靶向抑制 PI3K 對(duì)PDK-1/Akt信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化的影響*

陳巧玲 白亦光 別俊 楊蜜 張加勇

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤科;2.骨科， 四川 南充 637000)

骨是一種有活力的組織器官，在形成和溶解的動(dòng)態(tài)狀態(tài)下保持平衡。其中成骨細(xì)胞是骨形成的重要細(xì)胞，參與維持機(jī)體的礦物質(zhì)平衡[1]。當(dāng)成骨細(xì)胞的分化過程受到阻礙，或者破骨細(xì)胞的活性亢進(jìn)，都會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等疾病[2]。骨質(zhì)疏松癥是一種全身性的骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨質(zhì)微結(jié)構(gòu)的退化，包括骨量減少和骨質(zhì)脆性增加，這種變化增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3]。在骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展過程中，成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)具有重要作用[4]。另外，在腫瘤骨轉(zhuǎn)移等疾病發(fā)生發(fā)展過程中，由于腫瘤細(xì)胞的侵犯而導(dǎo)致成骨細(xì)胞的凋亡或分化功能的抑制，加重疾病的病程進(jìn)展[5]。因此，研究成骨細(xì)胞的功能調(diào)控對(duì)于深入認(rèn)識(shí)骨重建的過程及骨代謝疾病的防治具有重要價(jià)值。

磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K)/ Akt 信號(hào)通路是正常生理狀態(tài)下細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝通路，廣泛參與真核細(xì)胞的增殖、分化和能量代謝等過程[6]，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中還參與了腫瘤細(xì)胞的能量代謝[1]。本研究擬通過對(duì)PI3K蛋白的靶向抑制，探討在成骨細(xì)胞分化成熟的過程中，成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況和PI3K/Akt 信號(hào)通路下游蛋白表達(dá)的變化，從而更深入地認(rèn)識(shí)靶向PI3K/ Akt 信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 胎牛血清( FBS，Gibco BR)； LY294002(美國(guó) Sigma 公司)；0.25%胰蛋白酶(美國(guó) Sigma 公司)； PBS工作液(碧云天，中國(guó))；DMEM培養(yǎng)液(美國(guó) Sigma 公司)；成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OBM，美國(guó)Hyclone 公司)；4%多聚甲醛細(xì)胞固定溶液(碧云天，中國(guó))；ALP染色試劑盒(碧云天，中國(guó))；ALP活性分析試劑盒(碧云天，中國(guó))；1%茜素紅染色液(pH4.2，bio-channel，中國(guó))；GAPDH(D16H11)兔單克隆抗體(#5174)和PDK-1(D37A7)兔單克隆抗體、p-PDK1(C49H2)兔單克隆抗體和p-AKT(D25E6)兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology，Inc.)E.Z.N.A.總 RNA 提取試劑盒I(美國(guó)Hyclone 公司)；二抗抗兔辣根過氧化物酶結(jié)合IgG，1:1000；#58802(美國(guó)Cell Signaling Technology，Inc)。動(dòng)物來源C57BL/6小鼠2只(4～6周齡，雌雄各1只)，購(gòu)自川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。所有動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作在川北醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的培養(yǎng) 從無菌條件下分離小鼠股骨和脛骨，使用含有肝素的注射器沖洗骨髓腔，收集小鼠骨髓腔沖洗液，轉(zhuǎn)移到離心機(jī)100×g離心5 min，使用15%FBS的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至T75細(xì)胞瓶中，放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)基一次。待細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)分組 收集第三代BMSC，以5×103個(gè)/cm2的密度接種于預(yù)先包被明膠的6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，每孔加入2 mLOBM，然后在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。OBM需在37 ℃預(yù)熱，每隔3 d更換一次新鮮的OBM。誘導(dǎo)1周后，為避免成骨細(xì)胞脫落，每2 d將全培養(yǎng)基換成半培養(yǎng)基。對(duì)照組只使用OBM治療。LY294002組用在OBM中加入3 μM的LY294002進(jìn)行處理。

1.4 CCK-8檢測(cè)BMSC的增殖以及LY294002的安全濃度 將BMSC接種于96孔板上，接種密度為1×104個(gè)/孔，添加三個(gè)副孔，在15%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1 d后，用不同濃度的LY294002(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μM)孵育48 h和96 h，每孔加入10 μL CCK-8緩沖液孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下讀取OD值。

1.5 堿性磷酸酶(ALP)染色和茜素紅染色 ALP染色：將待染細(xì)胞用PBS清洗5次，4%多聚甲醛細(xì)胞固定液固定30 min， PBS沖洗3～5次，配制并添加ALP染色工作液37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3～5次，倒置顯微鏡下觀察并采集圖片，并用ALP活性分析試劑盒檢測(cè)ALP的活性。

茜素紅染色：將待染細(xì)胞用PBS清洗5次,4%多聚甲醛細(xì)胞固定液固定30 min，PBS洗滌3～5次，用1%茜素紅染色工作液染色20 min。待肉眼可見工作液中出現(xiàn)紅色棉絮狀沉淀后，用PBS洗滌3～5次，顯微鏡觀察并采集圖像。體外礦化能力定量檢測(cè)：將細(xì)胞在10%的氯化十六烷基吡啶中連續(xù)攪拌，在室溫下過夜脫色。使用酶標(biāo)儀562 nm波長(zhǎng)下讀取OD值，標(biāo)準(zhǔn)化后獲得礦化定量值。

1.6 Western-Blot 使用RIPA蛋白裂解試劑盒說明書提取總蛋白。每孔加入1 mL蛋白裂解緩沖液，在4 ℃下裂解細(xì)胞30 min，4 ℃下收集裂解液，收集上清液，用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用10%的 SDS-聚丙稀酰胺凝膠分離蛋白，濕式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)膜后，取出 PVDF 膜，用洗滌緩沖液在搖床上洗膜 10 min，在37 ℃的5%抗體封閉液中孵育1 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜：抗p-PDK1(稀釋度1∶1 000)，抗GAPDH(稀釋度1∶1 500)和抗p-AKT(稀釋度1∶1 000)。加入二抗(稀釋度1∶1 500)，將樣品在37 ℃孵育1 h，取出PVDF膜，在Odyssey機(jī)上掃膜，并分析灰度值。

1.7 Real-time PCR測(cè)定結(jié)果 根據(jù)E.Z.N.A.Total RNA Kit I試劑盒說明書提取并獲得細(xì)胞系的總RNA，使用QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix配制PCR反應(yīng)液。使用的mRNA引物如下：骨鈣素(OCN)，5′-TCTGACAAAGCCTTCATGTCC-3′，5′-AAATAGTGATACCGTAGATGCG-3′。ALP，5′-GTGACTACCACTCGGGTGAAC-3′，5′-CTCTGGT GGCATCTCGTTATC-3′。GAPDH, 5′-GCATCTC CCTCACAATTTCCA-3′，5′-TGCAGCGAACTTTA TTGATGGT-3′。用標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)算OCN和ALP基因表達(dá)，并與GAPDH基因表達(dá)進(jìn)行歸一化。

2 結(jié)果

2.1 LY294002對(duì)BMSC的細(xì)胞活性影響 LY294002的分子結(jié)構(gòu)式見圖1A。藥物濃度在6.4 μM時(shí)會(huì)對(duì)BMSC的細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)，見圖1B；藥物濃度在3.2 μM及以下時(shí)未見明顯的抑制細(xì)胞增殖活性作用。

圖1 LY294002的分子結(jié)構(gòu)式和不同藥物濃度對(duì)BMSC的細(xì)胞活性的影響

2.2 LY294002對(duì)成骨細(xì)胞的分化呈劑量依賴性 OBM培養(yǎng)基中添加不同劑量的LY294002，對(duì)BMSC進(jìn)行成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)，使用ALP染色法對(duì)成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中ALP的表達(dá)進(jìn)行鑒定。LY294002的濃度梯度設(shè)置為1、2、3 μM，結(jié)果顯示LY294002對(duì)成骨細(xì)胞的分化對(duì)產(chǎn)生不同程度的影響，呈現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同濃度的LY294002對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響

2.3 LY294002 抑制成骨細(xì)胞ALP的表達(dá)和細(xì)胞礦化能力 添加濃度為3 μM的LY294002至OBM為干預(yù)組，觀察成骨細(xì)胞外基質(zhì)ALP和礦化能力的變化，發(fā)現(xiàn)ALP陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(圖3A)。茜素紅染色提示，細(xì)胞外鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量也明顯減少(圖3B)，同時(shí)對(duì)ALP活性和細(xì)胞外基質(zhì)礦化定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果同ALP和茜素紅染色結(jié)果一致(圖3C～D)。這提示LY294002 明顯抑制了成骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成。

圖3 LY294002對(duì)成骨細(xì)胞外基質(zhì)的影響

2.4 LY294002下調(diào)了p-PDK1和p-Akt蛋白的表達(dá) 免疫印跡所示，LY294002存在的情況下，細(xì)胞中磷酸化的PDK-1 和Akt出現(xiàn)明顯的下調(diào)(均P<0.05)，表明LY294002通過調(diào)控PDK-1 /Akt信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化產(chǎn)生影響，見圖4。

圖4 成骨細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)

2.5 LY294002下調(diào)了成骨細(xì)胞相關(guān)基因ALP和OCN mRNA的表達(dá) 使用real-time PCR對(duì)成骨細(xì)胞分化早期的ALP以及在成骨細(xì)胞分化晚期的OCN基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示LY294002下調(diào)了成骨細(xì)胞相關(guān)基因ALP和OCN mRNA的表達(dá)(P<0.05)，見圖5A～B。

圖5 成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

PDK-1/AKT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)體內(nèi)正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是凋亡和細(xì)胞存活[7]。PI3K作為PDK-1/AKT信號(hào)通路的上游調(diào)控蛋白，是幾條凋亡途徑中的關(guān)鍵控制點(diǎn)[8]。當(dāng)PI3K被激活時(shí)，可以誘導(dǎo)第二信使PIP2和PIP3[9]。AKT是PI3K和PIP3的重要下游靶點(diǎn)，它可以與質(zhì)膜上募集的PIP3相互作用，然后被PDK-1部分磷酸化并激活[10]，從而調(diào)節(jié)下游通路，促進(jìn)細(xì)胞存活。目前針對(duì)該信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的分化作用研究較少。本研究通過靶向抑制PI3K，觀察對(duì)體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的影響，旨在了解靶向抑制PI3K對(duì)骨質(zhì)破壞或骨質(zhì)疏松治療的作用機(jī)制。

BMSC是體內(nèi)成骨細(xì)胞的主要來源[11]。在體外誘導(dǎo)BMSC向成骨細(xì)胞分化的過程可以模擬體內(nèi)形成成骨細(xì)胞成熟的過程[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，采用體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠BMSC，通過CCK-8檢測(cè)獲得LY294002的安全濃度，在3.2 μM及以下濃度安全濃度范圍以下，發(fā)現(xiàn)在對(duì)BMSC的增殖活性并沒有產(chǎn)生影響。但在OBM中添加不同濃度的LY294002對(duì)BMSC進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞的分化成熟產(chǎn)生了阻礙，這種影響呈現(xiàn)劑量依賴性。之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，對(duì)照組使用OBM處理BMSC，干預(yù)組在OBM中添加LY294002，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并檢測(cè)細(xì)胞ALP活性和體外礦化能力，結(jié)果提示干預(yù)組ALP陽性細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)礦化明顯減少(P<0.05)。采用Western -Blot和RT-PCR檢測(cè)PDK-1/Akt通路及下游轉(zhuǎn)錄因子基因和蛋白的表達(dá)水平。觀察兩組細(xì)胞在成骨分化過程中的變化。結(jié)果顯示干預(yù)組p-PDK-1和p-Akt蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低。干預(yù)組成骨細(xì)胞相關(guān)基因ALP和OCN mRNA較對(duì)照組明顯下降。

mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素可以抑制成骨細(xì)胞分化[13]。Pan等[14]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K激酶可阻斷胎鼠顱骨細(xì)胞的ALP活性。Bai等[15]發(fā)現(xiàn)特異性抑制PDK-I蛋白的表達(dá)可以阻礙成骨細(xì)胞的分化成熟。那些研究的結(jié)果與本研究結(jié)果相似。有學(xué)者[16]認(rèn)為成骨細(xì)胞分化最初由BMSC收到一系列調(diào)控因素而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，并表達(dá)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的調(diào)節(jié)因子。隨后細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸成熟，堿性磷酸酶表達(dá)增強(qiáng)和膠原蛋白沉積增加[17]。在最后礦化的階段，骨涎蛋白和OCN的表達(dá)和分泌增加，最終開始履行骨形成的生物活性[18]。本研究在誘導(dǎo)分化過程中也進(jìn)一步證實(shí)了這一過程。OBM主要成分為抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松。該培養(yǎng)基能促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞分化，已被廣泛接受。這些成分被認(rèn)為是BMSC礦化成熟的必要條件[19]。BMSC在這一過程中分化成熟并獲得了成骨細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特性[20]。

4 結(jié)論與啟示

本研究結(jié)果顯示，通過對(duì)PI3K蛋白的抑制，PI3K/Akt信號(hào)通路中明顯下調(diào)了p-PDK-1和p-Akt蛋白表達(dá)水平，成骨細(xì)胞相關(guān)基因ALP和OCN mRNA表達(dá)也明顯下降。但PI3K/AKT信號(hào)通路中下游的蛋白是如何變化的尚不清楚。在后續(xù)研究中，將開展一些體內(nèi)研究，以期獲得治療骨質(zhì)代謝疾病或腫瘤骨質(zhì)破壞的新靶點(diǎn)。