性類固醇激素雌二醇、睪酮對半滑舌鰨雌、雄、偽雄魚生長性能的影響

王佳林，楊英明，楊 倩，王 娜，陳松林

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所/青島海洋科學與技術國家實驗室/海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266071； 2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306； 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071）

自然界中許多魚類存在性別大小異形現(xiàn)象，即雌雄個體的生長速度不同導致的個體大小差異，并且這種現(xiàn)象在魚類性腺開始發(fā)育直至成熟這一階段尤為明顯。例如尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus)、黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus) 等魚類的雄性個體比雌性個體大，而鯉 (Cyprinus carpio)、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)、牙鲆 (Paralichthys olivaceus)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) 等魚類的雌性個體則表現(xiàn)出生長速度快、個體大的特點[1]。

半滑舌鰨屬于鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，俗稱鰨米、鰨目，是一種近海溫水大型底棲魚類，主要分布于我國渤海、黃海沿岸[2]。半滑舌鰨由于味道鮮美、肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富，深受消費者歡迎，市場價值極高，已成為我國海水鲆鰈魚類三大養(yǎng)殖品種之一，其養(yǎng)殖前景非常廣闊[3]。近年來的養(yǎng)殖實踐和研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨雌雄個體在生長速率上存在很大差別，21月齡時，半滑舌鰨雌性個體平均體質(zhì)量約為600 g，而雄性個體平均體質(zhì)量僅為190 g，只達到雌性體質(zhì)量的1/3[4]。值得一提的是，半滑舌鰨在早期生長過程中存在性逆轉情況，即在自然養(yǎng)殖條件下有些遺傳雌性半滑舌鰨在高溫等環(huán)境刺激下會逆轉為生理雄性，即偽雄魚[5]。偽雄魚和雄魚類似，表現(xiàn)出生長緩慢的特點，這一問題嚴重制約了半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，亟需開展半滑舌鰨不同性別間生長差異的分子機制研究。

哺乳動物與模式生物中的研究表明，生長的性別二態(tài)性與動物體內(nèi)的性類固醇激素、生長軸系統(tǒng)(Growth hormone/insulin-like growth factor 1,GH/IGF1) 的相互作用有關[6]。生長激素 (Growth hormone, GH) 是由垂體分泌的重要激素，已證實在動物機體生長、骨骼發(fā)育及調(diào)控代謝方面發(fā)揮關鍵作用[7]，半滑舌鰨中也發(fā)現(xiàn)該基因在雌雄個體間存在顯著的表達二態(tài)性[8]。胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor 1, IGF1) 是受 GH 刺激后在肝臟產(chǎn)生的重要因子，可以促進骨骼和肌肉的生長[9]。細胞因子信號傳導抑制因子3 (Suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3) 參與多種細胞因子和生長因子的負調(diào)控過程，并且內(nèi)源性和外源性雌激素可以增加大鼠體內(nèi)Socs3基因的表達[10-12]。此外，Gabrielsson等[13]發(fā)現(xiàn)使用雌二醇 (17β-estradiol, E2) 處理大鼠 (Rattus norvegicus)，可使大鼠肝臟生長激素受體 (Growth hormone receptor, GHR)mRNA表達水平提高。Domené等[14]則發(fā)現(xiàn)雌二醇處理后家兔 (Oryctolagus cuniculus f. domesticus) 肝臟GHR表達水平降低。此外，在不同的物種中，性類固醇激素會誘導促生長激素釋放激素 (Growth hormone releasing hormone, GHRH) 和生長抑素釋放抑制因子 (Somatotropin release inhibiting factor,SRIF) 釋放模式不同，進而導致了性別特異性生長激素分泌模式的產(chǎn)生[15-16]。

性類固醇激素對魚類的生長性能也具有顯著影響[17]。例如，E2顯著抑制黃顙魚的生長，睪酮(17α-Methyltestosterone, T) 顯著促進雌魚生長，但抑制雄魚生長[18]。在尼羅羅非魚中，E2明顯促進雌魚的生長，但對雄魚的生長無顯著影響，而T則對雌、雄魚的生長均有顯著性影響[19]。通過注射T刺激麥穗魚 (Pseudorasbora parva) 可以使幼魚的生長速度顯著減慢，且對雄魚的抑制作用要強于雌魚，此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，T可以在一定程度上抑制麥穗魚免疫系統(tǒng)的功能[20]。

筆者前期已開展了半滑舌鰨生長-生殖軸重要組織 (腦、垂體、性腺、肝臟) 的轉錄組學研究，發(fā)現(xiàn)類固醇生物合成通路中的24-脫氫膽固醇還原酶 (Delta24-sterol reductase, dhcr24)、7-脫氫膽固醇還原酶 (Delta7-sterol reductase, dhcr7) 等基因在半滑舌鰨雌性肝臟中呈顯著上調(diào)趨勢[21]，暗示膽固醇依賴的性類固醇激素也可能參與半滑舌鰨性別大小異形現(xiàn)象的調(diào)控過程。為探究性類固醇激素對半滑舌鰨生長性能的影響，筆者同時對半滑舌鰨雌魚、雄魚、偽雄魚進行了E2、T激素注射處理實驗，并對其體長、體寬、體質(zhì)量等生長數(shù)據(jù)進行測量，在注射1個月后取生長-生殖軸組織進行熒光定量 PCR (Real-time PCR, RT-PCR) 分析，比較了兩種性類固醇激素對雌、雄、偽雄魚半滑舌鰨生長性能的影響，并選取了半滑舌鰨3個生長相關基因gh1、igf1、socs3進行定量分析，以探究類固醇激素處理半滑舌鰨后對其生長相關基因表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚均采購于山東日照半滑舌鰨良種養(yǎng)殖場，選取16月齡，體質(zhì)健康、無機體損傷的普通半滑舌鰨成魚。整個實驗過程中均使用自然海水養(yǎng)殖，鹽度約為 30，溶氧 5 mg·L?1以上，pH 曝氣后約為8.15，水溫約為12.5 ℃，每日投喂飼料3次。

1.2 實驗方法

1.2.1 半滑舌鰨生理雄魚的遺傳性別鑒定 剪取288條生理雄魚的鰭條，加入 200 μL 50 mmol·L?1NaOH 煮沸 10 min 后，加入 20 μL pH 8.0的 1 mol·L?1Tris-HCL，12 000 r·min?1離心 10 min，獲得 288條生理雄魚的模板DNA。取2 μL上清用于后續(xù)PCR檢測。引物采用劉洋等[22]開發(fā)的半滑舌鰨性別特異標記引物 (cs-sex-F: CCTAAATGATGGATGT AGATTCTGTC,cs-sex-R: GATCCAGAGAAAATAAACC CAGG)。PCR 反應體系為 10×Buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L?1) 4.0 μL，上下游引物 (10 μmol·L?1)各 4.0 μL，rTaqDNA 聚合酶 (5 U·μL?1) 0.5 μL，模板 DNA (50 ng·μL?1) 5.0 μL，ddH2O 33.5 μL，混勻后離心。PCR 擴增程序為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個循環(huán)。采用 2% 瓊脂糖凝膠電泳 (180 V, 15 min) 鑒定遺傳性別，偽雄魚可擴增出 169 bp和 134 bp 2條目的條帶，雄魚只能擴增出1條169 bp的目的條帶[22]。

1.2.2 激素注射處理 分別取半滑舌鰨雌魚、雄魚以及偽雄魚各90尾開展激素處理實驗。共設置9組，包括雌二醇處理雌魚組 (FE)、雌二醇處理雄魚組 (ME)、雌二醇處理偽雄魚組 (PME)、睪酮處理雌魚組 (FT)、睪酮處理雄魚組 (MT)、睪酮處理偽雄魚組 (PMT)、對照雌魚組 (FC)、對照雄魚組(MC)、對照偽雄魚組 (PMT)。每組魚的數(shù)量均為30尾。將E2、T (Solarbio公司) 溶解于無水乙醇后，再以體積比1∶10與玉米油混合，參考羅非魚、虹鱒等雌雄激素注射相關文獻[19,23]，按照m(激素)∶m(體質(zhì)量)為 25 μg ·g?1注射到魚體腹腔中。每7天注射1次，連續(xù)注射3周，每次注射前測量體質(zhì)量、體長等生長數(shù)據(jù)。對照組僅注射體積比為1∶10混合的無水乙醇∶玉米油。

1.2.3 生長性能分析 根據(jù)測量的生長數(shù)據(jù)計算本次實驗不同組別半滑舌鰨的體質(zhì)量絕對生長率(Absolute growth rate W, AGRW, %) 和體長絕對生長率 (Absolute growth rate L, AGRL, %)。計算公式為：

式中W1為初始體質(zhì)量，W2為實驗后體質(zhì)量；L1為初始體長，L2為實驗后體長。

1.2.4 生長相關基因表達量分析 本次實驗利用RT-PCR的方法檢測gh1、igf1、socs3在正常條件下半滑舌鰨生長相關組織中的表達水平和E2、T處理之后生長相關組織中表達模式的變化。以βactin基因作為內(nèi)參，每個樣品設置3個生物學重復，具體RT-PCR引物參照表1。其反應體系則參照 TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書，利用 ABI 7500 Fast Real-time (Applied Biosystems,美國) 程序進行定量分析。釆用 2?ΔΔCt法計算gh1、igf1、socs3基因的相對表達量，所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，P<0.05為差異顯著。

表1 熒光定量PCR分析所用引物Table 1 Primers for real-time PCR

2 結果

2.1 遺傳性別鑒定結果

對288條半滑舌鰨生理雄魚進行遺傳性別鑒定，結果檢測出104條偽雄魚和184條遺傳雄魚，部分鑒定結果見圖1。

圖1 半滑舌鰨偽雄魚鑒定電泳結果 (部分)ZW. 偽雄魚；ZZ. 雄魚；M. DL2000 DNA MarkerFigure 1 Electrophoresis results of pseudo-male identification of C. semilaevis (partial)ZW. Pseudo males; ZZ. Males; M. DL2000 DNA Marker

2.2 類固醇激素注射后生長性能分析

本實驗結果顯示，相比于對照組，E2和T對雌、雄魚和偽雄魚的體質(zhì)量增長均具有顯著抑制作用 (P<0.05)；從體長絕對生長率來看，E2對雌魚和偽雄魚的體長增長有顯著抑制作用 (P<0.05)，對雄魚無顯著抑制作用 (P>0.05)，而T僅對偽雄魚的體長增長有顯著抑制作用 (P<0.05)。體質(zhì)量絕對生長率與體長絕對生長率分別見圖2、圖3，具體生長數(shù)據(jù)見表2。

表2 對照組、E處理組和T處理組生長參數(shù)比較Table 2 Comparison of growth parameters between control group, E treatment group and T treatment group ; n=30

表2 對照組、E處理組和T處理組生長參數(shù)比較Table 2 Comparison of growth parameters between control group, E treatment group and T treatment group ; n=30

注：同一處理組、不同性別魚之間的比較或同一性別魚、不同處理組之間的比較；標有不同字母表示差異顯著 (P<0.05)Note: Comparison between fish of the same treatment group and different sexes or comparison between fish of the same sex and different treatment groups. Different letters indicate significant difference (P<0.05).

體長絕對生長率Absolute growth rate L/%對照組 Control group雌 F734.38±83.84a 775.00±77.47a 48.67±2.56a51.63±2.50a 5.53±0.08c2.73±0.03b雄 M134.39±19.99b 148.93±20.37b 30.26±1.67b 30.38±1.35b 10.82±0.02a 0.41±0.19d偽雄 PM148.90±22.28b 165.24±21.48b 29.60±2.14b 31.33±1.26b 10.97±0.04a 5.84±0.41a E處理組 E treatment group雌 F778.76±94.05a 788.46±73.24a 48.97±2.81a51.56±2.71a 1.25±0.10f 1.96±0.06c雄 M133.75±20.57b 137.52±19.99b 29.80±1.07b 29.95±1.39b 2.82±0.02e 0.52±0.04d偽雄 PM154.83±27.14b 166.73±30.73b 30.18±2.40b 30.41±2.16b 7.69±0.06b 0.75±0.11d T處理組 T treatment group 雌 F721.45±69.85a 750.00±78.54a 48.35±2.07a51.24±2.15a 3.96±0.22d 2.59±0.04b雄 M147.16±14.76b 152.70±19.03b 30.10±1.47b 30.47±1.53b 3.76±0.03d 1.23±0.29c偽雄 PM159.72±26.19b 165.52±24.65b 30.18±1.90b 30.70±2.11b 3.63±0.13d 1.70±0.10c組別Group性別Gender初始體質(zhì)量Initial body mass/g實驗后體質(zhì)量Body mass after treatment/g初始體長Initial body length/cm實驗后體長Body length after treatment/cm體質(zhì)量絕對生長率Absolute growth rate W/%

圖2 性類固醇激素處理后體質(zhì)量絕對生長率對比C. 對照組；E. 雌二醇處理組；T. 睪酮處理組；標有不同字母表示差異顯著 (P<0.05)，下同F(xiàn)igure 2 Comparison of absolute growth rate of body mass after treatment with sex steroid hormonesC. Control group; E. Estradiol treated group; T. Testosterone treated group; different letters indicate significant difference(P<0.05). The same below.

圖3 性類固醇激素處理后體長絕對生長率對比Figure 3 Comparison of absolute growth rate of body length after treatment with sex steroid hormones

2.3 激素處理后對生長相關基因表達量影響

2.3.1 腦組織中gh1 mRNA 表達量變化 經(jīng)過T注射處理之后，與對照組相比，gh1 mRNA在雌、雄、偽雄魚腦中的表達量均顯著降低 (P<0.05)，且三者的表達量無顯著性差異 (P>0.05)。經(jīng)過E2注射處理之后，gh1 mRNA在雌、雄魚腦中的表達量顯著降低 (P<0.05)，且雌、雄魚之間表達量無顯著性差異 (P>0.05)，但在偽雄魚腦中表達量顯著升高 (P<0.05，圖 4)。

圖4 睪酮、雌二醇處理后gh1 mRNA在半滑舌鰨不同性別腦組織中表達量的變化Figure 4 Change of gh1 mRNA expression in brain tissues of different sexes of C. semilaevis after T and E2 treatments

2.3.2 肝臟中igf1 mRNA 表達量變化 經(jīng)過 T 注射處理之后，與對照組相比，igf1 mRNA在雌魚肝臟中的表達量顯著降低 (P<0.05)，在偽雄魚肝臟中表達量顯著升高 (P<0.05)，在雄魚肝臟中的表達量無顯著性差異 (P>0.05)。E2注射處理之后，igf1 mRNA在雌、雄、偽雄魚肝臟中的表達量均顯著降低 (P<0.05)，且三者表達量無顯著性差異 (P>0.05，圖 5)。

圖5 睪酮、雌二醇處理后igf 1 mRNA在半滑舌鰨不同性別肝臟中表達量的變化Figure 5 Change of igf 1 mRNA expression in liver of different sexes of C. semilaevis after T and E2 treatments

2.3.3 肝臟中socs3 mRNA 表達量變化 經(jīng)過T注射處理之后，雌、雄、偽雄魚肝臟中socs3 mRNA的表達量較對照組均顯著上升 (P<0.05)，且雌魚相較于雄、偽雄魚，其表達量有顯著性差異 (P<0.05)，而雄魚和偽雄魚之間的表達量差異不顯著 (P>0.05)。E2處理之后，雄魚與雌魚肝臟中socs3 mRNA的表達量較對照組有顯著上升 (P<0.05)，且二者之間的表達量有顯著性差異 (P<0.05)。而偽雄魚相較于對照組則無顯著性差異 (P>0.05，圖6)。

圖6 睪酮、雌二醇處理后socs3 mRNA在半滑舌鰨不同性別肝臟中表達量的變化Figure 6 Change of socs3 mRNA expression in liver of different sexes of C. semilaevis after T and E2 treatments

2.3.4 肌肉中socs3 mRNA 表達量變化 同肝臟組織中的表達模式類似，經(jīng)過T注射處理之后，socs3 mRNA在雌、雄、偽雄魚肌肉中的表達量相較于對照組均顯著上升 (P<0.05)，且雌魚與雄、偽雄魚之間的表達量有顯著差異 (P<0.05)，而雄魚與偽雄魚之間表達量差異不顯著 (P>0.05)。經(jīng)過E2注射處理之后，socs3 mRNA在雄魚和偽雄魚肌肉中的表達量相較于對照組顯著上升，在雌魚中的表達量顯著下降 (P<0.05)，且雄魚與偽雄魚之間表達量差異不顯著 (P>0.05，圖7)。

圖7 睪酮、雌二醇處理后socs3 mRNA在半滑舌鰨不同性別肌肉中表達量的變化Figure 7 Changes of socs3 mRNA expression in muscle of different sexes of C. semilaevis after T and E2 treatments

3 討論

對哺乳動物的性類固醇激素研究較多，研究發(fā)現(xiàn)對家兔[24]、大鼠[25]注射性類固醇激素后，實驗個體內(nèi)的生長激素水平發(fā)生明顯變化。對魚類的研究也發(fā)現(xiàn)E2可以提高金魚 (Carassius auratus)、虹鱒[26]血清中的生長激素水平；在黃顙魚、尼羅羅非魚等具有生長二態(tài)性的典型物種中發(fā)現(xiàn)T、E2等性類固醇激素對其生長確實有一定的影響，且這些影響存在明顯的性別差異。

本實驗中，E2與T對半滑舌鰨個體均有生長抑制作用。參照魚類生長調(diào)控研究相關結果[7,10,27-28]，本實驗選取半滑舌鰨生長軸相關基因gh1、igf1、socs3進行熒光定量PCR分析，探究了半滑舌鰨不同性別魚體在性類固醇激素處理后其生長相關基因mRNA在不同組織中表達量的變化。本實驗中gh、igf1兩個生長正調(diào)控基因在T、E2激素注射后的實驗組中均呈現(xiàn)類似的下降趨勢，暗示Gh/Igf1系統(tǒng)可能是激素處理后生長性能下降的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，二氫睪酮 (Double hydrogen testosterone,DHT) 的刺激可以使虹鱒血漿中的Igf1濃度顯著升高[29]。本研究也發(fā)現(xiàn)雌雄激素處理后socs3 mRNA的表達量在半滑舌鰨肝臟和肌肉中均表現(xiàn)出顯著增加趨勢，該負調(diào)控因子的上調(diào)可能是激素處理后生長緩慢的原因之一。另外，在T處理后的偽雄魚肝臟和E2處理后的偽雄魚腦組織中，分別觀察到了igf1和gh1 mRNA表達量的顯著上調(diào)，暗示偽雄魚體內(nèi)可能存在異于雌、雄魚的生理生長以及應激調(diào)控機制。

性類固醇激素對動物生長性能的影響機制可能是多方面的。1) 性類固醇激素可能通過影響動物的進食與消化系統(tǒng)，進而改變其生長性能。Kaliannan等[30]的研究表明，性類固醇激素與小鼠 (Mus musculus) 腸道微生物群之間存在相互作用。2)注射性類固醇激素后，魚類生長相關的激素水平、受體濃度均會發(fā)生改變，導致其生長速度發(fā)生變化[31-32]。如在哺乳動物研究中發(fā)現(xiàn)雌雄激素、性類固醇合同通路關鍵基因Dhcr24及Igf1系統(tǒng)之間可能存在復雜的調(diào)控關系[33]。雌雄激素對Dhcr24的影響是通過結合到其啟動子上的雌雄激素結合位點來實現(xiàn)的[34-35]，同時，雌激素受體與Igf1系統(tǒng)也被證實在腦組織中具有緊密關聯(lián)[36]。本研究在半滑舌鰨轉錄組數(shù)據(jù)中也鑒定到性類固醇合同通路關鍵基因dhcr24等在雌性肝臟中的上調(diào)表達，因此，深入研究半滑舌鰨中雌雄激素、dhcr24基因及Igf1系統(tǒng)之間可能存在的關聯(lián)機制，將有助于更好地理解魚類性別生長二態(tài)性的分子機理。

另外，本研究中實驗魚的年齡較大及冬季養(yǎng)殖水溫過低等，可能也是影響實驗結果的重要因素。后續(xù)實驗將對注射實驗的魚齡等進行優(yōu)化，并考慮結合性類固醇激素投喂實驗，同時控制環(huán)境因素變量，進一步探究性類固醇激素對魚類生長差異的影響。