃;傳輸線溫度 250℃。電子轟擊電離(EI)源,SIM 掃描方式,電子能量 70eV。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 采用MSD ChemStation軟件提取色譜峰面積及保留時(shí)間。繪制標(biāo)曲曲線,計(jì)算樣品中中長鏈脂肪酸的含量。

1.2.5質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzXML格式,然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級(jí)譜圖匹配的方式,檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié) 果

2.1受試者人口學(xué)特征和血生化結(jié)果 統(tǒng)計(jì)亞健康人群年齡、身高、體重等情況。見表1。

表1 受試人員人口學(xué)特征表

2.2不同干預(yù)時(shí)間受試者AST、ALT及TG、TBA的影響 機(jī)體中脂肪酸的調(diào)節(jié)常常受肝臟狀態(tài)的影響?？偰懼?total bile acid，TBA)是膽固醇在肝臟分解及腸-肝循環(huán)中的一組代謝產(chǎn)物，是膽固醇在肝臟分解代謝的最終產(chǎn)物，與膽固醇的吸收、代謝及調(diào)節(jié)關(guān)系密切。肝臟則為合成甘油三酯(TG)的場所。ALT、AST是目前臨床診斷肝損傷的常用血清生化指標(biāo), 本實(shí)驗(yàn)通過生化指標(biāo)評(píng)價(jià)瀑布森林環(huán)境不同干預(yù)時(shí)間對(duì)于血液中脂肪酸含量的影響。從減壓結(jié)果可知，瀑布森林環(huán)境隨著時(shí)間的延長AST、ALT及TG、TBA數(shù)值均呈現(xiàn)下降趨勢，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3主成分分析(PCA) 以脂肪酸量為 X 變量，共A、B、C組共 24個(gè)樣本，采用XCMS軟件對(duì)代謝物離子峰進(jìn)行提取。將所有實(shí)驗(yàn)樣本和QC樣本提取得到的峰,經(jīng)Pareto-scaling得到的PCA模型,如下圖代表所示正模式下，瀑布森林環(huán)境干預(yù)前(A組)較干預(yù)后B、C組分開，PCA 分析結(jié)果表明瀑布森林環(huán)境前后血清脂肪酸代謝輪廓差異明顯。

2.4差異代謝物結(jié)果 抽取受試者環(huán)境干預(yù)前(A組)，環(huán)境干預(yù)第3 d(B組)，環(huán)境干預(yù)第7 d(C組)的血液進(jìn)行GC-MS中長鏈脂肪酸代謝分析。不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)，差異物有所不同。瀑布森林環(huán)境干預(yù)3 d后，油酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等含量下降(P<0.05)。7 d后出現(xiàn)癸酸、十一烷酸等脂肪酸含量下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 A組與B組比較差異代謝物

表3 A組與C組比較差異代謝物

2.5KEGG代謝通路分析 將三組不同時(shí)間點(diǎn)的瀑布森林環(huán)境比較分析得到的全部差異代謝物提交到 KEGG 網(wǎng)站，進(jìn)行相關(guān)通路分析。結(jié)果顯示，所有差異性代謝物共參與81條代謝通路，其中3種及以上差異性代謝物同時(shí)參與的代謝通路共 13條。下圖為相關(guān)性最大的信號(hào)通路氣泡圖。提示天然高負(fù)氧離子瀑布森林環(huán)境可能參與了膽堿、氨基酸代謝，HIF-1信號(hào)通路等信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 討 論

現(xiàn)代城市化進(jìn)程加快，人類亞健康及心理疾病患病率逐步上升。運(yùn)用瀑布森林環(huán)境作為一種寶貴的自然資源，這一非臨床的環(huán)境理療方式也逐步得到重視。 Carina Grafetst?tter 等研究表明瀑布小氣候的暴露療法對(duì)兒童哮喘具有良好的輔助治療效果[8-10]。大型瀑布及其附近輻射環(huán)境因落差較大，水分子裂解充分的原因，負(fù)氧離子含量常持續(xù)在較高濃度。單純森林環(huán)境則受到晝夜節(jié)律及溫度的影響較大。瀑布森林綜合環(huán)境中，靠近水源地帶，環(huán)境優(yōu)越，植物多樣性 更加豐富，使得芳香類物質(zhì)等植物殺菌素在水霧環(huán)境中播散更廣泛，粘附皮膚及粘膜時(shí)間持續(xù)，更加有利于健康屏障的建立。

本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用GC-MS質(zhì)譜分析瀑布森林環(huán)境對(duì)于亞健康受試者脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。血生化結(jié)果表明瀑布森林環(huán)境可下調(diào)轉(zhuǎn)氨酶水平，雖未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但筆者推測其對(duì)于肝臟微炎癥環(huán)境有改善作用。而油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸等在瀑布森林環(huán)境干預(yù)后出現(xiàn)下降趨勢。彭克楠等研究表明，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肉豆蔻酸、棕櫚酸等水平較健康受試者升高[11]。因此本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)過瀑布森林環(huán)境康養(yǎng)干預(yù)受試者有降低患脂肪肝的可能，可能為一個(gè)潛在的輔助治療手段。其機(jī)制主要在于對(duì)飽和脂肪酸的調(diào)控。筆者猜測亞健康人群因環(huán)境作息等綜合因素導(dǎo)致機(jī)體處于微炎癥、免疫力降低的狀態(tài)。瀑布森林環(huán)境干預(yù)后，機(jī)體抗氧化活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)上脂肪酸脂質(zhì)氧化作用增強(qiáng)，提示三羧酸循環(huán)受到觸發(fā)，故血液中脂肪酸水平降低。值得注意的是，瀑布森林環(huán)境干預(yù)第7 d后，油酸等水平出現(xiàn)小范圍升高，筆者猜測這與肝臟肝糖原儲(chǔ)備完成，機(jī)體氧化水平穩(wěn)定，肝細(xì)胞損傷修復(fù)，肝臟糖原儲(chǔ)備已修復(fù)相關(guān)。這可能與KEGG聚類分析中m TOR通路調(diào)控發(fā)揮作用相關(guān)。PI3K/Akt/m TOR是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在細(xì)胞的生長、增殖、分化及蛋白合成的過程中發(fā)揮著重要作用。m TOR上游的磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)屬于細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶的一種，同時(shí)具備絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性，PI3K激活后，可以把細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇家族成員磷酸化，募集和激活下游信號(hào)分子蛋白激酶 B(Akt)，Akt被PI3K激活后可以通過磷酸化一系列底物，如mTOR，NF-kB等來影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡、代謝、血管生成等。同時(shí)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬水平，與KEGG富集中的膽堿代謝、帕金森通路等進(jìn)一步產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。有研究表明，空氣中污染顆粒增加會(huì)使得肝糖原儲(chǔ)存受損、葡萄糖不耐受和胰島素抵抗。因此天然瀑布森林環(huán)境有可能增強(qiáng)肝臟對(duì)肝糖原儲(chǔ)備受損的修復(fù)能力。但具體干預(yù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，和具體調(diào)控的基因靶點(diǎn)和蛋白表達(dá)影響仍需要進(jìn)一步探究。本研究從脂肪酸代謝的層面上初步探索了瀑布森林環(huán)境對(duì)亞健康人群脂肪酸水平的影響,為深入研究環(huán)境對(duì)肝臟代謝的影響奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝貴州省氣象局生態(tài)氣象與衛(wèi)星遙感中心和貴州省安順市黃果樹旅游區(qū)教育事務(wù)管理中心。