測定牡蠣糖原含量的微量反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

陳 夕 ，吳 彪 ，王 巖 ，孫秀俊 ，周麗青 ，劉志鴻

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室/海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

糖原，又稱動物淀粉，是由葡萄糖脫水縮合作用而成的一種多糖，作為動物儲存糖類的主要形式，在體內(nèi)主要發(fā)揮能量儲存功能[1]，同時還具有解酒保肝、抗疲勞、抗腫瘤等生物活性[2]。糖原是大多數(shù)水產(chǎn)貝類體內(nèi)最直接有效的儲能物質(zhì)，在其生理代謝等方面發(fā)揮著重要作用[3]。牡蠣因富含糖原、牛磺酸和鋅等營養(yǎng)物質(zhì)，素有“海中牛奶”之稱[4]，是我國海水養(yǎng)殖貝類的主導(dǎo)種類，也是世界貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中范圍最廣、產(chǎn)量最高的類群[5]。隨著人們生活水平的不斷提高和牡蠣消費(fèi)群體的不斷擴(kuò)大，人們對牡蠣的肉質(zhì)品質(zhì)，尤其是味道鮮甜的口感提出了更高要求。研究表明，牡蠣軟體部糖原與其口味明顯相關(guān)，是牡蠣的主要呈味物質(zhì)之一，其含量通常占干質(zhì)量的20%～40%，可以直接被人體吸收利用[6-7]。2019年通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定的牡蠣新品種中，長牡蠣“魯益1號”和長牡蠣“海蠣1號”的優(yōu)良性狀均以高糖原含量為主要性狀特點(diǎn)。因此，高糖原牡蠣將可能是未來牡蠣市場的主導(dǎo)產(chǎn)品。

準(zhǔn)確、高效的性狀測定是進(jìn)行品質(zhì)改良的前提。目前，水產(chǎn)貝類糖原含量的測定方法主要有傳統(tǒng)蒽酮比色法、基于蒽酮比色法基本原理的試劑盒法和近紅外 (NIR)光譜分析法[8-11]。傳統(tǒng)蒽酮比色法實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，樣品預(yù)處理復(fù)雜。試劑盒法成本過高，且兩種方法對蒽酮、硫酸等試劑的消耗量均較大，難應(yīng)用到大批量樣品的測定工作[12]。NIR光譜分析法需要構(gòu)建模型，而模型的建立需要依賴前期大批糖原含量的準(zhǔn)確測定。微量蒽酮反應(yīng)體系測定糖含量首先由Leyva等[13]提出，主要依托于實(shí)驗(yàn)室的多道移液槍、微孔板、酶標(biāo)儀等現(xiàn)代化設(shè)備以更小的體系對樣品進(jìn)行批量處理，具有試劑耗材用量少、成本低等特點(diǎn)，早期應(yīng)用于藥品中總糖的高通量測定。隨后在植物領(lǐng)域中，韓燁等[14]構(gòu)建了微量滴定蒽酮法并用于甜玉米芯可溶性糖的測定，張述偉等[15]應(yīng)用此方法批量測定大麥葉片中可溶性糖的含量，該方法顯著提升了測定效率。

目前，在動物組織糖含量測定相關(guān)研究中，微量反應(yīng)體系較為少見，尚沒有用微量反應(yīng)體系測定牡蠣軟體組織糖原或可溶性糖含量的相關(guān)報(bào)道。本研究以近江牡蠣(Crassostrea ariakensis) 為材料，通過優(yōu)化反應(yīng)體系組分用量、反應(yīng)時間等重要實(shí)驗(yàn)條件，以期建立一種簡單快捷、準(zhǔn)確高效的牡蠣糖原含量的微量蒽酮比色測定方法，為實(shí)現(xiàn)牡蠣糖原快速、準(zhǔn)確測定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)材料為近江牡蠣，采自于山東東營海區(qū)?；铙w運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，解剖取外套膜、鰓、唇瓣、性腺、肝胰腺、閉殼肌，將其冷凍干燥48 h；研磨成粉后，稱取(20±1) mg樣品于10 mL試管中；使用移液槍加入30% (w/w) 氫氧化鉀 (KOH) 溶液2 mL，沸水浴消化45～60 min，期間每隔5～10 min搖晃試管，使其消化完全。蒸餾水定容至5 mL，12 000 r·min?1離心8 min，取上清液即為樣品待測液，?80 °C保存待測。所用試劑均為優(yōu)級純。

1.2 微量反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

1.2.1 微量蒽酮比色法建立 0.2%蒽酮硫酸溶液的配置：根據(jù)使用量稱取蒽酮 (蒽酮>98.0%，Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)，加入500倍體積的濃硫酸 (優(yōu)級純)，即得蒽酮硫酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光放置。

取稀釋10倍的牡蠣待測液100 μL于EP管中，冰浴5 min，取200 μL蒽酮硫酸溶液于冰浴條件下貼管壁緩慢加至EP管中。所有樣品統(tǒng)一搖勻，之后放入沸水浴加熱8 min，期間迅速顛倒混勻2次 (每次不超過5 s)，沸水浴完成后用自來水冷卻。室溫靜置30 min，移取200 μL于微孔板，利用酶標(biāo)儀測定620 nm處吸光值，每個樣品重復(fù)測定3次。

用1 mg·mL?1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配置成不同濃度梯度的葡萄糖溶液，替代上述的待測液，按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定吸光值，繪制濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程y=ax+b，其中x為反應(yīng)體系中葡萄糖濃度，y為吸光值，a為斜率，b為截距。

測得吸光值后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到反應(yīng)體系中葡萄糖的質(zhì)量濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算樣品糖原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中C為樣品糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù) (mg·g?1)；C0為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到檢測液中葡萄糖的相當(dāng)含量 (mg·mL?1)；V為樣品消化完成后最終定容時的體積，在本實(shí)驗(yàn)中為5 mL；W為所取樣品質(zhì)量 (g)；D為待測液在測定過程中的稀釋倍數(shù)，在本法中為10；0.9為葡萄糖與糖原之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)，即100 μg葡萄糖與蒽酮試劑顯色相當(dāng)于90 μg糖原與蒽酮試劑顯色。

1.2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化 吸光值大小表示蒽酮與糖的反應(yīng)程度，能夠說明反應(yīng)是否完全，反應(yīng)不充分或者反應(yīng)過度都會導(dǎo)致吸光值偏低。因此，將吸光值作為評價標(biāo)準(zhǔn)，吸光值最大的反應(yīng)體系作為最優(yōu)體系。構(gòu)建微量反應(yīng)體系與常規(guī)用量反應(yīng)體系，并設(shè)置不同蒽酮硫酸與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的比例，以確定最佳蒽酮硫酸用量，并比較兩種反應(yīng)體系的差異。微量反應(yīng)體系：取0.1 mg·mL?1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，分別設(shè)置 200、300、400 μL 3組蒽酮硫酸用量，記為A、B、C，根據(jù)1.2.1提供的方法測定每組的吸光值；參考傳統(tǒng)蒽酮比色法構(gòu)建常規(guī)反應(yīng)體系：常規(guī)反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)溶液與蒽酮硫酸用量是微量反應(yīng)體系用量的10倍，即0.1 mg·mL?1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，蒽酮硫酸用量分別為2、3、4 mL 3個水平，記為A1、B1、C1，反應(yīng)體系置于試管中反應(yīng)，其余條件、步驟同1.2.1的方法一致，最后測定吸光值。

1.2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化 反應(yīng)時間也是影響吸光值大小的一個重要因素。根據(jù)方法1.2.2優(yōu)化結(jié)果確定的最佳微量反應(yīng)體系，設(shè)置沸水浴反應(yīng)時間分別為0、2、4、6、8、10、12和14 min，測定0.1 mg·mL?1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值，將吸光值大的反應(yīng)時間確定為最優(yōu)反應(yīng)時間。

1.3 微量蒽酮比色法方法評價

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性評價 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2是評價標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的指標(biāo)。用1 mg·mL?1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配置成0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg·mL?1質(zhì)量濃度梯度的葡萄糖溶液，蒸餾水為空白對照，利用方法1.2建立的最優(yōu)微量反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定標(biāo)準(zhǔn)品吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算R2。

1.3.2 重復(fù)性評價 變異系數(shù) (CV) 是評價標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)性的指標(biāo)，表示數(shù)據(jù)間的離散程度，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值。CV越低，說明重復(fù)性越好。本研究中CV由上述不同濃度下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品與蒽酮硫酸反應(yīng)的5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的吸光值計(jì)算得到。

1.3.3 方法最低檢出限 方法檢出限 (CL) 指一個給定的分析方法在特定條件下能以合理的置信水平檢出被測物的最小濃度，它是表征分析方法最主要的參數(shù)之一。根據(jù)國際理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會 (IU-PAC) 的規(guī)定計(jì)算而得：

式中K為置信因子 (一般取3)，SD為空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差，M為標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率[16]。

1.3.4 穩(wěn)定性評價 批量測定樣品需要較長時間完成，反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性直接影響到吸光值的準(zhǔn)確性。利用近江牡蠣6種組織為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)上述建立的微量蒽酮比色法的最佳條件完成實(shí)驗(yàn)反應(yīng)，顯色反應(yīng)完成后，室溫靜置30、60、90、120 min，分別測定吸光值，評估其穩(wěn)定性。

1.3.5 準(zhǔn)確性評價 利用加標(biāo)回收率評價本法的準(zhǔn)確性。取近江牡蠣閉殼肌、腮、外套膜、肝胰腺、唇瓣、性腺的待測液，根據(jù)上述構(gòu)建的方法并使用最佳條件對待測液糖原含量進(jìn)行第一次測定。然后根據(jù)第一次測定結(jié)果，在待測液中加入與第一次測定結(jié)果大約相等的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，使用相同的方法對待測液再次進(jìn)行測定。根據(jù)兩次測定結(jié)果與加標(biāo)量計(jì)算加標(biāo)回收率，即：加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測定值?試樣測定值)/加標(biāo)量×100%。

1.3.6 近江牡蠣糖原含量不同測定方法的比較 利用近江牡蠣閉殼肌、外套膜、鰓、肝胰腺、唇瓣和性腺，比較分析微量蒽酮比色法、傳統(tǒng)蒽酮比色法和試劑盒法測定牡蠣糖原含量的差異性。微量蒽酮比色法依據(jù)上述建立的技術(shù)方法進(jìn)行，傳統(tǒng)蒽酮比色法參照Carroll等[17]的方法，試劑盒法參照李春燕[9]的方法進(jìn)行。所有測定均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件處理，顯著性差異分析采用t檢驗(yàn)，差異顯著設(shè)置為P<0.05，差異極顯著設(shè)置為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 微量反應(yīng)體系建立

2.1.1 反應(yīng)體系優(yōu)化 微量反應(yīng)體系與常規(guī)用量反應(yīng)體系的6個反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。A、B、C反應(yīng)體系蒽酮硫酸用量與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用量為 200 μL∶100 μL、300 μL∶100 μL、400 μL∶100 μL，A1、B1、C1反應(yīng)體系蒽酮硫酸用量與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用量為 2 mL∶1 mL、3 mL∶1 mL、4 mL∶1 mL。結(jié)果顯示，蒽酮硫酸與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的比例為2∶1時，A、A1組反應(yīng)體系吸光值最高，分別為0.92±0.03和0.93±0.04，且兩組之間無顯著性差異。隨著蒽酮硫酸與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的比例升高，吸光值顯著降低，當(dāng)蒽酮硫酸與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的比例為4∶1時(C和C1) 吸光值最低，分別為0.32±0.02和0.35±0.03。

圖1 不同反應(yīng)體系對吸光值的影響不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)，圖2、圖5同此Figure 1 Influence of different reaction systems at absorbance A620Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Figure 2 and Figure 5.

綜上，蒽酮硫酸與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的比例為2∶1時最優(yōu)，相同比例下微量反應(yīng)體系與常規(guī)反應(yīng)體系測定結(jié)果無顯著性差異，微量反應(yīng)體系更加節(jié)約試劑、操作簡便，因此確定反應(yīng)體系A(chǔ)為最佳反應(yīng)體系。

2.1.2 反應(yīng)時間優(yōu)化 反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果見圖2，沸水浴反應(yīng)0、2、4、6、8、10、12和14 min后，第0至第6分鐘吸光值呈線性上升，第6至第10分鐘上升較緩，第8分鐘時的吸光值為0.90±0.010，反應(yīng)至第10分鐘時達(dá)到最大值 (0.93±0.012)，之后開始逐漸下降，第14分鐘時為0.79±0.021，因此確定最佳反應(yīng)時間為10 min。

圖2 吸光值隨反應(yīng)時間的變化曲線Figure 2 Change curve of absorbance value with reaction time

2.2 微量蒽酮比色法方法評價

2.2.1 線性、重復(fù)性評價及方法檢出限 線性及重復(fù)性分析結(jié)果見表1和圖3。5條標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2介于0.997 9～0.999 5，說明本方法在葡萄糖質(zhì)量濃度介于0～0.2 mg·mL?1時具有較好的線性關(guān)系；變異系數(shù)均小于4%，說明本法具有良好的可重復(fù)性；計(jì)算得出的本法檢出限CL為0.001 5 mg·mL?1，說明本法具有較高的靈敏度。由此可見，本方法的線性、重復(fù)性較好，且檢出限較低。

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of glucose mass concentration and absorbance

表1 線性及重復(fù)性評價結(jié)果Table 1 Linearity and repeatability evaluation results

2.2.2 最終反應(yīng)體系穩(wěn)定性評價 使用本法測定牡蠣6種組織吸光值，室溫靜置120 min，期間每隔30 min測定一次，結(jié)果見圖4，閉殼肌、外套膜、鰓、肝胰腺、唇瓣和性腺第30分鐘時的吸光值分別為0.39、0.97、1.33、0.75、1.84、1.98，第120分鐘時的吸光值分別為0.38、0.94、1.30、0.74、1.84、1.97，相同組織的不同測定時間的吸光值無顯著性差異，說明反應(yīng)顯色完成后的體系在120 min內(nèi)可保持穩(wěn)定。

圖4 微量蒽酮比色法穩(wěn)定性曲線Figure 4 Stability curve of trace anthrone colorimetry

2.2.3 準(zhǔn)確性評價 應(yīng)用上述構(gòu)建的微量蒽酮比色法，對牡蠣6種組織的糖原含量進(jìn)行加標(biāo)回收率測定，表2已將原反應(yīng)體系中不同組織的糖原含量換算為葡萄糖含量，然后再進(jìn)行回收率的計(jì)算。結(jié)果顯示使用本法對牡蠣不同組織糖原含量測定的加標(biāo)回收率介于95.3%～105.8%，具有較高的準(zhǔn)確性，說明微量蒽酮比色法可準(zhǔn)確測定牡蠣糖原的含量。

表2 牡蠣組織中糖原含量加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of recovery rate of glycogen content in oyster tissue

2.2.4 不同牡蠣糖原含量測定方法的比較 使用微量蒽酮比色法、傳統(tǒng)蒽酮比色法、試劑盒法測定了牡蠣6種組織中的糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖5。微量蒽酮比色法測得閉殼肌、外套膜、鰓、肝胰腺、唇瓣和性腺的糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 (54.57±2.22)、(275.62±8.20)、(529.62±17.46)、(348.80±11.27)、(563.30±14.82)和 (592.74±19.68) mg·g?1。與其余兩種方法測得的糖原含量之間無顯著性差異，說明上述確立的微量蒽酮比色法可準(zhǔn)確測定牡蠣的糖原含量。

圖5 不同方法測定牡蠣糖原質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 5 Determination of glycogen content in oyster tissues by different methods

3 討論

目前，糖原含量的測定方法主要有傳統(tǒng)蒽酮法、試劑盒法、近紅外光譜法和微量蒽酮法，各具優(yōu)缺點(diǎn) (表3)。1948年，Morris[18]首次建立蒽酮測定糖含量的方法，1956年Carroll等[17]詳細(xì)報(bào)道了應(yīng)用蒽酮比色法測定小鼠肝臟糖原含量的實(shí)驗(yàn)。雖然此法作為測定糖原含量的經(jīng)典方法一直沿用至今，但該方法樣品預(yù)處理復(fù)雜，操作十分繁瑣，且蒽酮與濃硫酸消耗量較大，不僅工作量巨大，大量濃硫酸的使用也會給實(shí)驗(yàn)人員的健康安全帶來潛在風(fēng)險，較難適用于大批量樣品的測定工作。目前國內(nèi)市場上主要有2款糖原測定試劑盒，即肝/肌糖原測定試劑盒 (南京建成，中國) 和糖原含量檢測試劑盒 (Solarbio, 中國)，這2種試劑盒降低了蒽酮硫酸的使用量，并在樣品處理上做了改進(jìn)，不再使用乙醇提純糖原，而是用濃堿將動物組織消化完成后直接用于糖原測定，即便如此，3 mL的總反應(yīng)體系也相對較大。國外的試劑盒是應(yīng)用酶將糖原分解為葡萄糖后測定葡萄糖含量，避開了使用濃硫酸等試劑，較為安全，但此法對樣品預(yù)處理要求極高，操作也非常復(fù)雜。相比于傳統(tǒng)蒽酮法，雖然試劑盒都做了改進(jìn)，但其主要的缺點(diǎn)是價格昂貴，不適用于大批量樣品的測定。Wang等[19]報(bào)道了近紅外 (NIR) 光譜分析法高通量測定動物組織糖原含量，但近紅外模型的建立依賴于已有多個已知精確糖原含量的樣品，且對于樣品的廣譜性有較高要求，所以模型較適用于與建模樣品相對一致樣品的測定。同時，此模型建立需要特殊儀器，目前尚未大規(guī)模推廣。微量蒽酮反應(yīng)體系具有試劑耗材用量少、成本低等特點(diǎn)，已經(jīng)在植物研究等領(lǐng)域中應(yīng)用[14-15]。

表3 糖原含量的測定方法比較Table 3 Comparison of determination methods of glycogen content

在現(xiàn)代貝類遺傳育種或貝類生物信息學(xué)分析工作中，通常需要大量的基本生物學(xué)數(shù)據(jù)作為支撐條件。由此，構(gòu)建一種成本低、操作簡單快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、可批量測定動物組織糖原含量的方法顯得尤為重要。劉思瑋[8]、叢日浩[3]、吳怡迪[22]應(yīng)用改進(jìn)后的傳統(tǒng)蒽酮比色法測定牡蠣組織糖原含量，降低了濃硫酸的用量，每反應(yīng)使用5 mL蒽酮硫酸顯色劑，總反應(yīng)體系為5.5 mL，完成了大批量的樣品糖原測定工作。國內(nèi)眾多學(xué)者也是采用3～12 mL不等的較大反應(yīng)體系[23-29]，即便如此，濃硫酸使用量過大帶來的工作量也十分巨大。本方法構(gòu)建并優(yōu)化的微量反應(yīng)體系，蒽酮硫酸溶液用量僅為200 μL，總反應(yīng)體系僅為300 μL，在EP管中即可進(jìn)行反應(yīng)，與常規(guī)方法相比濃硫酸用量減少了90%～97%，降低了實(shí)驗(yàn)的危險性與實(shí)驗(yàn)人員的工作量。不僅如此，應(yīng)用試劑盒法測定牡蠣樣品糖原含量成本較高[9]，進(jìn)口試劑盒甚至高達(dá)每個樣品42元 (表3)。而本法的實(shí)驗(yàn)成本僅為每個樣品0.2～0.4元，大大降低了高通量多重復(fù)測定實(shí)驗(yàn)的成本。

顏色直接影響吸光值大小，而糖原含量的計(jì)算主要依賴于準(zhǔn)確的吸光值測定。體系反應(yīng)充分且反應(yīng)不過度是準(zhǔn)確測量的關(guān)鍵[30]。本研究中，隨著反應(yīng)體系在沸水浴中加熱，顏色由淡黃色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)綠色，隨后藍(lán)綠色加深，隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，溶液藍(lán)綠色逐漸消失變?yōu)榍嗷疑舛认陆?。其他條件一定，蒽酮硫酸與待測葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液比例的升高，導(dǎo)致吸光度逐漸下降，是由于高濃度硫酸的反應(yīng)體系會使得反應(yīng)加快，過度反應(yīng)，最終反應(yīng)體系為淺藍(lán)綠色，或藍(lán)綠色完全消失呈現(xiàn)出青灰色，這與張述偉等[15]研究結(jié)果一致。同樣，隨著反應(yīng)時間的增加使得反應(yīng)過度，反應(yīng)體系吸光值呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這與李曉旭和李家政[31]、韓燁等[14]的研究結(jié)果一致。微量蒽酮比色法方法評價中顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.997 9～0.999 5，且變異系數(shù)小于4%，與韓燁等[14]、張述偉等[15]所用方法差別不大。本法檢出限為0.001 5 mg·mL?1，優(yōu)于韓燁等[14]構(gòu)建的微量蒽酮法的葡萄糖檢出限 (0.018 mg·mL?1)。本法最終的反應(yīng)體系在120 min內(nèi)可保持穩(wěn)定，這與張述偉等[15]、任婧等[32]構(gòu)建的微量反應(yīng)體系所得結(jié)果一致。綜上所述，本研究構(gòu)建的微量蒽酮比色法具有良好的靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

本研究使用了上述構(gòu)建的微量蒽酮比色法、傳統(tǒng)蒽酮比色法、試劑盒法共3種方法測定了6種牡蠣組織糖原含量，結(jié)果顯示所測得的糖原含量無顯著性差異。使用微量反應(yīng)體系在保證測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的同時，其實(shí)驗(yàn)過程更加安全；且微量反應(yīng)體系的構(gòu)建使得操作更加簡單快捷，實(shí)驗(yàn)成本可控，適用于大批量樣品的高通量測定。