β-胡蘿卜素微膠囊制備及理化特性分析

周銳麗，秦云云，隨楊，潘思軼

（1.陸軍勤務(wù)學(xué)院訓(xùn)練基地，湖北 武漢 430000；2.山西省晉城市古書院礦醫(yī)院，山西 晉城 048000；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430000）

β-胡蘿卜素作為主要的食品天然色素，廣泛存在于自然界中。但是其水溶性差和不穩(wěn)定性嚴(yán)重限制了其應(yīng)用，這也使得β-胡蘿卜素在生產(chǎn)加工和應(yīng)用中存在著很大局限[1]。為了解決這個難題，許多學(xué)者嘗試運用了多種方法，其中最有效的方法就是利用微膠囊技術(shù)將其包埋，從而提高其穩(wěn)定性和水溶性。

微膠囊技術(shù)是新興的保護芯材技術(shù)，選擇最合適的包壁材料在微膠囊技術(shù)中是一個至關(guān)重要的問題，并且決定著微膠囊產(chǎn)品的理化性質(zhì)。從其來源分類，可選的壁材主要有天然的、半合成的以及合成的高分子材料[2]。

鑒于β-胡蘿卜素的水溶性差和不穩(wěn)定性的特點，國內(nèi)外許多專家學(xué)者對β-胡蘿卜素的微膠囊化進行了廣泛深入的研究，Desobry[3]使用麥芽糊精作為壁材，對β-胡蘿卜素進行包埋，并且測定其在噴霧干燥、滾筒干燥和冷凍干燥條件下的保存效果，并且研究其在不同濕度和貯藏溫度下的穩(wěn)定性，得到的主要結(jié)論是滾筒干燥的方法是最好的；胡富強等[4]使用明膠、阿拉伯膠作為壁材，采用復(fù)凝聚法制備β-胡蘿卜素微膠囊。以光照試驗考察了β-胡蘿卜素微膠囊的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在室溫貯藏條件下，光照對β-胡蘿卜素穩(wěn)定性有較大影響[1]，將β-胡蘿卜素包埋之后，微膠囊可以保護里面的β-胡蘿卜素不被氧化變質(zhì)，可增加其穩(wěn)定性；Wagner[5]研究不同取代度的淀粉水解產(chǎn)物對噴霧干燥后的β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高取代度（36.5）的淀粉比其他 3 種低取代度（4、15、25）的淀粉對β-胡蘿卜素有更好的保留效果。果膠是一種具有黏膠性的多糖，在食品和醫(yī)藥生產(chǎn)中都有廣泛的利用，為此，在研究了不同壁材及配比對β-胡蘿卜素包埋的影響后，選擇了乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）單獨進行包埋和乳清分離蛋白果膠混合物包埋兩種制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-胡蘿卜素晶體粉末（96%）、乳清分離蛋白：景竹生物科技有限公司；中鏈甘油三酯、果膠：上海源葉生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、丙酮、石油醚、氯仿、環(huán)己烷（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

離心機（TDL-5-A）：上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平（EL204-IC）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；pH計（PHS-25）：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；水浴恒溫振蕩器（DSHZ-300A）：蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；磁力攪拌器（85-2）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；均質(zhì)器（PT MR 2100）：瑞士 Kinewmatica公司；激光顆粒度分布儀（APA2000）、Zeta電位儀（Zetasizer Nano）：英國馬爾文儀器有限公司；真空冷凍干燥機（ALPHA1-4LD）：德國M.CHRIST；高壓微射流納米均質(zhì)機（M-110L）：美國安捷倫公司；掃描電鏡（JSM-6390LV）：日本NTC公司；透射電鏡（H-7650）：日本 HITACHI公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nexus 470）：美國Nicolet公司。

1.2 方法

1.2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.2.1.1 β-胡蘿卜素測定波長的選擇

采用洪清等[6]的方法：準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素晶體粉末0.002 5 g于100 mL棕色容量瓶中，加入少量氯仿溶解后，用環(huán)己烷定容至100 mL。取10 mL溶液于另一個100 mL棕色容量瓶中，用環(huán)己烷定容至100 mL，配制成2.5μg/mL的溶液，以環(huán)己烷為空白，在400 nm～500 nm波長下掃描檢測β-胡蘿卜素的吸收光譜，確定最大吸收峰的波長。

1.2.1.2 β-胡蘿卜素含量的測定

參照韓寧[7]的方法，用分光光度法制作β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素晶體粉末0.025 0 g（純度96%）于50 mL棕色容量瓶中，先加入1 mL氯仿溶解，用丙酮∶石油醚（1∶1，體積比）混合有機劑定容至50 mL；再將此溶液稀釋10倍，分別準(zhǔn)確取0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL 于 25 mL 棕色容量瓶中，定容至25 mL；以丙酮∶石油醚（1∶1，體積比）混合有機溶劑為空白對照，分別在最大吸收波長455nm處測定OD455nm，繪制β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 β-胡蘿卜素微膠囊的制備

參考崔健等[8]的方法，做適當(dāng)改變后如下：將0.2%果膠溶解于50 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中，4℃冷藏備用；將1%乳清分離蛋白溶于50 mmol/L磷酸緩沖液中（pH7.0），25℃下磁力攪拌至完全溶解，制備成水相；將β-胡蘿卜素溶于0.2%中鏈甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT），磁力攪拌至完全溶解，制備成油相；將油相與水相按質(zhì)量比1∶9混合，利用均質(zhì)器于19 000 r/min下高速剪切2 min；向初級乳狀液中分別加入磷酸緩沖液（pH7.0）和果膠溶液，初乳占總體積一半；將混合溶液磁力攪拌30 min，再用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)混合液的pH值至3.0，得到二級乳狀液；將二級乳狀液在0.076 MPa下高壓微射流均質(zhì)3次；將乳狀液冷凍干燥后得到兩種β-胡蘿卜素微膠囊粉末。

1.2.3 β-胡蘿卜素包埋率的測定

參照許波[9]的方法，略作調(diào)整后，進行β-胡蘿卜素微膠囊包埋率的測定。準(zhǔn)確稱取0.1 g β-胡蘿卜素微膠囊樣品于25 mL離心管中，加入10 mL丙酮∶石油醚（1∶1，體積比）混合有機溶劑，劇烈振蕩 2 min；然后高速離心 5 min（4℃，轉(zhuǎn)速 6 000 r/min）；吸取 5 mL上清液于 50 mL棕色容量瓶中，用丙酮∶石油醚（1∶1，體積比）混合有機劑定容至 50 mL；以丙酮∶石油醚（1∶1，體積比）為空白對照，455 nm處測定吸光值。參照β-胡蘿卜素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得微膠囊表面β-胡蘿卜素含量。包埋率按以下公式計算。

1.2.4 Zeta電位儀測定電位和粒徑

為了降低多重光散射效應(yīng)，在測定前用蒸餾水將β-胡蘿卜素微膠囊乳狀液稀釋100倍[10]。用Zeta電位儀分別測定WPI單獨包埋和WPI果膠混合物包埋的β-胡蘿卜素微膠囊的平均粒子直徑（25℃），并分別測定乳清分離蛋白和果膠的Zeta電位。

1.2.5 紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜，比較物質(zhì)在紅外光區(qū)對光的吸收，分析β-胡蘿卜素包埋前后在微膠囊中的形態(tài)和壁材間的相互作用，以判斷包埋物是否形成。如果形成了包埋物，分子間的非共價鍵作用，如疏水作用、范德華力和氫鍵，其鍵能會降低，相應(yīng)基團的吸收強度會減弱，由此來判斷壁材的包埋作用[10]。

樣品在檢測前要在紅外光下烘干至少1 h，取少量烘干后的樣品和干燥的溴化鉀粉末一起研磨，直至無晶體存在，然后壓制成均勻無裂縫的薄片。

1.2.6 用透射電鏡觀察

將β-胡蘿卜素微膠囊乳液稀釋至微透明狀，撈片晾干，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察兩種不同β-胡蘿卜素微膠囊的形態(tài)，比較差異，同時驗證用光散射粒徑分析的粒徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 β-胡蘿卜素最大吸收波長

β-胡蘿卜素晶體粉末光譜掃描圖見圖1所示。

圖1 β-胡蘿卜素晶體粉末光譜掃描圖Fig.1 Spectral scanning of carotene crystal powder

如圖1所示，光譜掃描β-胡蘿卜素晶體粉末粉（純度96%）在455 nm處有最大吸收波長，故選擇OD455nm作為β-胡蘿卜素的吸光值。

2.1.2 β-胡蘿卜素含量測定

β-胡蘿卜素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖2所示。

圖2 β-胡蘿卜素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of carotene content

如圖 2所示，濃度在 1 μg/mL～3 μg/mL 范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素晶體粉末吸光度值與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝0.204x+0.009。

2.2 β-胡蘿卜素微膠囊的包埋率

兩種微膠囊表面β-胡蘿卜素含量見表1。

表1 兩種微膠囊表面β-胡蘿卜素含量Table 1 Carotene content on the surface of two kinds of microcapsules

由包埋率公式計算得乳清分離蛋白（WPI）、乳清分離蛋白果膠（WPI加果膠）混合物作為壁材的包埋率分別為85.6%和88.2%。說明乳清分離蛋白果膠混合物的雙重壁材，可以提高β-胡蘿卜素微膠囊的包埋率。

2.3 Zeta電位和粒徑

乳清分離蛋白和果膠的電位值見表2。

表2 乳清分離蛋白和果膠的電位值Table 2 Potential values of whey isolate protein and pectin

如表2所示，乳清分離蛋白帶正電荷，果膠帶負電荷，說明兩者之間能形成靜電吸引，為兩者能形成微膠囊壁材且能增加微膠囊穩(wěn)定性提供了理論基礎(chǔ)。表3所示為WPI包埋的β-胡蘿卜素微膠囊、WPI和果膠包埋的β-胡蘿卜素微膠囊的平均粒徑測定值。

表3 WPI包埋的微膠囊、WPI和果膠包埋的微膠囊的粒徑Table 3 Particle sizes of whey protein isolate embedded microcapsules whey protein isolate and pectin embedded microcapsules

從表3可以看出，選擇用WPI和果膠混合包埋的β-胡蘿卜素微膠囊的粒徑更小，并且對于WPI包埋的β-胡蘿卜素微膠囊而言，其平行性較好，因此可以認為對于大小和平行性，混合包埋的效果更好。

2.4 紅外光譜

β-胡蘿卜素晶體粉末、WPI包埋的微膠囊、WPI和果膠包埋的微膠囊的紅外光譜圖見圖3所示。

圖3 β-胡蘿卜素晶體粉末、WPI包埋的微膠囊、WPI和果膠包埋的微膠囊的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of β-carotene crystal powder，WPI encapsulated microcapsules,WPI and pectin encapsulated microcapsules

如圖3所示，a為β-胡蘿卜素晶體粉末紅外光譜圖，圖中有幾處強度較大的吸收峰：2 925.53 cm-1處是-CH3的伸縮振動引起的，1720.221cm-1和1631.51cm-1處的吸收峰為-C=C-伸縮振動；1 631.51 cm-1和1454.08cm-1則是苯環(huán)骨架C=C的伸縮振動；1454.08cm-1和1384.66cm-1則是由于甲基面內(nèi)彎曲振動；966.18cm-1處吸收峰為反式碳碳雙鍵面外搖擺振動。而在b和c中，這些官能團的吸收均減弱，說明乳清分離蛋白和果膠對β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，即形成了包埋物。同時，WPI果膠混合物包埋的微膠囊在官能團處的吸收峰減少幅度更大，說明混合物包埋的程度更高，效果更好，能更多包埋活潑基團來提高穩(wěn)定性。

2.5 透射電鏡觀察的結(jié)果

WPI包埋的β-胡蘿卜素微膠囊在透射電鏡下的形態(tài)圖見圖4所示，WPI和果膠包埋的β-胡蘿卜素微膠囊在透射電鏡下的形態(tài)圖見圖5所示。

圖4 WPI包埋的β-胡蘿卜素微膠囊在透射電鏡下的形態(tài)Fig.4 Morphology of WPI encapsulated β-carotene microcapsules under transmission electron microscope

圖5 WPI和果膠包埋的β-胡蘿卜素微膠囊在透射電鏡下的形態(tài)Fig.5 Morphology of WPI and pectin encapsulated β-carotene microcapsules under transmission electron microscope

從圖4、圖5中可以看到，無論是乳清分離蛋白還是乳清分離蛋白果膠混合物，都形成了包埋物，但是單一包埋的比較混雜，有些β-胡蘿卜素還游離在外或夾雜在微膠囊之間，但是混合物包埋得到的微膠囊分布較均一，顆粒大小較穩(wěn)定。

3 討論與結(jié)論

本試驗通過攪拌、高速剪切、高壓微射流納米均質(zhì)和冷凍干燥，用乳清分離蛋白、乳清分離蛋白果膠混合物分別包埋β-胡蘿卜素形成納米級微膠囊，通過對兩種微膠囊粒徑的測量以及包埋率的比較，可以看出混合物包埋優(yōu)于單一的乳清分離蛋白的包埋效果。并且混合物包埋的平行性較好，可以認為相對一段時間內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

從紅外光譜圖分析的結(jié)果可以看出，官能團的變化證明了β-胡蘿卜素包埋在微膠囊里面，不同材料的β-胡蘿卜素微膠囊都有相應(yīng)的振動覆蓋，證明β-胡蘿卜素被包埋在微膠囊里面。

透射電鏡結(jié)果顯示：兩種β-胡蘿卜素微膠囊都為完整的形態(tài)，但是乳清分離蛋白包埋的β-胡蘿卜素微膠囊表面不圓滑，大小不均一，這也證明了之前測定粒徑的時候，平行性不好的原因；但乳清分離蛋白和果膠混合物包埋的β-胡蘿卜素微膠囊顆粒大小更為均勻，并且可以看到其表面更光滑，同時驗證了粒徑測定時，其平行性較好的原因。