超聲波輔助酶法提取紫薯花青素及抗氧化性研究

張瑩麗，鄧瑞瑞，李偉民

（許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院，河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000）

紫薯又稱為紫甘薯、黑紅薯等，富含硒元素和花青素[1-2]，紫薯花青素是一類天然食用色素，是從紫薯中提取的花色苷類物質(zhì)[3-4]，紫薯中含有的花青素比茄子、櫻桃等植物中所含的量要高[5-6]。紫薯花青素色澤艷麗，可用作著色劑；安全無毒，具備營養(yǎng)、藥理保健功效，也是一種天然的抗氧化劑[7]，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)有著巨大的發(fā)展?jié)摿8]?；ㄇ嗨氐奶崛》椒ㄖ饕腥軇┨崛》╗9]、超聲波輔助提取法[10]、微波輔助提取法[11]、酶解法[12]、超臨界流體萃取法等[13]，單一的提取方法往往會存在一些不足，實(shí)際應(yīng)用中常采用兩種或兩種以上的方法來提取，從而來提高花青素的提取率[14]。酶能專一性的分解大分子物質(zhì)，超聲波可以破壞植物細(xì)胞壁，使其有效成分更易提取[8，13]。張慢等[13]對超聲波輔助酶法提取紫薯花青素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明提取效果比傳統(tǒng)方法有較大提高。徐穎等[8]研究證明超聲波輔助纖維素酶法能大大提高紫薯花青素的得率。本研究是在超聲波輔助的條件下，對雙酶法提取紫薯花青素的最佳工藝及紫薯花青素的抗氧化性進(jìn)行研究，為紫薯花青素的提取提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：市售，干燥粉碎后過60目篩。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、α-淀粉酶（≥30 U/mg）、纖維素酶（≥10 000 U/g）：合肥博美生物科技有限公司；硫酸鐵銨、檸檬酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；SYU-10-200DT超聲波清洗機(jī)：鄭州生元儀器有限公司；101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；JY052真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用甲醇溶液將5 mg花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶解定容到10 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)液，濃度0.5 mg/mL。再將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋定容，制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，然后將各濃度使用液分別移取1.0 mL與9.0 mL反應(yīng)液[反應(yīng)液為正丁醇∶濃鹽酸∶10%硫酸鐵銨=83∶6∶1（體積比）]在10 mL具塞試管內(nèi)混勻，沸水浴40 min后冷卻，恢復(fù)室溫（25℃）后，以試劑空白調(diào)零，在波長520nm處測吸光值[13]。

1.3.2 紫薯花青素得率的計(jì)算

準(zhǔn)確吸取1.0 mL定容后的紫薯浸提液于試管內(nèi)，后續(xù)操作方法同1.3.1測定吸光值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由得率公式計(jì)算出紫薯花青素的得率[15]。

紫薯花青素得率/（mg/g）=c×v/m

式中：c為紫薯花青素的濃度，mg/mL；v為稀釋后的花青素溶液總體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 酶配比對紫薯花青素得率的影響

稱量 5 份紫薯粉，分別加入質(zhì)量比為 0∶0、0∶6、6∶0、3∶3、2∶4、4∶2 的纖維素酶和 α-淀粉酶，酶總量為 6 mg/g，以料液比1∶20（g/mL）加入3.5%檸檬酸溶液，50℃下超聲20 min，其余操作步驟同1.3.1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由得率公式計(jì)算出不同酶配比提取的花青素得率，以此確定最佳酶配比。

1.3.3.2 料液比對紫薯花青素得率的影響

稱量5份紫薯粉，各加入6 mg/g質(zhì)量比為1∶1的纖維素酶和α-淀粉酶，再分別以不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入 3.5%檸檬酸溶液，50℃下超聲提取20 min，冷卻后操作方法同1.3.1，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由得率公式計(jì)算出不同料液比下花青素的得率，以確定最佳料液比[16]。

1.3.3.3 酶用量對紫薯花青素得率的影響

分別以酶用量 3、4、5、6、7 mg/g 加入質(zhì)量比為 1∶1的纖維素酶與 α-淀粉酶，以料液比 1∶20（g/mL）加入3.5%檸檬酸溶液，50℃下超聲20 min，其余操作步驟同1.3.1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由得率公式計(jì)算出不同酶用量提取的花青素得率，以此確定最佳酶用量。

1.3.3.4 超聲提取時間對紫薯花青素得率的影響

固定加入的酶量為6 mg/g，料液比為1∶20（g/mL），50 ℃超聲溫度下分別提取 20、25、30、35、40 min，后續(xù)操作同1.3.1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由得率公式計(jì)算出不同超聲時間下提取的花青素得率，從而確定最佳超聲提取時間。

1.3.3.5 溫度對紫薯花青素得率的影響

固定加入的酶量為 6 mg/g，料液比 1∶20（g/mL），分別在 40、45、50、55、60℃的不同超聲溫度下提取 20min，后續(xù)操作同1.3.1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由得率公式計(jì)算出不同溫度下提取的花青素得率，從而確定最佳提取溫度。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)前提下，選用料液比、酶用量、超聲時間和提取溫度4個因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，從而來確定紫薯花青素提取工藝的最佳參數(shù)。

正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 因素水平Table 1 Factor level

1.3.5 紫薯花青素的抗氧化活性試驗(yàn)

紫薯花青素的·OH清除試驗(yàn)[17]：先配制不同濃度梯度的紫薯花青素樣液，再在試管中分別依次加入1 mL 10 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液和各個濃度梯度下的花青素樣液，最后各自加入1 mL 8.8 mmol/LH2O2溶液，37℃水浴下反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為空白對照，測定不同濃度的紫薯花青素樣液和抗壞血酸的吸光值，重復(fù)3次?！H清除率計(jì)算公式如下。

·OH 清除率/%=（A0-A1）/A1× 100

式中：A0為空白吸光值；A1為樣品平均吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 酶配比對紫薯花青素得率的影響

不同配比的纖維素酶與α-淀粉酶對紫薯花青素提取得率的影響見圖1。

圖1 不同的酶比對紫薯花青素得率的影響Fig.1 Effect of different enzyme ratio on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖1可知，兩種酶質(zhì)量比為3∶3時，紫薯花青素的得率明顯高于單一加入纖維素酶或者α-淀粉酶。說明纖維素酶與α-淀粉酶聯(lián)合作用下紫薯花青素的提取效果更顯著。纖維素酶能水解破壞構(gòu)成植物細(xì)胞壁的纖維素成分，釋放細(xì)胞內(nèi)的花青素等有效成分；α-淀粉酶能夠水解紫薯中豐富的淀粉，使得被包裹住的花青素釋放出來，從而達(dá)到分離提取紫薯花青素的目的。兩種酶聯(lián)合作用，能有效降解淀粉，破裂細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞中的目標(biāo)物質(zhì)，使花青素的分離提取效果顯著[18]。

2.1.2 料液比對紫薯花青素得率的影響

不同料液比與花青素得率的關(guān)系見圖2。

圖2 料液比對紫薯花青素得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖 2 可知，花青素的得率從料液比 1∶10（g/mL）～1∶25（g/mL）漸漸升高，1∶25（g/mL）時得率最大，高于 1∶25（g/mL）時得率呈下降趨勢。該結(jié)果可能是由于在1∶25（g/mL）料液比下，提取劑幾乎可以浸提紫薯中溶出的全部花青素；再繼續(xù)增大提取劑的量，花青素含量也不會增多。所以，提取花青素的料液比以1∶25（g/mL）為最佳。

2.1.3 酶用量對紫薯花青素得率的影響

酶用量對紫薯花青素得率的影響見圖3。

圖3 酶用量對紫薯花青素得率的影響Fig.3 Effect of enzyme quantity on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖3可知，酶量從4 mg/g增加到5 mg/g時，紫薯花青素的得率有明顯上升趨勢，酶用量5 mg/g時得率最大；酶用量大于5 mg/g，得率又有所波動。由于底物紫薯粉是定量的，所以與之對應(yīng)的有最適酶用量，能將紫薯粉徹底水解，使最終得到的有效物質(zhì)含量最高。因此，提取花青素的酶添加量以5 mg/g為最佳。

2.1.4 超聲提取時間對紫薯花青素得率的影響

提取時間對紫薯花青素得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對紫薯花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖4可知，提取時間增長，得率隨之逐漸增大，時間為35 min時得率最高，時間超過35 min，得率開始下降。該結(jié)果的產(chǎn)生是因?yàn)槊缸饔糜诘孜铮磻?yīng)需要一定的時間，35 min時酶促反應(yīng)能夠充分進(jìn)行，時間過長則酶促反應(yīng)能力有所降低，以致最終得率有所下降。因此，提取紫薯花青素的超聲時間以35 min為最佳。

2.1.5 提取溫度對紫薯花青素得率的影響

溫度對紫薯花青素提取得率的影響見圖5。

圖5 溫度對紫薯花青素得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of anthocyanin from purple potato

由圖5可知，溫度低于55℃時，得率隨溫度升高而增大，從40℃升高到45℃時，得率顯著增大，55℃時得率最高；溫度高于55℃時，得率有所下降。出現(xiàn)此種結(jié)果的原因是酶活隨溫度升高而增強(qiáng)，從而加快酶促反應(yīng)速率，所以得率逐漸增大，直到溫度升高到該酶促反應(yīng)的最適溫度55℃，此時花青素得率最高，溫度高于55℃，酶可能會失活或變性，而使得率降低。因此，提取紫薯花青素的溫度以55℃為最佳。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2可知，紫薯花青素得率最高水平組合為A3B1C3D2，即料液比 1∶30（g/mL），酶用量 4 mg/g，超聲時間40 min，提取溫度55℃；由極差R值可看出影響紫薯花青素提取的主次因素為A（料液比）＞B（酶用量）＞D（提取溫度）＞C（超聲時間）。根據(jù)k值可知，A3B1C3D3為最優(yōu)組合，其表示的水平條件為：料液比 1∶30（g/mL），酶用量4 mg/g，提取時間40 min，提取溫度60℃，此組合是通過計(jì)算得到的，稱為理論最佳水平組合。試驗(yàn)最優(yōu)水平組合和理論水平組合存在提取溫度上的差異。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

將試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合A3B1C3D2與計(jì)算得到的理論最優(yōu)組合A3B1C3D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得出，A3B1C3D2組合下3次試驗(yàn)得率的平均值為2.202 mg/g；A3B1C3D3組合下的3次試驗(yàn)得率的平均值為2.154 mg/g。由此可確定提取紫薯花青素的最優(yōu)水平組合為 A3B1C3D2，即料液比 1∶30（g/mL），酶用量4 mg/g，提取時間40 min，提取溫度55℃。

2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果分析

紫薯花青素與抗壞血酸抗氧化能力比較見圖6。

圖6 紫薯花青素與抗壞血酸抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of antioxidant capacity between anthocyanin and ascorbic acid

由圖6可知，紫薯花青素具有較好的·OH清除能力，隨花青素濃度的增大清除·OH的能力逐漸增強(qiáng)，濃度增大到5mg/mL時，自由基的清除率將近100%；濃度低于0.5 mg/mL時，花青素與抗壞血酸（VC）抗氧化能力的差別逐漸增大；質(zhì)量濃度增大，即大于0.5mg/mL時，兩者的羥自由基清除能力逐漸接近，逐漸接近100%。章萍萍[14]研究結(jié)果表明，紫薯花青素對·OH的清除率在低濃度時明顯低于VC，但隨著濃度的增加其清除能力隨之增大，當(dāng)濃度達(dá)到8 mg/mL時，對·OH的清除能力和VC相近，達(dá)到90%以上，與本研究結(jié)果一致，說明紫薯花青素與VC對·OH的清除能力存在一定的量效關(guān)系。

3 結(jié)論

本文通過對紫薯花青素提取工藝和紫薯花青素抗氧化能力進(jìn)行研究，得到如下結(jié)論：1）纖維素酶與α-淀粉酶聯(lián)合使用且質(zhì)量比為1∶1時，花青素的提取得率最高。2）通過試驗(yàn)得到紫薯花青素提取的最優(yōu)條件為料液比 1∶30（g/mL）、酶用量 4 mg/g、提取時間40 min、提取溫度55℃。此條件下，紫薯花青素的得率最高。3）由羥自由基清除試驗(yàn)中抗壞血酸與紫薯花青素的抗氧化能力比較可知，低于質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時，花青素與抗壞血酸的自由基清除率差異明顯，當(dāng)濃度大于0.5 mg/mL，兩者的自由基清除率逐漸接近，差異逐漸變小，最終都達(dá)到最高值。