抑癌基因PTEN、P27在子宮內(nèi)膜癌及癌前病變中的表達(dá)及其臨床意義*

李少星 余華 楊惠歡 劉戰(zhàn)立

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,四川 成都 610500;2.新津縣人民醫(yī)院,四川 成都 611430)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是臨床常見(jiàn)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率正逐年上升，死亡率已超過(guò)宮頸癌，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。正常子宮內(nèi)膜演變?yōu)镋C是一個(gè)非常漫長(zhǎng)的過(guò)程，而早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)于EC的防治意義重大[2]。多種癌基因及抑癌基因參與調(diào)控EC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3]。既往研究顯示，PTEN是抑癌基因，其高表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，且PTEN是EC中突變率最高的基因[4]。P27是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定蛋白，可能是PTEN通過(guò)PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖，誘導(dǎo)G1期阻滯過(guò)程的下游靶基因[5]。既往研究顯示，在包含胃癌、乳腺癌、膀胱癌等在內(nèi)的多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到PTEN及P27的異常表達(dá)，但是少見(jiàn)有關(guān)EC組織及癌前病變組織中PTEN及P27蛋白異常表達(dá)的相關(guān)報(bào)道[6-8]。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)法對(duì)不同子宮內(nèi)膜組織類(lèi)型中PTEN及P27蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討抑癌基因PTEN及P27在EC及癌前病變中的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2015年6月～2020年1月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院確診為EC患者的存檔癌組織蠟塊35例，同時(shí)選取同期存檔的39例內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)(不伴不典型)、26例子宮內(nèi)膜不典型增生和35例正常子宮內(nèi)膜組織蠟塊。按組織類(lèi)型不同分為正常子宮內(nèi)膜組、內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)組、子宮內(nèi)膜不典型增生組和EC組。EC組按病理分級(jí)分：G1 14例，G2 16例，G3 5例；臨床分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期9例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例；肌層浸潤(rùn)：無(wú)肌層浸潤(rùn)12例，浸潤(rùn)≤1/2肌層16例，浸潤(rùn)>1/2肌層7例；淋巴轉(zhuǎn)移：無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移29例，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例，腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例；組織學(xué)類(lèi)型：Ⅰ型(子宮內(nèi)膜樣腺癌)27例，Ⅱ型8例(漿液性乳頭狀腺癌6例，透明細(xì)胞癌2例)。所有組織類(lèi)型均經(jīng)病理結(jié)果證實(shí)，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)化療或放療，各組患者之間年齡、身體狀況無(wú)明顯差異，具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 SP試劑盒、PTEN及P27一抗均購(gòu)于北京中杉金橋公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)于德國(guó)徠卡公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織PTEN及P27表達(dá) 將收集的各組織蠟塊進(jìn)行石蠟切片，厚度約為4 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水，抗原熱修復(fù)，去離子水孵育，滴加PTEN及P27一抗，置于4 ℃過(guò)夜后采用PBS清洗2次，滴加聚合酶輔助劑，37 ℃水浴持續(xù)孵育20 min；PBS沖洗2次，滴加IgG多聚體；37 ℃水浴孵育30 min；采用DBA溶液顯色。陰性對(duì)照為未加一抗的PBS緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為正常的子宮內(nèi)膜組織切片，每批染色均設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 將切片置于光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)各視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。PTEN及P27的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞核、細(xì)胞漿染成棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～50%為弱陽(yáng)性(+)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

2 結(jié)果

2.1 各組患者一般資料比較 4組患者年齡、BMI及合并癥比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4組患者一般資料比較

2.2 不同組織中PTEN表達(dá)情況比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，PTEN在正常子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性率為100%，而在內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)組和內(nèi)膜不典型增生組中PTEN陽(yáng)性率分別降低為79.49%和69.23%。EC組PTEN陽(yáng)性率為42.86%，顯著低于其他組(2=28.000，P<0.001；2=10.523，P=0.001；2=4.179，P=0.041)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 不同組織中PTEN表達(dá)情況比較

2.3 不同組織中P27表達(dá)情況比較 不同內(nèi)膜組織中P27陽(yáng)性表達(dá)存在顯著性差異(P<0.05)。正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)中P27陽(yáng)性表達(dá)率較高，在內(nèi)膜不典型增生和EC組中P27陽(yáng)性表達(dá)率較低。EC組P27陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于正常子宮內(nèi)膜及內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)組(2=30.688，P<0.001；2=21.941，P<0.001)，見(jiàn)表3、圖1。

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織中PTEN及P27表達(dá)情況(免疫組化，100×)

表3 不同組織中P27表達(dá)情況比較

2.4 EC組織中PTEN及P27的陽(yáng)性表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系 隨著EC病理分級(jí)升高，其PTEN及P27陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05)；內(nèi)膜樣癌組織中PTEN及P27陽(yáng)性率明顯低于非內(nèi)膜樣癌組織(P<0.05)。EC臨床分期、肌層浸潤(rùn)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)EC中PTEN及P27的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 EC組織中PTEN及P27的陽(yáng)性表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系[n(×10-2)]

2.5 子宮內(nèi)膜不典型增生中PTEN及P27蛋白表達(dá)相關(guān)性 子宮內(nèi)膜不典型增生組織中，PTEN及P27蛋白共同陽(yáng)性表達(dá)10例，共同陰性表達(dá)7例，子宮內(nèi)膜不典型增生組織中PTEN及P27蛋白表達(dá)正相關(guān)(r=0.402，P=0.042)，見(jiàn)表5。

表5 PTEN及P27蛋白在子宮內(nèi)膜不典型增生中表達(dá)相關(guān)性(n)

2.6 EC組織中PTEN及P27蛋白表達(dá)相關(guān)性 EC組織中，PTEN及P27蛋白共同陽(yáng)性表達(dá)11例，共同陰性表達(dá)19例，EC組織中PTEN及P27蛋白表達(dá)正相關(guān)(r=0.712，P<0.001)，見(jiàn)表6。

表6 EC組織中PTEN及P27蛋白表達(dá)相關(guān)性(n)

3 討論

近年來(lái)，EC及癌前病變的發(fā)生率不斷上升，且日益年輕化，而早診斷早治療是提升EC防治效果的關(guān)鍵[9-10]。腫瘤疾病的發(fā)生是一個(gè)逐漸演變的過(guò)程，EC的發(fā)生也經(jīng)歷了一系列過(guò)程，包含子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異常增殖、瘤變及EC的形成，而周期調(diào)控機(jī)制異常是這一過(guò)程的內(nèi)在原因[11]。機(jī)體內(nèi)癌細(xì)胞的周期調(diào)控是由多種因素共同介導(dǎo)的，其中PTEN及P27等周期相關(guān)蛋白參與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程，與EC的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。子宮內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)及內(nèi)膜不典型增生均是子宮內(nèi)膜癌前病變的過(guò)程，基于此，本研究通過(guò)分析正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)、內(nèi)膜不典型增生及EC四種不同組織中PTEN、P27的表達(dá)情況，分析其與EC發(fā)生及發(fā)展過(guò)程的關(guān)系，旨在為臨床EC的診療提供理論參考。

PTEN，又稱(chēng)為MMACI基因，由9個(gè)外顯子組成，主要是通過(guò)PIP3脫磷酸降低細(xì)胞內(nèi)的PIP3水平，進(jìn)而阻斷Akt-蛋白激酶B(PKB)途徑，影響其下游通路，包括通過(guò)抑制基因P27、BAD等的磷酸化水平將細(xì)胞周期阻斷在G1期，進(jìn)而顯著抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[14]。此外，PTEN還能使局部粘附激酶(foca 1 adhesion kinase，F(xiàn)AK)脫磷酸，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖及浸潤(rùn)介導(dǎo)的細(xì)胞鋪展及局部粘附的形成[15]。祁曉莉等[16]研究顯示，采用免疫組織化學(xué)染色可觀察到PTEN在EC中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于其他子宮內(nèi)膜組織。而本研究結(jié)果顯示，在正常子宮內(nèi)膜、內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)、內(nèi)膜不典型增生及EC組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率分別為100.00%、79.49%、69.23%和42.86%，PTEN在癌及內(nèi)膜不典型增生中的表達(dá)缺失與內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)及正常子宮內(nèi)膜組織相比，具有顯著性差異，說(shuō)明PTEN表達(dá)被抑制或缺失則可能會(huì)使子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)失控，導(dǎo)致癌變的發(fā)生。Black等[17]證實(shí)PTEN在基因水平的改變與EC的發(fā)生和發(fā)展顯著相關(guān)。在本研究中，PETN的陽(yáng)性表達(dá)率與病理分級(jí)明顯相關(guān)，組織病理分級(jí)越高其陽(yáng)性表達(dá)率越低，提示腫瘤惡性程度越高，PTEN蛋白表達(dá)量越低，其對(duì)應(yīng)的預(yù)后越差，其在非內(nèi)膜樣癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于內(nèi)膜樣癌組織也進(jìn)一步證實(shí)這一觀點(diǎn)，而這一結(jié)論對(duì)于臨床評(píng)估子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后意義重大。但本研究結(jié)果顯示，EC組織中PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨著肌層浸潤(rùn)深度加深、臨床分期升高及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而降低，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究樣本量較少有關(guān)。由于肌層浸潤(rùn)深度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是影響EC患者預(yù)后的重要因素，對(duì)于其預(yù)后的判斷至關(guān)重要，因此在后續(xù)的研究中仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步分析PTEN與EC發(fā)生發(fā)展過(guò)程的關(guān)系。

P27定位于染色體12pI3，屬于CDKI中KIP/CIP家族中的一員，其與cyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合，能有效抑制cyclinE-CDK2復(fù)合物活性，而高濃度cyclinE-CDK2是細(xì)胞通過(guò)G1到S限制點(diǎn)最關(guān)鍵的因素[18]。此外，P27是潛在的腫瘤抑制基因，P27的下調(diào)和CDK2的激活都能誘導(dǎo)細(xì)胞惡變，形成腫瘤細(xì)胞，保持機(jī)體內(nèi)P27正常濃度是抵抗細(xì)胞惡變的基礎(chǔ)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常子宮內(nèi)膜、內(nèi)膜增生過(guò)長(zhǎng)、內(nèi)膜不典型增生及EC組織中P27陽(yáng)性表達(dá)率分別為97.14%、87.18%、42.31%和34.29%，提示P27表達(dá)的缺失是誘發(fā)EC及癌前病變的關(guān)鍵因素之一，與楊玉敏等[20]研究結(jié)果一致。P27蛋白在病理分級(jí)G1、G2及G3組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.29%、18.75%及0.00%，三者間具有顯著性差異，且其在內(nèi)膜樣癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于非內(nèi)膜樣癌組織，提示P27可能介導(dǎo)EC的演變過(guò)程，對(duì)P27進(jìn)行檢測(cè)可為早期診斷EC和臨床綜合治療提供參考。本研究證實(shí)在EC系列病變中，P27呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，提示P27表達(dá)下降可能在子宮內(nèi)膜細(xì)胞病變中起著重要作用，為子宮內(nèi)膜癌變的早期信號(hào)。此外，在EC及癌前病變組織中PTEN與P27間存在正相關(guān)關(guān)系，其原因可能在于PTEN表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致P27表達(dá)異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，誘導(dǎo)EC的發(fā)生。因此，采用免疫組織化學(xué)法聯(lián)合檢測(cè)PTEN、P27有助于EC以及癌前病變的早期診斷。

4 結(jié)論

由PTEN及P27基因突變和缺失導(dǎo)致的PTEN、P27功能喪失是EC發(fā)生的早期事件，在子宮內(nèi)膜不典型增生組織及EC組織中PTEN與P27蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，兩者共同作用介導(dǎo)子宮內(nèi)膜過(guò)度增生發(fā)展至EC的過(guò)程，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PTEN及P27基因有助于鑒別EC及癌前病變，且對(duì)EC的癌變程度具有一定的評(píng)估作用。