四種冷凍保護(hù)劑深低溫保存人小口徑動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)研究

蔡超操 陳世玖 王成 劉瓏玲 曾御

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海) 醫(yī)院燒傷整形手外科，廣東 珠海 519000)

近年來，在外科手術(shù)中,使用血管移植材料移植重建血管變得越來越常見[1-3]。目前對精子、卵細(xì)胞、胚胎等組織細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)研究較為成熟，但對血管組織的深低溫保存多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，且實(shí)驗(yàn)對象主要為大動(dòng)脈或靜脈，比較不同冷凍保護(hù)劑深低溫冷凍保存人小口徑動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道罕見。本研究以病人放棄的小口徑動(dòng)脈為研究對象，評估甘油，二甲基亞砜、丙二醇、乙二醇四種冷凍保護(hù)劑的凍存效果，為血管的深低溫保存提供依據(jù)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)實(shí)驗(yàn)材料：本實(shí)驗(yàn)材料為2016年9月至2018年9月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第五(珠海)醫(yī)院因外傷而行截肢術(shù)后遺棄的肢體，嚴(yán)格無菌操作，顯微鏡下剝離修剪小口徑動(dòng)脈，每一片段0.5cm，收集45個(gè)片段。(2)主要實(shí)驗(yàn)試劑：甘油:廣東恒??；丙二醇:山東酷爾；乙二醇:山東酷爾；二甲基亞砜:Amresco；RPMI-1640培養(yǎng)液:HyClone；胎牛血清:浙江天杭；蘇木素:博士德生物；HE染色試劑盒:博士德生物；即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)試劑盒:博士德生物；小鼠單克隆抗體[VG-1] to VEGFA (ab1316):Abcam。(3)主要儀器設(shè)備：液氮罐:河南天馳；高壓蒸汽滅菌器:廣州科鵬；生物組織包埋機(jī):泰維科技；石蠟切片機(jī)(TB-718):湖北泰維；自動(dòng)組織脫水機(jī):leica biosystems；光學(xué)顯微鏡:重慶奧特。一般外科手術(shù)器械、顯微外科器械、手外科手術(shù)顯微鏡：由遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院手術(shù)室提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1取材來源及血管制備 血管來源于無傳染病、血管疾病及惡性腫瘤患者因創(chuàng)傷而放棄的肢體，在無菌技術(shù)操作下切取小口徑動(dòng)脈，將血管片段立即浸泡于4℃0.2%肝素生理鹽水中,并反復(fù)沖洗管腔,顯微鏡下見血管組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，剝凈血管周圍結(jié)締組織,剪成長約0.5cm的血管片段，共收集45個(gè)片段。取材過程在6 h內(nèi)完成，且盡量避免損傷血管內(nèi)膜。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將45個(gè)血管片段分為9個(gè)組(8個(gè)實(shí)驗(yàn)組：30%丙二醇組、30%二甲基亞砜組、30%乙二醇組、30%甘油組、40%丙二醇組、40%二甲基亞砜組、40%乙二醇組、40%甘油組；1個(gè)對照組)，每組5個(gè)血管片段。

1.2.3血管保護(hù)液配制 以胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液為基液，分別配制體積比為1:6:3、1:5:4的丙二醇、二甲基亞砜、乙二醇、甘油保護(hù)液。

1.2.4實(shí)驗(yàn)步驟 1.肝素鹽水沖洗9組血管片段，分別先放入常溫含有10%各冷凍保護(hù)劑、10%胎牛血清，80%RPMI-1640培養(yǎng)液中30 min，再放入4℃含有30%各冷凍保護(hù)劑的玻璃化溶液中20 min，最后將各組血管隨機(jī)分別放入4℃含有40%各冷凍保護(hù)劑的玻璃化溶液內(nèi)，所有標(biāo)本冷平衡30 min。等滲平衡后將血管片段分別置入各不同濃度冷凍保護(hù)劑的玻璃化溶液的1ml凍存管內(nèi)，4℃凍存 30 min后，移到﹣20℃凍存2 h再移到﹣80℃條件下過夜后投入到液氮罐中。2.快速復(fù)溫：凍存管從液氮內(nèi)取出后，直接放入37℃水浴至完全融化，取出標(biāo)本放入常溫0.5mol/L蔗糖溶液中,搖勻，洗脫10 min，去溶液，再加入0.25mol/L蔗糖溶液中,搖勻，洗脫10 min，去溶液，然后用Hanks液洗脫。3.玻片的制作：(1)將所取標(biāo)本放入4%的多聚甲醛中固定12 h；(2)50%乙醇沖洗 30 min；(3)50%、70%、80%、90%乙醇脫水各 40 min，95%、100%乙醇脫水各兩次，每次20 min；(4)TO透明液透明 20 min；(5)依次在軟蠟和硬蠟中各浸2 h；(6)常規(guī)石蠟包埋。4.HE染色：(1)切片、展片、烤片；(2)組織切片常規(guī)脫蠟至水：TO透明液Ⅰ、TO透明液Ⅱ各5 min；100%無水乙醇Ⅰ、100%無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次各5 min，蒸餾水漂洗5 min×3次；(3)蘇木精液染色5 min；(4)流水洗去蘇木精液；(5)1%鹽酸酒精1 s；(6)稍水洗；(7)促藍(lán)液返藍(lán)5 s；(8)流水沖洗15 s；(9)0.5%伊紅液染色1 min；(10)蒸餾水稍洗1 min；(11)70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ各10 s，100%無水乙醇Ⅱ、100%無水乙醇Ⅰ各5 min；(12)中性樹膠封片后光鏡觀察；5.免疫組化染色:(1)切片、展片、烤片、脫蠟：60℃條件下烤片1 h，再行脫蠟水化處理：TO透明液Ⅰ、TO透明液Ⅱ各5 min；100%無水乙醇Ⅰ、100%無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次各5 min，PBS洗3 min×3次。(2)抗原修復(fù)：檸檬酸鈉抗原修復(fù)液放入微波爐加熱至沸騰，后將切片放入抗原修復(fù)液加熱，高火5 min,中火7 min，自然冷卻至室溫后，PBS洗3 min×3次。(3)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%H2O2覆蓋組織，室溫孵育10 min，PBS洗3 min×3次。(4)封閉：5%BSA封閉液濕盒孵育30 min，甩干，勿洗。(5)滴加一抗：用免疫組化筆在距離組織邊緣2mm處畫圈，滴加一抗100ul后(小鼠或者兔IgG抗體,濃度為1：100)，置于4℃冰箱孵育過夜。第2日取出免疫組化濕盒，37 ℃室溫環(huán)境下孵育45 min，PBS充分淋洗5 min×3次。(6)滴加生物素標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG，室溫環(huán)境下孵育30 min，PBS充分淋洗5 min×3次。(7)滴加SABC，37℃孵育30 min，PBS充分淋洗5 min×3次。(8)DAB顯色：在棕色小玻璃瓶將DAB-A、DAB-B、DAB-C、蒸餾水各一滴混勻成DAB顯色工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。顯微鏡下查看切片顯色情況，約3 min顯色后，蒸餾水沖洗，停止顯色。(9)切片復(fù)染返藍(lán)：蘇木素染液染色時(shí)間1 min，流動(dòng)自來水持續(xù)振洗1 min至無色，1%鹽酸酒精分化5 s，流動(dòng)自來水持續(xù)振洗1 min，1%氨水返藍(lán)10 s，流動(dòng)自來水持續(xù)振洗1 min。(10)脫水：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%無水乙醇Ⅰ、100%無水乙醇Ⅱ、TO透明液各3 min；組織完全干燥后，使用中性樹膠封片，然后顯微鏡下觀察。(11)Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計(jì)單位體積陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析(ANOVA)，按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組間HE染色結(jié)果：

圖1 對照組(HE染色×100) 圖2 30%乙二醇組(HE染色 ×100) 圖3 40%乙二醇組(HE染色 ×100)

圖4 30%丙二醇組(HE染色×100) 圖5 40%丙二醇組(HE染色 ×100) 圖6 30%甘油組(HE染色×100)

圖7 40%甘油組(HE染色 ×100) 圖8 30%二甲基亞砜組(HE染色×100 圖9 40%二甲基亞砜組(HE染色×100)

2.2各組間VEGF免疫組化檢測結(jié)果

2.2.1保護(hù)劑種類 如表1所示：在保護(hù)劑濃度為30%時(shí)，冷凍保護(hù)劑種類不同，所測得的小動(dòng)脈VEGF平均光密度值也不相同。與對照組比較，甘油組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，丙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)；與乙二醇組比較，丙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甘油組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丙二醇組比較，甘油組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與甘油組相比較，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 30%濃度各組人小口徑動(dòng)脈VEGF的檢測結(jié)果

如表2所示：在保護(hù)劑濃度為40%時(shí)，冷凍保護(hù)劑種類不同，所測得的小動(dòng)脈VEGF平均光密度值也不相同。與對照組比較，甘油組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，丙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)；與乙二醇組比較，丙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甘油組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丙二醇組比較，甘油組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與甘油組相比較，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 40%濃度各組人小口徑動(dòng)脈VEGF的檢測結(jié)果

2.2.2保護(hù)劑濃度 如表3所示，隨著冷凍保護(hù)劑濃度地增加，丙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甘油組小口徑動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；乙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同濃度保護(hù)劑各組人小口徑動(dòng)脈VEGF平均 光密度值(×102)的檢測結(jié)果

各組小動(dòng)脈VEGF免疫組化結(jié)果圖示：

圖10 對照組(×200)圖11 30%乙二醇組(×200) 圖12 40%乙二醇組(×200)

圖13 30%丙二醇組(×200) 圖14 40%丙二醇組(×200) 圖15 30%甘油組(×200)

圖16 40%甘油組(×200) 圖17 30%二甲基亞砜組(×200) 圖18 40%二甲基亞砜組(×200)

3 討 論

冷凍保護(hù)劑對小動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)的影響表明這四種冷凍保護(hù)劑對人小口徑動(dòng)脈有一定程度地保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是通過與溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，減輕“細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷”，從而保護(hù)細(xì)胞和組織；此外，滲透性保護(hù)劑還可以滲透入細(xì)胞，使細(xì)胞避免處于過冷狀態(tài)，減少“溶質(zhì)損傷”[4、5]。本研究中，二甲基亞砜組和甘油組可見血管損傷程度較輕，原有組織結(jié)構(gòu)較完整，內(nèi)皮細(xì)胞脫落較少，而丙二醇組表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞小片狀脫失，內(nèi)彈力膜有部分空隙，表明丙二醇對小動(dòng)脈的冷凍保護(hù)效果較甘油、二甲基亞砜差；乙二醇組見內(nèi)皮細(xì)胞大片脫失,內(nèi)彈性膜部分?jǐn)嗔?、缺?平滑肌結(jié)構(gòu)部分破壞，損傷較重，可見乙二醇的保護(hù)作用較二甲基亞砜、甘油、丙二醇差。

冷凍保護(hù)劑種類對小動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響:血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelia growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子(heparin-binding growth factor)，是目前所有促血管生成因子中研究最多最清楚的一個(gè)[6]，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞芽生[7、8]，誘導(dǎo)新生血管網(wǎng)絡(luò)的形成與重構(gòu)[9-12]，在血管新生整個(gè)過程，發(fā)揮了不可取代的作用。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測VEGF的表達(dá)情況，評估血管的生物學(xué)功能。免疫組化檢測人小動(dòng)脈VEGF表達(dá)情況表明：與對照組比較，甘油組、二甲基亞砜組、丙二醇組三組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，表示甘油組、二甲基亞砜組、丙二醇組小動(dòng)脈 VEGF表達(dá)明顯增加，小動(dòng)脈生物學(xué)功能較對照組好。與乙二醇組比較，丙二醇組、二甲基亞砜組、甘油組三組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，其中，二甲基亞砜組平均光密度值高于甘油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，甘油組高于丙二醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，表明經(jīng)二甲基亞砜冷凍保存人小動(dòng)脈快速復(fù)溫后生物學(xué)活性優(yōu)于甘油，而甘油又優(yōu)于丙二醇，丙二醇又優(yōu)于乙二醇。與對照組比較，乙二醇組小動(dòng)脈VEGF平均光密度值稍高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，表明在本次實(shí)驗(yàn)研究中，乙二醇對人小動(dòng)脈的冷凍保護(hù)效果欠佳。雖然本實(shí)驗(yàn)研究表明乙二醇對小動(dòng)脈的冷凍保存效果較差，但Choi Y H[13]等人研究表明乙二醇對其他的組織或器官保存效果較好，這可能與被保存組織或器官種類相關(guān)。

冷凍保護(hù)劑濃度和毒性的關(guān)系：理想的冷凍保護(hù)劑的保存效果隨冷凍保護(hù)劑濃度的增加而增強(qiáng)，可以在冷卻和解凍期間防止細(xì)胞損傷，但濃度增高時(shí)，毒性也會在增強(qiáng)[14、15]。冷凍保護(hù)劑的毒性包括特異性毒性和非特異性毒性，特異性毒性僅發(fā)生在高溫或特定的細(xì)胞或器官中，主要包括：細(xì)胞膜毒性、氧化損害、滲透損傷、冷休克等；非特異性毒性可能是通過干擾水分子之間的氫鍵防止結(jié)冰而起到毒性作用[16、17]。毒性取決于多種因素，如冷凍保存時(shí)間、溫度和濃度、保存組織細(xì)胞類型、冷凍保護(hù)劑加入及去除時(shí)間、降溫及復(fù)溫速率等因素[18-21]，成功的深低溫保存與上述因素密不可分[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)冷凍保護(hù)劑濃度不同時(shí)，通過免疫組化檢測VEGF的表達(dá)情況也有不同。隨著保護(hù)劑濃度的增加，丙二醇組、二甲基亞砜組、甘油組血管的VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，表示血管的生物學(xué)活性增強(qiáng)，而40%乙二醇組血管VEGF平均光密度值明顯低于30%乙二醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，表明乙二醇的濃度由30%上升至40%時(shí)，保護(hù)效果增強(qiáng)，但同時(shí)毒性亦增強(qiáng)，綜合結(jié)果導(dǎo)致血管的生物學(xué)活性減弱。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了冷凍保護(hù)劑在血管深低溫保存過程中的保護(hù)作用，研究結(jié)果表明二甲基亞砜、甘油、丙二醇對人小動(dòng)脈的深低溫保存有保護(hù)作用，乙二醇的冷凍保護(hù)作用不明顯，其中，40%體積濃度的二甲基亞砜對人小口徑動(dòng)脈的冷凍保護(hù)效果較甘油、丙二醇、乙二醇好。