低強(qiáng)度交變電磁場對于丙泊酚誘發(fā)老年大鼠認(rèn)知功能衰退的治療作用研究

高 敏，劉文雄

（西安市西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科，西安710077）

0 引言

丙泊酚是臨床上最為常用的麻醉劑之一，其主要通過激活γ-氨基丁酸受體氯離子通道復(fù)合物發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用。丙泊酚被廣泛用于重癥監(jiān)護(hù)病房危重患者的麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持和鎮(zhèn)靜[1]。丙泊酚具有起效快、誘導(dǎo)平穩(wěn)、恢復(fù)快、功能恢復(fù)完全、術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)[2]。然而，患者經(jīng)丙泊酚麻醉后也常發(fā)生認(rèn)知功能障礙[3]，該現(xiàn)象尤其在中老年的手術(shù)患者中更為常見且嚴(yán)重[4-5]。低強(qiáng)度交變電磁場（electromagnetic fields，EMF）治療作為一種經(jīng)濟(jì)、安全、無創(chuàng)的物理因子作用手段，已得到廣泛的臨床應(yīng)用[6]。已有研究表明，低強(qiáng)度交變EMF對于生物體的認(rèn)知功能具有明顯的改善作用[7-8]。目前，有關(guān)應(yīng)用低強(qiáng)度交變EMF減輕麻醉后認(rèn)知功能障礙研究的報(bào)道較少。本研究探討低強(qiáng)度交變EMF對于麻醉后大鼠認(rèn)知功能恢復(fù)的影響并探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Morris水迷宮，上海移數(shù)信息科技有限公司；電磁場刺激裝置及實(shí)驗(yàn)大鼠有機(jī)玻璃籠（電磁場研究專用），課題組自制；高精度病理切片機(jī)（RM 2016），德國徠卡公司；激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1200），日本奧林巴斯公司；雙垂直電泳儀（DYCZ-24DN），北京六一儀器廠；酶標(biāo)檢測儀（Rt2100c），美國Rayto公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+），美國Bio-Rad公司；半干轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot SD System），美國Bio-Rad公司；丙泊酚注射液，西安立邦制藥有限公司；ELISA試劑盒，武漢華美生物公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，美國Abcam公司；戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TdT-me-diated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡熒光檢測試劑盒，美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與實(shí)驗(yàn)分組

將36只清潔級健康Sprague-Dawley大鼠（20月齡，雄性，體質(zhì)量400~420 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司）隨機(jī)分為對照組、丙泊酚組和丙泊酚+EMF組，每組12只。對照組于第1天腹腔注射生理鹽水（5 mL/d），丙泊酚組和丙泊酚+EMF組腹腔注射丙泊酚，首次注射劑量為60 mg/kg，隨后每小時注射1次（第二次及以后的注射劑量為首次劑量的一半，即30 mg/kg），共注射6次，即可維持麻醉狀態(tài)6 h。每次麻醉后大鼠立即平臥在自制的吸氧箱上，以5 L/min的流量持續(xù)供氧，待翻正反射恢復(fù)后，將大鼠從吸氧箱中取出。除實(shí)驗(yàn)時間外，大鼠可以自由進(jìn)食和飲水。丙泊酚+EMF組大鼠每天進(jìn)行6 h的全身性EMF暴露，治療第7天結(jié)束。本研究嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動物護(hù)理和使用指南中的建議進(jìn)行。

1.3 低強(qiáng)度交變EMF治療裝置

低頻、低強(qiáng)度電磁場治療系統(tǒng)由電磁場發(fā)生模塊和Helmholtz線圈輸出模塊構(gòu)成。電磁場發(fā)生模塊由MSP430單片機(jī)作為控制核心，輸出產(chǎn)生頻率、強(qiáng)度線性可調(diào)的低強(qiáng)度正弦交變電磁信號，該信號經(jīng)過系統(tǒng)內(nèi)部整合的信號調(diào)制、整合、濾波、放大處理后，將電流輸出至Helmholtz線圈模塊中。Helmholtz線圈模塊中包含有2個直徑相同（40 cm）且等軸放置的線圈組，線圈匝數(shù)為100，線圈間距為20 cm。實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的交變電磁場峰值強(qiáng)度為5 mT，頻率為50 Hz。實(shí)驗(yàn)過程中確保大鼠實(shí)驗(yàn)籠底部與線圈中軸線在一個平面上，以保證電磁場分布的均勻穩(wěn)定。

1.4 學(xué)習(xí)記憶功能測試

治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮測試3組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。實(shí)驗(yàn)前，將平臺放置在水迷宮東北象限的中心，高度在水面以下2 cm處。在用于水迷宮實(shí)驗(yàn)的水池里加入適量的墨水，使大鼠無法分辨平臺。在用于水迷宮實(shí)驗(yàn)的水池的墻上掛著幾個物體作為參考。將水溫加熱至24～26℃，進(jìn)行定位導(dǎo)航試驗(yàn)5 d。每天分為2個時段，每時段進(jìn)行4次訓(xùn)練。在4次訓(xùn)練中，將大鼠分別置于不同象限的水中。用秒表記錄大鼠找到平臺前的持續(xù)時間（逃逸潛伏期）。2次訓(xùn)練間隔1 min。第5天下午進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)。平臺被移走，所有大鼠被從西南象限放入水中，使用Morris水迷宮系統(tǒng)自帶的攝像機(jī)和分析軟件記錄和量化大鼠在水迷宮中2 min內(nèi)的游動路徑的距離（游泳距離）和穿越平臺次數(shù)。

1.5 血清淀粉樣β蛋白（Aβ）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）檢測

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用過量戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3 mL，以3 000 r/min離心5 min，-20℃保存血清。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清Aβ和NSE的表達(dá)水平。該過程嚴(yán)格按照試劑盒中的說明標(biāo)注的操作步驟進(jìn)行。

1.6 海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)因子的檢測

大鼠開顱后取腦取、海馬組織。將海馬組織等分為3份，分別用于ELISA、組織切片染色和蛋白質(zhì)印跡法檢測。用生理鹽水（1∶10）快速制備勻漿，3 000 r/min離心10 min，獲得上清液。采用ELISA法檢測神經(jīng)生長因子（NGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)水平。該過程嚴(yán)格按照試劑盒中的說明標(biāo)注的操作步驟進(jìn)行。

1.7 海馬組織TUNEL熒光染色

對提取的大鼠海馬組織先進(jìn)行4%多聚甲醛固定，再進(jìn)行石蠟包埋，包埋后利用高精度病理切片機(jī)進(jìn)行組織切片，然后使用二甲苯和梯度酒精脫蠟。脫蠟后用TUNEL工作液孵育組織切片（37℃避光1 h），隨后進(jìn)行4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細(xì)胞核（37℃避光1 h），最后對樣本進(jìn)行封片，封片后在激光掃描共聚焦顯微鏡下進(jìn)行圖像采集和分析。

1.8 海馬組織凋亡因子的蛋白質(zhì)印跡法檢測

先將海馬組織在玻璃研磨機(jī)中研磨成分散的細(xì)胞，隨后向樣本中加入1 mL細(xì)胞裂解液保持30 min，然后以2 000 r/min離心5 min，獲得上清液，使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測。隨后以4∶1的比例上樣，煮沸后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別使用抗凋亡基因Bcl-2和凋亡標(biāo)志物Caspase-3的一抗進(jìn)行過夜孵育，充分漂洗后隨后孵育二抗，最后進(jìn)行顯影和半定量分析。GAPDH抗體作為內(nèi)參照物。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，3組的全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析與Benferoni post-hoc檢驗(yàn)結(jié)合法進(jìn)行分析比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低強(qiáng)度交變EMF治療對于丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

通過水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表1。丙泊酚組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離均顯著高于對照組（P<0.05），而穿越平臺次數(shù)顯著低于對照組（P<0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+EMF組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離顯著減少（P<0.05），而穿越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠在逃逸潛伏期、游泳距離和穿越平臺次數(shù)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

表1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 低強(qiáng)度交變EMF治療對于丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙大鼠血清Aβ和NSE表達(dá)水平的影響

通過ELISA法檢測得到的3組大鼠血清Aβ和NSE表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表2。丙泊酚組大鼠的血清Aβ、NSE表達(dá)水平均顯著高于對照組（P<0.05）；相比于丙泊酚組，丙泊酚+EMF組大鼠的血清Aβ、NSE的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠的血清Aβ、NSE表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

表2 3組大鼠血清Aβ和NSE表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 低強(qiáng)度交變EMF治療對于丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達(dá)水平的影響

通過ELISA法檢測得到的3組大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較見表3。與對照組相比，丙泊酚組大鼠海馬組織中NGF和BDNF的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）；而丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中NGF和BDNF的表達(dá)水平均顯著高于丙泊酚組大鼠（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中的NGF和BDNF表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

表3 3組大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.4 低強(qiáng)度交變EMF治療對于丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

基于TUNEL免疫熒光染色對3組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況的檢測結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，丙泊酚組大鼠海馬組織中細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加；而丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著少于丙泊酚組大鼠。通過蛋白質(zhì)印跡法對3組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的檢測結(jié)果如圖2所示。丙泊酚組大鼠海馬組織中的抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），而凋亡標(biāo)記物Caspase-3的表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中的Bcl-2表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而Caspase-3表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中的Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

圖1 基于TUNEL免疫熒光染色評價3組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況（圖中比例尺為50μm）

圖2 基于蛋白質(zhì)印跡法對3組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的檢測結(jié)果

3 討論

作為一種無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、安全的物理因子干預(yù)方法，低強(qiáng)度交變EMF已廣泛應(yīng)用于骨骼肌和軟組織損傷修復(fù)、疼痛緩解、炎癥抑制等臨床治療[9]。近年來，低強(qiáng)度交變EMF對神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用也得到了研究者們的廣泛關(guān)注[10-12]，有新的證據(jù)支持低強(qiáng)度交變EMF在治療包括癡呆癥在內(nèi)的各種神經(jīng)疾病方面的生物學(xué)效應(yīng)[11]。而低強(qiáng)度交變EMF對于認(rèn)知功能的積極作用效果也有一系列的文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]。學(xué)者們通過大量的行為研究發(fā)現(xiàn)了低強(qiáng)度交變EMF可以影響人類和動物的認(rèn)知和記憶功能[7-8]。但是，低強(qiáng)度交變EMF是否能夠?qū)β樽砗笳J(rèn)知功能障礙產(chǎn)生積極的作用效果，目前國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。

丙泊酚是臨床上應(yīng)用最廣泛的靜脈麻醉劑之一，該藥具有療效快、作用時間短、清除快、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，具有重要的應(yīng)用價值。然而，已有研究證實(shí)丙泊酚抑制海馬的長期增強(qiáng)，而海馬是記憶和學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)[15]。此外，丙泊酚還可以影響人腦中的許多正常神經(jīng)遞質(zhì)，這可能導(dǎo)致患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙。而研究也發(fā)現(xiàn)，丙泊酚對于兒童和老年人的認(rèn)知功能損傷更為明顯[16]。本研究中，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)丙泊酚麻醉的大鼠逃逸潛伏期和游泳距離顯著升高，而穿越平臺次數(shù)顯著降低，提示經(jīng)過6 h丙泊酚注射的大鼠在7 d后的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力顯著降低，提示丙泊酚誘發(fā)的老年性認(rèn)知損傷模型構(gòu)建成功。而本研究也發(fā)現(xiàn)，6 h/d的低強(qiáng)度交變EMF治療能夠顯著減少大鼠逃逸潛伏期和游泳距離，并增加其穿越平臺的次數(shù)，提示丙泊酚麻醉劑應(yīng)用后進(jìn)行低強(qiáng)度交變EMF干預(yù)能夠改善老年大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能。

血清Aβ是神經(jīng)系統(tǒng)損傷和持續(xù)炎癥反應(yīng)的潛在標(biāo)志之一。學(xué)者們的研究發(fā)現(xiàn)，麻醉所誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙與血清Aβ的表達(dá)有關(guān)[17]。而血清Aβ濃度的變化可間接反映蛋白印跡法Aβ在腦組織中的聚集情況。NSE是糖酵解過程中烯醇化酶的一種同工酶，它在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中特異性分布，是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物[18]。正常情況下，腦脊液和血清中有少量NSE；當(dāng)患者發(fā)生腦缺血、缺氧、中毒或外傷時，神經(jīng)細(xì)胞膜完整性受損，血腦屏障通透性增加，NSE蛋白滲漏到血清或腦脊液中，導(dǎo)致含量增加[19]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，丙泊酚組大鼠血清Aβ和NSE表達(dá)水平顯著升高；而與丙泊酚組比較，丙泊酚+EMF組大鼠血清Aβ和NSE表達(dá)水平均顯著降低。提示低強(qiáng)度交變EMF治療緩解麻醉后認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能與其降低體內(nèi)血清Aβ和NSE表達(dá)水平有關(guān)。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是在神經(jīng)組織中發(fā)揮特殊作用的小分子多肽因子，其能促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生長、分化和存活，調(diào)節(jié)突觸的可塑性。NGF和BDNF是最重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF與特定的TrkA受體結(jié)合，激活細(xì)胞代謝，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞的存活和軸突的生長，從而在神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)中起著非常重要的作用[20]。BDNF通過結(jié)合其特異性高親和力受體TrkB發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。研究發(fā)現(xiàn)，NGF和BDNF在改善認(rèn)知功能方面起著重要作用，它們能提高阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)元生長[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚誘發(fā)大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達(dá)水平顯著降低，而低強(qiáng)度交變EMF治療能夠有效提升丙泊酚注射大鼠海馬組織中NGF和BDNF的表達(dá)水平，提示低強(qiáng)度交變EMF對于丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙的改善效應(yīng)與海馬組織中增加的NGF和BDNF表達(dá)水平相關(guān)。

海馬組織中細(xì)胞凋亡的增加是造成認(rèn)知功能損傷的關(guān)鍵因素[22]。而Bcl-2能夠抑制線粒體中的細(xì)胞色素C的釋放，阻斷其下游的信號級聯(lián)反應(yīng)，抑制Caspase-3的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚組大鼠海馬組織中凋亡顯著高于對照組；而蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果進(jìn)一步揭示丙泊酚大鼠海馬組織中的Bcl-2表達(dá)水平顯著降低而Caspase-3表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了丙泊酚能夠誘導(dǎo)海馬組織的細(xì)胞凋亡，這與前人的研究結(jié)果一致[23]。本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度交變EMF治療能夠顯著降低丙泊酚注射的大鼠海馬組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并且其也能夠顯著提升丙泊酚大鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá)水平并抑制Caspase-3蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果表明，低強(qiáng)度交變EMF治療能夠顯著緩解丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙大鼠海馬組織的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度交變EMF治療能夠顯著改善丙泊酚誘發(fā)的大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與其對細(xì)胞凋亡的調(diào)控、血清Aβ和NSE表達(dá)水平的降低以及NGF和BDNF的表達(dá)水平升高有關(guān)。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將主要關(guān)注對于低強(qiáng)度交變EMF治療調(diào)節(jié)認(rèn)知功能障礙窗口參數(shù)的探討，并通過體外及在體基因沉默技術(shù)進(jìn)一步揭示低強(qiáng)度交變EMF改善認(rèn)知功能障礙的分子信號機(jī)制。