基于穩(wěn)定劑和微膠囊化聯(lián)用技術(shù)制備姜黃素納米顆粒

譚少聰，邱夢輝，黃德金，鐘俊鋒，朱鴻明，敬思群*，李海霞

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.珠海雅富興源食品工業(yè)有限公司，廣東 珠海 519000）

姜黃色素是從姜科、天南星科中的一些植物根莖中提取的一種天然多酚類化合物，具有明亮的黃色，粉末呈橙黃色結(jié)晶狀，亦稱“郁金黃色素”。它具有β-二酮的庚二烯和兩個(gè)鄰甲基化的酚相連組成的對稱分子結(jié)構(gòu)，味稍苦[1]，著色力強(qiáng)，毒性小，長時(shí)間以來作為一種常用的天然色素被普遍使用于食品、紡織、化妝品等產(chǎn)品上。近年來許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化（延緩衰老）[2-4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]、抗突變、抗抑郁、抗病毒、心血管保護(hù)、修復(fù)腦部損傷、緩解帕金森癥狀等多種藥理和保健作用[7-10]，因此姜黃素有望作為功能性色素應(yīng)用于功能性食品上。但由于姜黃素易受外界因素影響失去其本身的顏色，尤其在室外光照下，姜黃素水溶液極其不穩(wěn)定，產(chǎn)生降解反應(yīng)，失去原來的藥理作用和顏色，這就限制了姜黃素在液體食品中產(chǎn)業(yè)化開發(fā)與應(yīng)用。有研究報(bào)道將其制成納米脂質(zhì)體后，可顯著改善其水溶性，提高生物利用度[11-12]，劉延敏等[13]通過熔融速冷及室溫冷卻的方法，制備了姜黃素的固體分散體，并發(fā)現(xiàn)其體外溶出度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純姜黃素；葛云龍等[14]使用反溶劑法制備的姜黃素納米粒凍干粉能夠改善姜黃素水溶性，提高姜黃素的生物利用度。但鮮見改善其光敏性的研究報(bào)道。

改善天然色素穩(wěn)定性的方法有添加穩(wěn)定劑[15]、微膠囊化[16]、色素分子結(jié)構(gòu)修飾[17]、改善天然色素加工儲(chǔ)存條件[18]等。其中微膠囊技術(shù)是提高天然色素穩(wěn)定性的一種較為有效的方法。周丹紅等[19]以阿拉伯膠、β－環(huán)糊精、蔗糖（1∶1∶1，質(zhì)量比）作為復(fù)合壁材對莧菜紅色素進(jìn)行微膠囊化處理，提高了該色素的貯存穩(wěn)定性；韓愛芝等[20]以阿拉伯樹膠和β－環(huán)糊精為壁材，采用噴霧干燥法包埋花色苷，發(fā)現(xiàn)可以降低花色苷對外界條件的敏感性。李宛陶等[21]以靈武長棗棗皮紅色素為原料，探討了常見金屬離子對棗皮紅色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的Zn2+有利于棗皮紅色素的穩(wěn)定性。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入0.1%植酸作為抗氧化劑,0.1 g/LZn2+溶液、0.1%的檸檬酸溶液作為穩(wěn)定劑都有利于改善姜黃素溶液對光的穩(wěn)定性。本文利用添加穩(wěn)定劑和微膠囊化聯(lián)用制備姜黃素納米顆粒（玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠-姜黃素分散體系）來改善姜黃素的光敏性，確定了姜黃素納米顆粒的最優(yōu)制備工藝，解決姜黃素應(yīng)用于液體食品中的褪色問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

姜黃素粉末（食品級，純度37.98%）：珠海雅富興源食品工業(yè)有限公司；姜黃素標(biāo)品（一級標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%）：上海遠(yuǎn)慕生物科技公司；玉米醇溶蛋白（食品級）：市售；阿拉伯膠（食品級）：河南唐古生物科技有限公司；硫酸鋅（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

SHE-3000G全波長多功能酶標(biāo)儀分析儀：上海美譜達(dá)儀器有限公司；FD-1E-50冷凍干燥機(jī)：上海豫明儀器有限公司；iCAP Q ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、1510酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；LS-POP（9）激光粒度分析儀：珠海歐美克儀器有限公司；JB-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：常州榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃素最大吸收波長及回歸方程

最大吸收波長：準(zhǔn)確稱取0.01 g姜黃素粉末樣品于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，得到濃度為0.1 mg/mL的姜黃素溶液，從中移取500 μL用95%乙醇溶液定容到100 mL，得到濃度為0.5 μg/mL的姜黃素溶液，調(diào)節(jié)波長，測定在不同波長下姜黃素的吸光值，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，確定姜黃素的最大吸收波長為425 nm。

回歸方程：準(zhǔn)確稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于50 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，分別稀釋得到0、15、30、45、60、75 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，425 nm 處測定吸光度，以濃度X對吸光度Y進(jìn)行線性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.316 8X+0.634 9，R2=0.997 4，姜黃素濃度在0～75 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.2.2 穩(wěn)定劑鋅離子最適作用濃度篩選

姜黃素母液的配制：稱取0.175 g姜黃素溶解于280 mL的無水乙醇中，攪拌至姜黃素粉末完全溶解。

不同鋅離子濃度儲(chǔ)備液的配制：分別稱取硫酸鋅0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 g 溶解于 100 mL 蒸餾水中，攪拌均勻，配制成 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g/L 硫酸鋅儲(chǔ)備溶液，保存好備用。

鋅離子最適濃度篩選試驗(yàn)：將姜黃素母液分裝成40 mL的7份樣液，在1～7號(hào)樣液中分別加入10 mL的 0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g/L 硫酸鋅儲(chǔ)備液，攪拌均勻得到硫酸鋅濃度分別為 0.00、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36 g/L 的樣液，（20±5）℃放置。每隔 12 h在425 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度，平行3次取平均值。

1.2.3 姜黃素納米顆粒制備操作要點(diǎn)

1.2.3.1 玉米醇溶蛋白-姜黃素儲(chǔ)備液的制備

稱取1 g玉米醇溶蛋白溶解于50 mL 85%乙醇中，磁力攪拌1 h，離心去除不溶物作為玉米醇溶蛋白液，加入0.108 g姜黃素于玉米醇溶蛋白液中攪拌30 min。

玉米醇溶蛋白特有的兩親性和獨(dú)特溶解性，能夠有效制備納米顆粒，且復(fù)合阿拉伯膠的玉米醇溶蛋白納米顆粒的穩(wěn)定性、耐鹽耐酸堿性顯著提高[22]。試驗(yàn)按玉米醇溶蛋白與阿拉伯膠8∶10的質(zhì)量比稱取阿拉伯膠溶解于150 mL0.4 g/L硫酸鋅溶液（水浴加熱60℃溶解），攪拌至完全溶解。

1.2.3.2 姜黃素納米顆粒的制備

將玉米醇溶蛋白-姜黃素儲(chǔ)備液緩慢加入阿拉伯膠中攪拌30 min后得（姜黃素-玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠）納米顆粒液，對其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到姜黃素納米顆粒。

1.2.4 姜黃素納米顆粒制備單因素試驗(yàn)

以包埋率為考察指標(biāo)，分析水相與醇相體積比、壁材比（阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比）、芯壁比（姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比）對姜黃素納米顆粒包埋率的影響，確定3個(gè)因素的最適作用條件。

水相與醇相體積比：玉米醇溶蛋白1 g、姜黃素0.02 g、阿拉伯膠1 g、85%乙醇50 mL，硫酸鋅0.3 g/L（以總體積算），蒸餾水與乙醇體積比為 1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1，按 1.2.3.2 操作制備姜黃素納米顆粒，確定水相與醇相體積的最適比例。

壁材比（阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比）∶玉米醇溶蛋白1 g、姜黃素0.02 g、蒸餾水75 mL、85%乙醇50 mL、硫酸鋅0.3 g/L（以總體積算）、阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比為 2∶10、4∶10、6∶10、8∶10、10∶10，按1.2.3.2操作制備姜黃素納米顆粒，確定最適壁材比。

芯壁比（姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比）：玉米醇溶蛋白1 g、阿拉伯膠1 g、85%乙醇 50 mL、硫酸鋅0.3 g/L(以總體積算）、蒸餾水75 mL，姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比 5.5∶100、6∶100、6.5∶100、7∶100、7.5:100，按 1.2.3.2 操作制備姜黃素納米顆粒，確定最適芯壁比。

1.2.5 姜黃素納米顆粒包埋率的測定

移取1 mL負(fù)載姜黃素的納米顆粒置于有4 mL 95%乙醇溶液的燒杯中，超聲15 min萃取獲得游離的姜黃素，用0.22 μm尼龍膜過濾，反復(fù)萃取3次，合并萃取液。以95%乙醇作為空白對照，在425nm下測定樣品的吸光度，使用姜黃素在95%乙醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出游離姜黃素后，按照下式計(jì)算包埋率、載藥量。

1.2.6 姜黃素納米顆粒粒徑測定

將樣品稀釋一定的倍數(shù)，置于樣品池中，使用激光粒度儀測量其粒徑。

1.2.7 姜黃素納米顆粒對光穩(wěn)定性試驗(yàn)

將樣品稀釋4倍，（20±5）℃放置，每24 h使用酶標(biāo)儀測量一次吸光度值，觀察微膠囊技術(shù)對姜黃素光敏性的影響。以反應(yīng)時(shí)間t為橫坐標(biāo)，以姜黃素的保留率為縱坐標(biāo)，繪制光解反應(yīng)圖，觀察納米顆粒對姜黃素光敏性的影響。以保留率表示對光的穩(wěn)定性。

式中：At為室溫（20±5）℃下不同時(shí)間段測得的樣品吸光度；A1為開始時(shí)測得的樣品吸光度。

1.2.8 多指標(biāo)綜合平衡法

多指標(biāo)綜合平衡法是指在正交試驗(yàn)結(jié)果分析中先分別考察每個(gè)因素對各指標(biāo)的影響，然后進(jìn)行分析比較，確定出最好的水平，從而得到最好的試驗(yàn)方案[23]。

光穩(wěn)定性評分：1-（A第1天-A第7天）/A第1天；粒徑評分：1-粒徑，分值越大越好。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用正交設(shè)計(jì)助手處理，采用SPSS 22.0 for Windows軟件進(jìn)行方差分析，p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism 7.04、Origin 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定劑鋅離子最適作用濃度確定

鋅離子最適作用濃度篩選結(jié)果見圖1。

圖1 鋅離子最適作用濃度篩選Fig.1 Screening of optimal concentration of Zn2+

由圖1可知，不同濃度的鋅離子加入姜黃素溶液中在0～48 h內(nèi)，姜黃素都在褪色，但比不加鋅離子的穩(wěn)定；48 h～60 h，加入不同濃度的鋅離子姜黃素溶液的吸光度都增加；60 h后，加入0.3 g/L鋅離子的姜黃素溶液斜率最小，且吸光度較為穩(wěn)定。因此選擇鋅離子作用濃度為0.3 g/L。

2.2 姜黃素納米顆粒制備單因素試驗(yàn)

水相與醇相體積比試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 水相與醇相體積比對包埋率的影響Fig.2 Effect of volume ratio of aqueous phase to ethanol phase on embedding rate

由圖2可知，水相與醇相的體積比從1.5∶1到2.5∶1時(shí)，包埋率從85.495%上升到93.227%，繼續(xù)增加到3.5∶1時(shí)，包埋率下降至84.900%?？赡苁请S著水相與醇相的體積比增加，醇相的濃度下降，姜黃素溶解達(dá)到過飽和狀態(tài)，在沉積過程中，姜黃素部分析出，導(dǎo)致包埋率下降，因此確定最適水相與醇相體積比為2.5∶1。阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比對包埋率的影響Fig.3 Effect of mass ratio of Arabic gum to zein on embedding rate

由圖3可知，隨著阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白質(zhì)量比從2∶10到6∶10，包埋率從85.495%上升到87.567%，之后包埋率開始下降。由于此時(shí)阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白所帶的電荷完全中和，包埋率最大，之后阿拉伯膠的繼續(xù)增加導(dǎo)致電荷失衡，致包埋率下降。因此確定最適壁材比為6∶10（質(zhì)量比）。姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比對包埋率的影響見圖4。

圖4 姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比對包埋率的影響Fig.4 Effect of mass ratio of curcumin to zein-Arabic gum on embedding rate

由圖4可知，當(dāng)姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比從5.5∶100到6.5∶100時(shí)，包埋率從97.130%上升到97.608%，增至7.5∶100時(shí)，包埋率下降。可能是當(dāng)姜黃素與玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比為6.5∶100時(shí)，壁材的荷載量達(dá)到最大負(fù)荷，之后比例增加導(dǎo)致游離的姜黃素的量增加，致包埋率下降，因此確定最適芯壁比為 6.5∶100（質(zhì)量比）。

2.3 姜黃素納米顆粒制備正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)考察基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)對水相與醇相體積比、壁材比、芯壁比3個(gè)因素工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以包埋率、光穩(wěn)定性評分、粒徑評分為考察指標(biāo)，使用多指標(biāo)綜合平衡法確定最優(yōu)工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，以光穩(wěn)定性評分為考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果見表2，以包埋率為考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果見表3，以粒徑評分為考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果見表4，不同指標(biāo)最優(yōu)組合比較結(jié)果見表5。

優(yōu)組合為A3B3C3，即水相與醇相體積比3∶1，壁材比（阿拉伯膠∶玉米醇溶蛋白）為 8∶10（質(zhì)量比），芯壁比（姜黃素∶玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠）7∶100（質(zhì)量比），經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得在最優(yōu)工藝條件下姜黃素納米顆粒包埋率為95.844%，載藥量為 62 mg/g，粒徑為 0.940 μm。

表1 姜黃素納米顆粒制備L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1L9（34）orthogonal results of preparation of curcumin nanoparticles

表2 以光穩(wěn)定性評分為考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis results with optical stability score as index

表3 以包埋率為考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results with embedding rate as index

表4 以粒徑評分為考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results with particle size score as index

表5 不同指標(biāo)最優(yōu)組合比較Table 5 Comparison of optimal combination with different indexes

由表1、表2、表3、表4、表5可得，因素A對光穩(wěn)定性評分、包埋率、粒徑評分均有顯著影響，根據(jù)R值，以光穩(wěn)定性評分為指標(biāo)時(shí)優(yōu)選A3，以包埋率為指標(biāo)時(shí)優(yōu)選A1，以粒徑評分為指標(biāo)時(shí)優(yōu)選A2；因素B對包埋率有顯著影響，根據(jù)R值故選擇B3；因素C對3個(gè)指標(biāo)都無顯著影響，但因?yàn)橹苽涞氖羌{米顆粒，粒徑越小（粒徑評分越大）越好，根據(jù)R值選擇C3。通過多指標(biāo)綜合平衡法分析得出姜黃素納米顆粒制備的最

2.4 姜黃素納米顆粒光穩(wěn)定性試驗(yàn)

姜黃素納米顆粒在自然光照下的穩(wěn)定性結(jié)果見圖5。

圖5 姜黃素納米顆粒在自然光照下的穩(wěn)定性Fig.5 Stability of curcumin nanoparticles under natural light

由圖5可知，總體來看樣品1到樣品9，當(dāng)過了48h后，所有樣品的保留率趨于穩(wěn)定，姜黃素納米顆粒的姜黃素保留率都比未包埋的要大，因此姜黃素納米顆粒包埋的姜黃素光解反應(yīng)比未包埋的要慢。以樣品7最為穩(wěn)定，其在144 h后姜黃素保留率最大（-0.713），姜黃素光解反應(yīng)最慢。這與許雪兒等[22]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

在姜黃素溶液中加入0.3 g/L的鋅離子有助于姜黃素溶液的光穩(wěn)定性；姜黃素納米顆粒最優(yōu)制備工藝：水相與醇相體積比3∶1，壁材比（阿拉伯膠：玉米醇溶蛋白）為 8∶10（質(zhì)量比），芯壁比（姜黃素∶玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠）7∶100（質(zhì)量比），在此條件下，姜黃素納米顆粒包埋率為95.844%，載藥量為62 mg/g，粒徑為0.940 μm；姜黃素納米顆粒的光解反應(yīng)比未包埋的姜黃素的光解反應(yīng)要慢，姜黃素包埋后提高了對光的穩(wěn)定性。