基于GC-MS及PCA對比15種奶酪的有機酸成分

趙赟，夏亞男，劉皓，雙全

（1.邯鄲職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，河北 邯鄲 056000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

近年來，隨著居民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，發(fā)酵乳制品成為居民消費的熱點，液態(tài)奶、酸奶需求增長，被譽為“奶黃金”的發(fā)酵乳制品——奶酪也受到廣大民眾的青睞。關(guān)于奶酪的記載最早出現(xiàn)在公元前約3 000年，牧人利用變酸的牛奶將乳清與凝乳分離，再對凝乳以瀝干、成型、干燥、包裝等工序進行處理而獲得耐儲且營養(yǎng)的食物[1-2]。目前，因加工工藝、原料及成熟方式存在差異，奶酪已有1 000多種。目前市場上常見的奶酪主要是西式奶酪和再制奶酪。再制奶酪是指將兩種及兩種以上的奶酪加熱混合，并添加乳化劑和香料制成的奶酪[3-4]，賦予奶酪豐富的口感和不同的風(fēng)味。此外，在我國西北地區(qū)居住的蒙古族，最初因長期游牧生活，將牛乳制成各類乳制品，而蒙古族的特色傳統(tǒng)食物——奶豆腐，呈乳白色，形似豆腐，故而取名“奶豆腐”[5-6]。由此可見，奶酪的種類復(fù)雜多樣，不同種類的奶酪呈現(xiàn)不同的風(fēng)味口感。

奶酪獨特的風(fēng)味是其廣受歡迎的原因之一，奶酪的風(fēng)味是由碳水化合物代謝、脂肪降解和蛋白質(zhì)水解生化反應(yīng)生成的[7-9]。查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)，對于奶酪風(fēng)味物質(zhì)的研究，多是針對于西式奶酪風(fēng)味，對奶酪特征風(fēng)味的分析進行系統(tǒng)地總結(jié)，形成完善的研究體系[10-12]。Delgado等[13]通過固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對西班牙軟質(zhì)奶酪的風(fēng)味物質(zhì)進行檢測，其中有機酸含量最多，占總提取香氣的61.5%。Rychlik等[14]基于動態(tài)頂空氣相色譜-質(zhì)譜（dynamic headspace gas chromatography-mass spectrometry，DHGC-MS）、香氣提取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）和氣相色譜-嗅覺測定（gas chromatography-olfactometry，GC-O）的結(jié)果分析瑞士格魯耶爾干酪的主體香氣物質(zhì)及異味組分，研究表明瑞士格魯耶爾奶酪典型風(fēng)味是由丁酸、2-3-甲基丁酸和苯丙酮形成，而樣品表現(xiàn)出的土豆味則由2-乙基-3，5-二甲基吡嗪和2，3-二乙基-5-甲基吡嗪引起。Corr?a Lelles Nogueira等[15]通過對米納斯干酪香氣物質(zhì)的研究表明，揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生與微生物、酶及復(fù)雜的自發(fā)反應(yīng)有關(guān)。

對于內(nèi)蒙古傳統(tǒng)奶豆腐的研究大多是集中在多樣性的微生物菌群中篩選優(yōu)良菌株[16-17]，對奶豆腐質(zhì)量、工藝的控制[18]，有關(guān)奶豆腐風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。徐幸等[19]用偏最小二乘回歸法對乳扇所含的風(fēng)味物質(zhì)與感官相聯(lián)系，試驗表明乳扇的奶油味與酮類物質(zhì)有關(guān)；酸腐味是由酸類、酯類物質(zhì)引起的。高鑫[20]通過試驗證明發(fā)酵劑的用量為1.0 g/L原料乳時，硬質(zhì)蒙古干酪風(fēng)味濃郁，品質(zhì)優(yōu)良。蘇燕玲[21]通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）、GC-O和電子鼻檢測，對不同種酶改性干酪的風(fēng)味物質(zhì)進行研究，試驗表明酸類物質(zhì)占比較大。由此可見，酸類物質(zhì)是奶酪風(fēng)味的重要組成部分。

不同的制作工藝對奶豆腐的風(fēng)味都會產(chǎn)生影響，因此如何對奶豆腐的特征風(fēng)味物質(zhì)進行研究是奶豆腐風(fēng)味提升及產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的問題。酸類物質(zhì)是發(fā)酵乳制品的特征風(fēng)味成分之一，短鏈（C2～C10）揮發(fā)性酸類物質(zhì)對食品的風(fēng)味和質(zhì)量有著顯著的影響。因此本論文基于GC-MS及香氣活力值（odour active values，OAV）旨在研究對比分析15種奶酪的有機酸成分，試圖掌握奶豆腐與西式、再制奶酪有機酸成分的差異，為奶酪的風(fēng)味調(diào)控和品質(zhì)優(yōu)化奠定試驗基礎(chǔ)，并為奶酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5種傳統(tǒng)奶豆腐：C1為內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗純手工制作的傳統(tǒng)奶豆腐；C2為內(nèi)蒙古錫林郭勒盟牧鄉(xiāng)源食品有限公司傳統(tǒng)奶豆腐；C3為內(nèi)蒙古錫林郭勒盟宏福源食品有限公司傳統(tǒng)奶豆腐（脫脂）；C4為內(nèi)蒙古錫林郭勒盟牧鄉(xiāng)源食品有限公司傳統(tǒng)奶豆腐（加糖）；C5為內(nèi)蒙古錫林郭勒盟宏福源食品有限公司傳統(tǒng)奶豆腐。其中C1、C2、C5為內(nèi)蒙古錫林郭勒盟不同廠家純手工制作的傳統(tǒng)奶豆腐；C3奶豆腐加工中除去了部分脂肪；C4是一種手工制作的加糖傳統(tǒng)奶豆腐。

5種再制奶酪：Z1為安拉愛氏晨曦原味再制干酪條，是表面光滑無黏性的奶酪條，產(chǎn)地丹麥；Z2為凱瑞涂抹型原味奶酪，是表面光滑的塊狀奶酪，奶香味濃郁，產(chǎn)地法國；Z3為樂芝牛芝士小食（原味），是稍有黏性的塊狀奶酪，產(chǎn)地法國；Z4為皇家伊萊高達(dá)涂抹奶酪，是黏稠的膏狀奶酪，產(chǎn)地荷蘭；Z5為皇家伊萊成長涂抹奶酪，是黏稠的膏狀奶酪，產(chǎn)地荷蘭。

5種西式奶酪：X1為鄉(xiāng)村奶酪，是未成熟奶酪，添加稀奶油，產(chǎn)地哥本哈根；X2為法式希小金文奶酪，是霉菌成熟干酪，味道稍淡，產(chǎn)地法國；X3為法式希小布里奶酪，是霉菌成熟干酪，味道適中，產(chǎn)地法國；X4為法式希布里布蘭奶酪，是霉菌成熟干酪，味道濃郁，產(chǎn)地法國；X5為牧森西班牙風(fēng)味奶油奶酪，是成熟干酪，添加奶油，產(chǎn)地西班牙。

乙醚（分析純）：東莞市喬科化學(xué)有限公司；無水硫酸鈉（分析純）：廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司；有機膜（0-22 μm）：上海析域儀器設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKAA11basic粉碎機：德國IKA艾卡公司；Eppendorf Centrifuge5430R離心機：德國Eppendorf公司；Organomation OA-HEAT氮吹儀：南京銘奧儀器設(shè)備有限公司；MV02-ZX3渦旋儀、Thermo TRACE 1300-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 液相萃取法

取適量奶酪樣品，切成2 cm×2 cm×2 cm的塊狀，用粉碎機研磨為粉狀。稱取10 g處理后的樣品，加入200 μL 3-辛醇、4 g氯化鈉后進行渦旋，再加入10 mL乙醚渦旋、5 500 r/min離心5 min，取上層有機相；下層再加5 mL乙醚渦旋，5 500 r/min離心5 min，合并上層有機相，使用氮吹儀吹至1滴，用乙醚復(fù)溶至2 mL，加3 g無水硫酸鈉脫水，最后用0.22 μm有機膜過濾于進樣瓶內(nèi)，進行GC-MS檢測。

1.3.2 GC-MS條件

氦氣作載氣，流速1 mL/min，進樣量1 μL，樣品通過 DB-Wax毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序：起始柱溫40℃，保持5 min，以3℃/min升到200℃，保持5 min，最后2℃/min升到230℃，保持10 min；進樣口溫度250℃，無分流進樣。

電子電離（electron ionization）源，電離能 70 eV，離子源溫度為230℃，接口溫度250℃，四極桿溫度150℃，檢測器溫度為280℃，掃描模式為全掃描，質(zhì)量范圍為20 amu～350 amu。

1.3.3 定量方法

采用內(nèi)標(biāo)法定量，對15種奶酪中有機酸成分進行定量分析。定量公式如下。

Ci=Ai/As×fi′×Cs

式中：Ci為 i物質(zhì)的濃度，μg/mL；Cs為內(nèi)標(biāo)物的濃度，μg/mL；Ai為 i物質(zhì)的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；fi′為相對校正因子。

1.4 統(tǒng)計分析方法

采用IBM SPSS Statistics 24軟件方差分析（analysis of variance，ANOVA） 進行顯著性分析，P＜0.05 認(rèn)為存在顯著性差異；并采用SIMCA-P進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)奶豆腐有機酸成分分析

對不同制作工藝的傳統(tǒng)奶豆腐中雙碳酸含量進行分析，結(jié)果見圖1。

圖1 5種傳統(tǒng)奶豆腐有機酸含量比較Fig.1 Comparison of the acids contents in five kinds of traditional milk curd

結(jié)果表明，C1是純手工制作，成熟時間較短，導(dǎo)致香氣形成不足，雙碳酸含量普遍偏低，其中乙酸含量最高，其余雙碳酸均顯著低于其他樣品（P＜0.05）。C2樣品雙碳酸含量均較高，乙酸、十二酸、十四酸、十六酸均處于最高含量，僅己酸和癸酸低于C4樣品。在C3的制作過程中會除去部分脂肪，由脂肪分解產(chǎn)生的有機酸減少，導(dǎo)致除十六酸外，其余雙碳酸含量較C2均有所下降；C4因糖含量較高，碳水化合物代謝產(chǎn)生大量有機酸，尤其癸酸含量顯著高于其他樣品（P＜0.05）；C5是工廠制作的傳統(tǒng)奶豆腐，較C1成熟時間長，除乙酸外，其余雙碳酸含量稍高于C1樣品（P＜0.05）。

5種奶豆腐中奇數(shù)碳酸只檢測出庚酸和壬酸兩種，且含量均較低，C1成熟期短，C3除去部分脂肪，導(dǎo)致兩種奶豆腐奇數(shù)碳酸較少，均只檢測到庚酸且含量無顯著性差異（P＞0.05）。C4樣品壬酸顯著高于其他奇數(shù)碳酸（P＜0.05）。C5樣品奇數(shù)碳酸含量較低，表明加糖處理促進碳水化合物代謝，有利于奇數(shù)碳酸的形成；而成熟過程會促進一部分奇數(shù)碳酸進一步轉(zhuǎn)化成酯類，引起酸類物質(zhì)含量的下降。5種傳統(tǒng)奶豆腐中不飽和酸成分存在一定差異，除反-13-十八碳烯酸外，其余不飽和酸均具有明顯差異，其中9-癸烯酸尤為顯著。C1成熟期短，只有9-癸烯酸、9-十八碳烯酸兩種不飽和酸，且顯著低于其他樣品（P＜0.05）；C2樣品中順-十八碳烯酸、反-13-十八碳烯酸處于最高水平，但未檢測到9-十八碳烯酸，E-9-十四碳烯酸、Z-11-十四烯酸為C2特有的不飽和酸；C3并未因除去部分脂肪而降低不飽和酸成分，反而是5種樣品中不飽和酸成分最豐富的奶酪品種，除圖1顯示的不飽和酸外還包括順-13-十八碳烯酸、順-9-二十碳烯酸。C4所含不飽和酸種類最少，只有9-癸烯酸、反-13-十八碳烯酸。C5比C1成熟期長，除不含順-十八碳烯酸外，其余不飽和酸含量都顯著高于C1樣品（P＜0.05）。另外，C3還檢測到8-壬炔酸。

綜合以上分析，傳統(tǒng)奶豆腐中雙碳酸種類及含量較其他類酸多，主體有機酸包括乙酸、己酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、壬酸、9-癸烯酸。傳統(tǒng)奶豆腐成熟期長，提高糖含量，其有機酸種類及含量都會提高。反之，制作過程中除去部分脂肪及較短的成熟期都會降低有機酸的種類和含量。

2.2 西式奶酪中有機酸成分分析

對5種西式奶酪中雙碳酸成分進行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 5種西式奶酪有機酸含量比較Fig.2 Comparison of the acids contents in five kinds of western cheese

結(jié)果表明，X1、X5樣品制作過程中添加高脂肪物質(zhì)，增加脂肪分解，比其他樣品產(chǎn)生更多的雙碳酸，如己酸、辛酸、癸酸（P＜0.05）；X2、X3、X4 均為霉菌成熟干酪，味道依次加重，雙碳酸含量也依次增多，但無顯著差異（P＞0.05）；X5為成熟干酪并在制作過程加入奶油，除辛酸、癸酸外其余雙碳酸含量均高于其他樣品，表明額外添加輔料奶油會顯著增加奶酪中雙碳酸的含量。除此之外，試驗還檢測到少量的十八酸、乙酸、丁酸，未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律。

5種樣品共有的奇數(shù)碳酸為壬酸。X1由于制造過程中加入奶酪，壬酸含量顯著高于X2、X3、X4、X5樣品（P＜0.05）；X2、X3、X4 均為霉菌成熟奶酪，三者中壬酸含量無顯著性差異（P＞0.05），均處于較低水平，與傳統(tǒng)奶豆腐結(jié)果相似，驗證了成熟過程會促進一部分奇數(shù)碳酸進一步轉(zhuǎn)化成酯類，引起酸類物質(zhì)含量的下降；X5不僅經(jīng)過成熟而且在制作過程中加入奶油，其奇數(shù)碳酸種類多且含量高，除壬酸外還檢測到十一酸、十三酸、十五酸等物質(zhì)。

對5種不同制作工藝的西式奶酪中不飽和酸成分進行分析，結(jié)果表明，5種奶酪樣品共有的不飽和酸為9-癸烯酸和反-13-十八碳烯酸。整體上看，X1、X5樣品不飽和酸種類較其他樣品豐富。X5比X1增加成熟工序，使得9-十六碳烯酸、反-13-十八碳烯酸顯著高于其他樣品（P＜0.05）。此外，X5樣品除圖中不飽和酸外，還檢測出Z-7-十四烯酸、4-己烯酸、順-5-十二碳烯酸、順-13-十八碳烯酸等不飽和酸，表明成熟過程能顯著增加再制奶酪不飽和酸的種類及含量。

綜合以上分析表明，西式奶酪的主體酸包括己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、壬酸、9-癸烯酸。西式奶酪制作過程中加入奶油等高脂肪物質(zhì)，可有效增加有機酸的種類及含量。成熟過程會促進一部分有機酸轉(zhuǎn)化成酯類，增強奶酪風(fēng)味的濃郁性。

2.3 再制奶酪中有機酸成分分析

再制奶酪是由兩種及兩種以上的奶酪經(jīng)高溫融化后混合，并添加乳化劑和香料制成。試驗對5種不同制作工藝的再制奶酪中有機酸成分進行分析，有機酸含量比較見圖3。

圖3 5種再制奶酪有機酸含量比較Fig.3 Comparison of the acids contents in five kinds of remade cheese

與傳統(tǒng)奶豆腐及西式奶酪相比，再制奶酪中雙碳酸成分較多且含量高，其中十六酸和十四酸含量較高，是再制奶酪的主體雙碳酸物質(zhì)。5種不同制作工藝的再制奶酪中雙碳酸含量存在一定差異，Z3、Z4中除十六酸，其余雙碳酸含量均無顯著性差異（P＞0.05）。Z5中除丁酸外，其余雙碳酸均顯著性高于其他樣品（P＜0.05），Z1樣品中雙碳酸含量最低。

對5種制作工藝不同的再制奶酪中奇數(shù)碳酸進行分析，結(jié)果表明，5種產(chǎn)品共有的奇數(shù)碳酸為十五酸，Z2、Z5顯著高于 Z1、Z3、Z4樣品（P＜0.05）。除 Z4中丙酸含量較高外，其余奇數(shù)碳酸含量都較低。此外，Z1中特有的奇數(shù)碳酸為十七酸，Z2中特有的奇數(shù)碳酸為庚酸。再制奶酪不飽和酸分析結(jié)果表明，9-十六碳烯酸含量無顯著性差異（P＞0.05），Z5樣品除順-5-十二碳烯酸外，其余不飽和酸均顯著高于其他樣品（P＜0.05），其中Z1最低。5種再制奶酪中不飽和酸成分復(fù)雜，共有的不飽和酸為9-十六碳烯酸、9-癸烯酸，不同類型產(chǎn)品還有各自獨有的不飽和酸。Z1中特有的不飽和酸為順式-10-十七碳烯酸、Z-7-十四烯酸，含量也較高；Z2中順式-13-十八碳烯酸的含量較高，所含的不飽和酸種類較少；Z3、Z4中特有的不飽和酸分別為順-9-二十碳烯酸、9-十八碳烯酸。再制奶酪中主體酸包括苯甲酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、十八酸、十五酸、9-癸烯酸、9-十六碳烯酸。

2.4 不同制作工藝對奶酪有機酸的影響

傳統(tǒng)奶豆腐與西式奶酪、再制奶酪中有機酸成分比較見圖4。

圖4 傳統(tǒng)奶豆腐與西式奶酪、再制奶酪中有機酸成分比較Fig.4 Comparison of acid components among traditional milk curd and western and remade cheese

通過GC-MS對15種奶酪的主要有機酸成分進行分析，發(fā)現(xiàn)三類奶酪都含有己酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、9-癸烯酸，其中雙碳酸較多。傳統(tǒng)奶豆腐特有的有機酸為乙酸，再制奶酪特有的有機酸為苯甲酸、丁酸，西式奶酪中不飽和酸較少。

傳統(tǒng)奶豆腐因在制作過程中未經(jīng)過成熟的工序且原料除牛乳外幾乎不添加其他成分，其主體酸種類及含量均偏低；西式奶酪大部分為霉菌成熟干酪，且在制作過程中加入如奶油等高脂肪物質(zhì)，使西式奶酪有機酸的含量較高，風(fēng)味較濃；再制奶酪是將多種成品奶酪進行再加工，添加黃油、乳清粉、乳蛋白等物質(zhì)，提高脂肪分解、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的有機酸，使成品口感豐富。

15種奶酪有機酸的主成分分析及異常值驗證見圖5。

圖5 15種奶酪有機酸的主成分分析及異常值驗證Fig.5 Principal component analysis and verification results of acids in fifteen kinds of cheese

由圖5（A）可知，第一、二主成分貢獻率分別為47.7%、34%，總貢獻率81.7%，表明主成分分析可說明樣本整體情況。由主成分分析結(jié)果可知，傳統(tǒng)奶酪（C）、再制奶酪（Z）兩組樣本分別出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，西式奶酪組（X）中X2、X3和X4樣品酸類物質(zhì)與傳統(tǒng)奶酪組較接近，X1和X5樣本有機酸與另外兩組奶酪區(qū)別較大。不同廠家西式奶酪制作工藝差異使產(chǎn)品有機酸成分出現(xiàn)明顯差別，使得組間差異較明顯。由此可見，主成分分析可用于區(qū)分傳統(tǒng)奶酪及再制奶酪，對不同工藝西式奶酪的區(qū)分并不理想。結(jié)合載荷圖[圖5（B）]可知，再制奶酪樣本的9-十六碳酸、苯甲酸、十八酸、十五酸含量較突出，傳統(tǒng)奶酪組及西式奶酪（X2、X3、X4）的乙酸含量較突出，而西式奶酪X1和X5樣本的癸酸和9-癸烯酸含量較突出。經(jīng)Hotelling驗證，奶酪有機酸數(shù)據(jù)均處于 99%置信區(qū)間[圖 5（C）]，DModx圖[圖 5（D）]中數(shù)值均未超過 2.4，表明 PCA分析數(shù)據(jù)并未出現(xiàn)異常值，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。15種奶酪有機酸的偏最小二乘回歸分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）見圖 6。

圖6 15種奶酪有機酸的PLS-DA分析Fig.6 PLS-DA analysis of acids in fifteen kinds of cheese

PLS-DA分析結(jié)果與主成分分析相似，對傳統(tǒng)奶酪及再制奶酪有較好的區(qū)分效果，但對不同工藝西式奶酪的區(qū)分不理想。PLS-DA分析經(jīng)Permutation計算200次驗證，分析結(jié)果可靠。

奶酪的風(fēng)味與蛋白質(zhì)，脂肪、碳水化合物的含量有極大的關(guān)系，且含量越高，奶酪風(fēng)味越濃郁，如經(jīng)過霉菌成熟，由于霉菌的分解，會產(chǎn)生更多的有機酸成分，確保奶酪的口味與質(zhì)量。因此，傳統(tǒng)奶豆腐可通過添加糖、脂肪、乳蛋白從而提高奶豆腐的風(fēng)味，進行工藝優(yōu)化。但由于本試驗選取的樣品種類多樣化，成熟時間、產(chǎn)地及菌種不同，對試驗結(jié)果的可比性造成一定影響，因此后續(xù)試驗在樣品選擇時盡量選擇相同成熟時間或相同菌種發(fā)酵的奶酪，避免其他因素對試驗結(jié)果造成影響。

3 結(jié)論

通過GC-MS對15種奶酪的有機酸成分進行分析得出，傳統(tǒng)奶豆腐中主要有機酸包括乙酸、己酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、壬酸、9-癸烯酸；西式奶酪中主要有機酸包括己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、壬酸、9-癸烯酸。再制奶酪中主要有機酸包括苯甲酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、十八酸、十五酸、9-癸烯酸、9-十六碳烯酸。三類奶酪都含有己酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、9-癸烯酸，其中雙碳酸較多。主成分分析可用于區(qū)分傳統(tǒng)奶豆腐及再制奶酪，對不同工藝西式奶酪的區(qū)分不理想。同時發(fā)現(xiàn)通過在奶酪制作過程中提高糖含量和添加高脂肪物質(zhì)，可提高奶酪中有機酸含量，經(jīng)霉菌成熟后，由于霉菌的作用使奶酪獲得獨特的風(fēng)味與口感。再制奶酪由于是對成品奶酪進行再加工并添加黃油、乳蛋白等物質(zhì)，使其有機酸成分更為豐富，成品味道濃郁。