湯定中 余春麗 羅國君△
(上海市第六人民醫(yī)院金山分院 1.神經(jīng)內(nèi)科;2.腎病科 上海 201599)
腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是腦血流不足或中斷致腦組織缺血缺氧一段時間,之后血供恢復(fù),以腦組織損傷程度和功能障礙反而加重為主要特征的復(fù)雜病理現(xiàn)象[1]。該病的臨床表現(xiàn)主要為感覺、運(yùn)動或意識嚴(yán)重障礙等。CIRI是大部分缺血性腦血管病的重要病理生理過程,近年來,隨著缺血性腦血管病發(fā)病率逐年增加,CIRI發(fā)生的幾率也不斷升高,并且拉高了腦血管病患者的殘疾率、死亡率[2],對患者生命健康造成嚴(yán)重威脅。目前,CIRI治療中常用的腦保護(hù)藥物為麻醉藥物、他汀類藥物、N-乙酰半胱氨酸、阿片類物質(zhì)、磷酸肌酸、蛋白酶抑制劑等等[3],它們通過不同途徑對腦損傷起到一定的改善作用,但尚無特效藥物。明確各種藥物的作用靶點(diǎn)及療效,開發(fā)新的腦保護(hù)藥物是該病的研究重點(diǎn),而中醫(yī)藥是CIRI新藥研發(fā)的主要來源之一[4]。當(dāng)歸多糖為中藥當(dāng)歸的主要活性成分,林國芳等[5]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸多糖可能通過抑制神經(jīng)元凋亡對CIRI大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但具體作用機(jī)制不明確。本次研究主要基于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路,探討當(dāng)歸多糖對CIRI模型大鼠的影響。報告如下。
1.1材料 (1)研究對象:6~7周SPF級健康SD大鼠65只,均為雄性,體重250~280g,平均(263.46±9.54)g,購自常州卡文斯實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(蘇)2016-0010。將所有大鼠每籠5只置于飼養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行為期5 d的適應(yīng)性飼養(yǎng),溫度設(shè)定為24℃~26℃,相對濕度維持在50%~70%,光照時間6:00~18:00,大鼠在籠內(nèi)自由活動并攝入標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及清潔飲水,定期清掃鼠籠并消毒。(2)主要藥品與試劑:當(dāng)歸多糖,純度≥98%,貨號:s31086,規(guī)格:每瓶25 g,購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司,使用時采用蒸餾水配制成濃度為3 mg/mL、6 mg/mL的當(dāng)歸多糖溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。尼莫地平片,規(guī)格:每片20 mg,批號:20180613,購自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,使用時用蒸餾水配制成濃度為1.5 mg/mL的尼莫地平混懸液,現(xiàn)用現(xiàn)配。PBS、TBST緩沖液,購自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的脫氧尿三磷酸(dUTP)缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL法)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,購自上海恒斐生物科技有限公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒,購自北京百奧萊博科技有限公司;大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)檢測試劑盒,購自武漢菲恩生物科技有限公司;RIPA組織裂解液,購自北京碧橙藍(lán)生物科技有限責(zé)任公司;兔抗磷酸化原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1(p-Raf1)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶2(p-MEK2)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體,購自北京孚博生物科技有限公司;羊抗兔IgG-HRP(辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體),購自上海恒斐生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒,購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒,購自愛必信(上海)生物科技有限公司。(3)主要儀器設(shè)備:ID-Centrifuge 12 S II型離心機(jī),瑞士DiaMed GmbH公司產(chǎn)品;EM-3000型光學(xué)顯微鏡,日本多美公司產(chǎn)品;SUNRISE型酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司產(chǎn)品;GeneQuant Pro型超微核酸蛋白檢測儀,美國GE公司產(chǎn)品;HYDRASYS 2型全自動電泳儀,法國SEBIA公司產(chǎn)品;Trans-Blot型轉(zhuǎn)膜儀,美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。
1.2方法 (1)造模及實驗方法[6]:適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后,將所有大鼠依照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組12只和造模組53只。腹腔注射4%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠,仰臥位固定于小動物手術(shù)臺上,頸前右側(cè)常規(guī)備皮消毒,于頸正中線右側(cè)旁開0.5 cm處作縱向切口,逐層分離組織,暴露右頸總動脈,分離右頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及翼腭動脈(PPA),造模組用4號手術(shù)線將ECA遠(yuǎn)心端和PPA近心端結(jié)扎,動脈夾夾閉CCA、ICA,于距離ICA和ECA交叉部4 mm的ECA結(jié)扎處剪“V”形切口,長度為0.2 mm左右,并將4號手術(shù)線穿過交叉部3 mm內(nèi);“V”形切口內(nèi)插入2-0尼龍魚線,去掉夾閉ICA的動脈夾,將線栓(2-0尼龍魚線頭端5 mm用石蠟包被,且標(biāo)記18 mm處)依次經(jīng)ECA-ICA和ECA交叉部-ICA-大腦前動脈(ACA)、中動脈(MCA)分叉處插入16 mm~18mm,阻斷MCA入口,切口外留線栓1 cm左右;將ECA遠(yuǎn)心端結(jié)扎并固定線栓;對照組僅分離動脈,不進(jìn)行栓塞;去掉夾閉CCA的動脈夾,縫合皮膚;2 h后,輕輕拉出線栓,感受到阻力時剪斷,將ECA近心端結(jié)扎;于傷口注射青霉素2.5 mg/kg以防止染。待大鼠清醒且生命體征穩(wěn)定后,采用Zea longa神經(jīng)功能缺失評分[6]評估大鼠神經(jīng)功能,評分為1~3分即認(rèn)為腦缺血再灌注損傷模型建立成功。將造模成功的48只大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組及當(dāng)歸多糖低、高劑量組,各12只。模型組、對照組分別灌胃給予蒸餾水10 mL/kg,每日1次;西藥組灌胃給予1.5 mg/mL尼莫地平懸液10 mL/kg,每日1次;當(dāng)歸多糖低、高劑量組分別灌胃給予3 mg/mL、6 mg/mL當(dāng)歸多糖溶液10 mL/kg,每日1次。所有大鼠連續(xù)給藥7 d。(2)神經(jīng)功能缺損評分評估:末次給藥次日,采用Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分:無神經(jīng)功能缺損記0分;提尾時左側(cè)前肢伸展不完全記1分;自發(fā)行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈記2分;自發(fā)行走時向左側(cè)跌倒記3分;意識喪失,不能自發(fā)行走記4分。(3)標(biāo)本采集與處理[7]:麻醉后于冰上斷頭取腦,自缺血側(cè)腦組織重分離海馬組織,其中1/2液氮速凍后保存于-80℃冰箱內(nèi),以備蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測;另外1/2海馬組織加入10倍體積預(yù)冷的生理鹽水,充分勻漿后,以3 000 r/min速度離心15 min,將組織上清液保存在-70 ℃冰箱內(nèi)。剩余缺血側(cè)腦組織置于4%多聚甲醛內(nèi)固定48 h,經(jīng)二甲苯透明、梯度酒精脫水、石蠟包埋后,制備2 μm切片,于冷水內(nèi)展片放于載玻片上,65℃烘干1 h,4℃保存?zhèn)錂z。(4)TUNEL法檢測大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)[8]:將(3)中制備的組織切片取出,恢復(fù)至室溫,采用二甲苯脫蠟10 min×2 次,100%-100%-95%-95%-80%-80%-70%-70%酒精依次處理5 min,然后去離子水沖洗2 min×3 次使切片水化;采用終止液50 mL處理切片5 min使內(nèi)源性過氧化物酶失活,去離子水沖洗2 min×3 次;按照試劑盒說明書配制TUNEL反應(yīng)液,取50 μL處理切片,37 ℃反應(yīng)5 min后終止,PBS沖洗2 min×3 次;取HRP標(biāo)記鏈霉親和素溶液50 μL處理切片,18 ℃反應(yīng)10 min后,PBS沖洗2 min×3 次;采用DAB顯色試劑盒室溫染色6 min,去離子水漂洗10 s后,用甲基綠溶液染色3 min;依次采用去離子水漂洗、70%-90%-95%-95%-100%酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果,凋亡陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕色,于400倍鏡下,每張切片隨機(jī)選擇5個不重復(fù)視野,計數(shù)凋亡細(xì)胞個數(shù),并取平均值。(5)ELISA法檢測大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平[9]:將1.2.3中制備的海馬組織上清液取出,4℃緩慢融化并恢復(fù)至室溫,按照ELISA試劑盒說明書,采用SUNRISE型酶標(biāo)儀測定海馬組織上清液內(nèi)Bcl-2和Bax水平。(6)Western Blot法檢測大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平[8]將(3)中保存的海馬組織取出100 mg,置于玻璃勻漿器內(nèi),加入RIPA組織裂解液(含苯甲基磺酰氟)1 mL,于冰上勻漿30 min,超聲裂解5 s×3次,4℃、12000 r/min速度離心5 min,分離上清液,采用超微核酸蛋白檢測儀測定總蛋白濃度;取蛋白樣本,加入2×蛋白上樣緩沖液10 μL,煮沸5 min,冷卻備用;按照試劑盒說明配制SDS-PAGE10%分離膠和5%濃縮膠,注入電泳儀上;上樣,開始電泳,電壓為濃縮膠80 V、分離膠120 V;采用轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,TBST洗膜10 min×3次;PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉液內(nèi),室溫?fù)u床封閉1.5 h;PVDF膜置于p-Raf1(1:1 000稀釋)、p-MEK2(1:1 000稀釋)、p-ERK1/2(1:800稀釋)、β-actin(1:2 000稀釋)一抗工作液內(nèi),4℃孵育過夜,取出后TBST洗膜10 min×3次;將PVDF膜置于羊抗鼠二抗工作液(1:5 000稀釋)內(nèi),室溫孵育2 h,取出后TBST洗膜10 min×3次;采用ECL處理PVDF膜5 min后曝光。掃描曝光后的底片,用Quantity one軟件分析各蛋白條帶灰度值,計算p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白相對于β-actin的表達(dá)量。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均統(tǒng)一整理,采用spss22.0軟件包分析,符合正態(tài)性的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05存在統(tǒng)計學(xué)意義;組間多重比較采用LSD-t檢驗,P<0.05存在統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與對照組比較,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較低,且當(dāng)歸多糖低劑量組>當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表1。
表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較
2.2各組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較 TUNEL染色結(jié)果顯示,對照組有少量凋亡細(xì)胞存在(見圖1A);模型組可見大量棕色凋亡細(xì)胞核(見圖1B);當(dāng)歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量較模型組有不同程度減少(見圖1C、D、E)。定量分析顯示,與對照組比較,模型組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)均較低,且當(dāng)歸多糖低劑量組>當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表2。
表2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較
注:(A:對照組 B:模型組 C:當(dāng)歸多糖低劑量組 D:當(dāng)歸多糖高劑量組 E:西藥組)圖1 各組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞觀察 (TUNEL染色,×400)
2.3各組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平比較 與對照組比較,模型組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠海馬組織Bcl-2水平均較高,且當(dāng)歸多糖低劑量組<當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠海馬組織Bax水平均較低,且當(dāng)歸多糖低劑量組>當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表3。
表3 各組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平比較
2.4各組大鼠海馬組織 p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較與對照組比較,模型組大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均較低,且當(dāng)歸多糖低劑量組>當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表4,圖2。
表4 各組大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較
注:(A:對照組 B:模型組 C:當(dāng)歸多糖低劑量組 D:當(dāng)歸多糖高劑量組 E:西藥組)圖2 Western Blot法檢測各組大鼠海馬組織海馬組織 p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)結(jié)果
有報道稱[10-12],MAPK途徑在腦、心臟等重要器官缺血再灌注時活化,在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,改變其活化狀態(tài)有助于減輕組織損傷。
在此次研究中,我們即基于MAPK/ERK信號通路,探討當(dāng)歸多糖對CIRI大鼠的影響。當(dāng)歸多糖是中藥當(dāng)歸中的額水溶性多糖物質(zhì),包括葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等,藥理研究認(rèn)為[13],其具有調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)造血、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗輻射、防治肺纖維化、抗衰老等多種功效。閆安等[14]采用不同劑量的當(dāng)歸多糖對線栓法制備的CIRI模型大鼠進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)其能通過減少腦組織氧化應(yīng)激水平,以及抑制炎癥相關(guān)信號通路Toll樣受體-4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(TLR-4/NF-κB)激活的作用保護(hù)大鼠腦組織。方針等[15]研究則發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸多糖能明顯促進(jìn)CIRI大鼠模型的神經(jīng)功能恢復(fù)和血管生成。由此可見,當(dāng)歸多糖可通過不同機(jī)制干預(yù)CIRI進(jìn)展。在本研究中,我們采用大腦中動脈阻塞法成功建立了CIRI大鼠模型,分別經(jīng)不同濃度的當(dāng)歸多糖和尼莫地平治療后發(fā)現(xiàn),與模型組比較,各用藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較低,且當(dāng)歸多糖低劑量組>當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Zea Longa評分是評估神經(jīng)功能缺損程度的常用指標(biāo),得分越高,提示神經(jīng)功能缺損越明顯,病情越嚴(yán)重,上述研究結(jié)果表明當(dāng)歸多糖可以有效改善CIRI大鼠神經(jīng)功能障礙,緩解病情,且藥物劑量越高,作用效果越明顯。TUNEL檢測結(jié)果顯示,與模型組比較,各用藥組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)均較低,且當(dāng)歸多糖低劑量組>當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明高劑量當(dāng)歸多糖能有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕缺血側(cè)腦組織損傷。MAPK/ERK信號通路是MAPKs通路的一種類型,為調(diào)控細(xì)胞凋亡的常見通路。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,各給藥組大鼠海馬組織海馬組織Bcl-2水平較高,BAX及p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均較低,且當(dāng)歸多糖高劑量組和西藥組改變較模型組最明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明高劑量當(dāng)歸多糖可以有效下調(diào)海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá),進(jìn)而提高海馬組織Bcl-2水平,降低海馬組織Bax水平,這可能是當(dāng)歸多糖抑制CIRI大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。
綜上所述,當(dāng)歸多糖能劑量依賴性的減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax水平,抑制缺血腦組織細(xì)胞凋亡,其作用可能與下調(diào)MAPK/ERK信號通路中的p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)有關(guān)。