生物炭對農(nóng)田土壤中酶活性和細菌群落結構的影響研究

韓志旺，趙志華，張艷利，何秋生，何麗霞，張桂香

(1. 太原科技大學環(huán)境科學與工程學院，太原 030024；2. 中國科學研究院廣州地球化學所，廣州 510640)

前 言

山西省的土壤是典型的黃土，土壤養(yǎng)分貧瘠、持水力差，不利于水土保持以及植物生長[1-2]。因此，十分有必要對黃土進行改良。近年來，生物炭作為土壤改良劑引起了世界各國學者的廣泛關注，這是因為生物炭具有諸多方面的優(yōu)點，比如固定碳、減少溫室氣體排放、調節(jié)土壤中微生物群落結構、提高土壤肥力和促進植物生長[3-4]。在土壤改良過程中，土壤酶活性和微生物豐富度是指示土壤健康狀況的重要指標[5-6]。關于土壤酶活性，研究表明生物炭對土壤酶活性的影響取決于酶種類和生物炭類型，比如，蛋白酶活性隨生物炭的熱解溫度的升高而顯著升高，而熱解溫度對土壤脲酶活性幾乎沒有影響[7]。對于微生物群落，大多數(shù)研究表明生物炭能夠通過改變土壤基本性質和養(yǎng)分，比如pH、陽離子交換量(CEC)、總有機碳(TOC)、氮(N)和磷(P)含量等，進而改變土壤微生物的豐度和群落結構[8-9]。大多數(shù)研究表明生物炭對微生物生長具有促進作用[5]。然而，也有研究報道了生物炭能夠抑制微生物的生長[10]。這可能是因為生物炭生產(chǎn)的原料、熱處理條件和工藝流程對生物炭的物理化學性質和性能有重要影響，導致了不同生物炭對微生物的生長和群落結構組成產(chǎn)生不同的影響。因此，十分有必要考察生物炭原料來源和熱解溫度對土壤酶活性和微生物群落結構的影響。但是，目前關于生物炭如何影響黃土中酶活性和微生物群落結構的研究還十分有限。

本研究的目的在于以下幾個方面：(1)考察生物炭原料來源和熱解溫度對山西黃土土壤基本性質和營養(yǎng)元素的影響；(2)探討生物炭對山西黃土中酶活性包括脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶和中性磷酸酶活性的影響；(3)考察生物炭對山西黃土中微生物群落結構的影響，并闡明生物炭及其所引起的土壤環(huán)境變化與微生物群落結構變化之間的關系。這些結果將為設計高效、廉價、環(huán)保的生物炭作為土壤改良劑用于山西黃土改良提供理論依據(jù)和基本數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤：取自中國山西榆次的某農(nóng)田表層土(0～20 cm)，去除植物殘渣及石塊后，并在避光條件下自然風干，研磨，過2 mm篩。本研究的土壤中施用過雞糞堆肥產(chǎn)品。土壤組成：粘土(2.35%)，粉砂(11.26%)和細沙(86.39%)。土壤pH按照土-水比例為1∶2.5(w/v)混勻，用pH計測定，其值為7.68±0.02。土壤有機質(SOM)采用K2CrO7容量-外加熱法測定，含量為(47.81±1.54)g/kg，陽離子交換量采用乙酸銨交換法測定，土壤CEC值為(30.51±0.93)cmol/kg?？偭?TP)按照中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T88-1988 NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定?？偟?TN)采用凱氏定氮法測定。

生物炭：本研究中使用的生物炭是將不同原材料包括核桃殼(WS)、玉米軸(CC)和玉米秸稈(CS)分別在250℃、400℃和600℃的馬弗爐中缺氧熱解4 h，冷卻至室溫后，將馬弗爐中的生物炭取出，過100目篩子，得到的生物炭分別記作WS2、WS4、WS6、CC2、CC4、CC6、CS2、CS4和CS6。所有生物炭的pH調整至近中性(6.71～7.66)待用。

1.2 試驗設計

生物炭改良土壤：將生物炭與土壤分別以0%和1%的質量比混合均勻。未加生物炭的土樣記作UCK，對應生物炭處理的土樣分別記作UWS2、UWS4、UWS6、UCC2、UCC4、UCC6、UCS2、UCS4和UCS6。每組重復兩次。每兩天稱重、補充水分，使其水分保持在最大持水量的70%。老化之后，將土樣冷凍干燥，并過0.15 mm篩，以待進一步分析。

1.3 酶活性測定

脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定。取0.4 g的冷凍干燥土樣，與0.5 mL甲苯混合，10 min后加5 mL 10%尿素溶液和10 mL的檸檬酸鹽緩沖溶液(pH 6.7)，搖勻后在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結束后過濾，取0.5 mL濾液用超純水稀釋至50 mL，再加4 mL苯酚鈉溶液(6.75 mol/L)和3 mL次氯酸鈉溶液(活性氯為0.9%)，隨加隨搖勻，最終定容至50 mL。20 min后顯色，利用分光光度計于578 nm波長處比色測定。脲酶活性以24 h后1 g土壤中生成氨的毫克數(shù)表示。

蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定。方法如下：稱取0.4 g的冷凍干燥土樣，注入15 mL 8%蔗糖溶液，5 mL磷酸緩沖液(pH 5.5)和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。吸取濾液0.5 mL至容量瓶中，加3 mL DNS試劑，搖勻后，在沸騰的水浴鍋中加熱5 min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3 min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至50 mL。在分光光度計上于508 nm處進行比色。蔗糖酶活性以24 h，1 g土樣生成葡萄糖的毫克數(shù)表示。

過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測定。稱0.5 g的冷凍干燥土樣，加入40 mL蒸餾水，加5 mL 0.3%的H2O2溶液，震蕩20 min后，加入5 mL 3 mol/L硫酸溶液，吸取濾液25 mL，用0.1 mol/L高錳酸鉀溶液滴定至淡粉色，過氧化氫酶活性以1 min內1 g土壤消耗的高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。

中性磷酸酶的測定方法如下：稱2 g土樣，加5滴甲苯和20 mL 0.5%磷酸苯二鈉溶液(檸檬酸鹽緩沖液)，仔細搖勻后放入恒溫箱，于37 ℃下培養(yǎng)24 h。然后在培養(yǎng)液加入40 mL 0.3%硫酸鋁溶液并過濾。吸取10 mL濾液于50 mL容量瓶中，稀釋定容，最后，于分光光度計上660 nm處比色。中性磷酸酶活性以24 h后1 g土壤中釋放的酚的毫克數(shù)表示。

1.4 基于高通量測序法的細菌群落結構分析

從土壤中提取的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。本研究選擇長度為450 bp的細菌16S rRNA的高度可變V3V4區(qū)域進行測序。用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)作為16S rRNA基因的細菌特異性片段。PCR條件由最初在變性步驟為98 ℃(30 s)。緊隨其后的是27個周期以下步驟：98 ℃(15 s)、50 ℃(30 s)、72 ℃(30 s)。在72 ℃保持5 min，最后在4 ℃退火10 min。每個樣本進行了一式三份，然后把它們混合在一起。2%瓊脂糖凝膠電泳擴增結果，用Axygen凝膠回收試劑盒對目標片段進行切割回收。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測試劑盒對Microplate reader(BioTek, FLx800)上的PCR產(chǎn)物進行定量，然后根據(jù)每個樣品所需的數(shù)據(jù)量混合樣品。取1 μL文庫，在Agilent Bioanalyzer機器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫做2100質檢，合格的文庫應該有單一的峰，無接頭。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對文庫進行定量，合格的文庫計算后濃度應在2 nmol/L以上。對合格的文庫，我們在MiSeq機器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進行2×300 bp的雙端測序。首先將需要上機的文庫(Index不可重復)梯度稀釋到2 nmol/L，然后按所需數(shù)據(jù)量比例混樣?；旌玫奈膸旖?jīng)0.1 mol/L NaOH變性成單鏈進行上機測序。所上文庫量的多少可根據(jù)實際情況控制在15～18 pmol/L之間。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22.0進行統(tǒng)計分析。差異的統(tǒng)計學意義通過單因素方差分析(ANOVA)和Tukey post-hoc檢驗確定。采用單因素方差分析(ANOVA)的置信區(qū)間為95%，P<0.05為差異達到顯著性水平。利用Canoco 5.0軟件對考察環(huán)境因子對酶活性和微生物群落組成影響進行了冗余分析(RDA)。使用QIIME軟件，對UniFrac PCoA分析得到基于微生物系統(tǒng)發(fā)育關系的群落樣本空間分布特征，量化樣本間的差異和相似度。采用Weighted UniFrac距離側重描述由群落成員豐度梯度的改變導致的樣本差異。

2 結果與討論

2.1 生物炭的基本理化性質

生物炭的元素組成和原子比見下表。隨著熱解溫度的升高，生物炭中碳(C)含量均有所增加，但氫(H)和氧(O)含量降低。相比之下，生物炭中的N含量因原料來源和熱解溫度而發(fā)生變化，但是無明顯的規(guī)律性。H是主要與植物有機質有關的，因此，生物炭的炭化程度可以通過H/C原子比來估算[11]。生物炭的H/C比值隨熱解溫度的升高而降低，說明生物炭中原始有機質組分減少，并且生物炭的炭化程度提高。(O+N)/C比值降低表明極性基團數(shù)量的減少[11]。隨著熱解溫度的升高，生物炭中的灰分含量增加。比表面積分析結果表明，隨著熱解溫度的升高，比表面積(SA值)增大。特別是600 ℃下制備的生物炭具有大的比表面積，其SA值大于200 m2/g，表明具有較多微孔結構的存在。

表 生物炭的基本理化性質Tab. Physical and chemical properties of biochar

2.2 生物炭對土壤性質的影響

圖1給出了生物炭對土壤性質(pH、SOM和CEC)的影響。與對照組相比，生物炭(除了WS6之外)未能顯著改變土壤pH(P>0.05)。一方面，生物炭的施用量較少，不足以對弱堿性土壤產(chǎn)生較大影響[12]；另一方面，生物炭的pH均調至近中性。生物炭(除CS6、WS4和WS6外)通常增加土壤SOM含量達7%～26%，但是其差異不顯著(P>0.05)。其他報道中也得到了類似的結果[7,13-14]。生物炭(除了CC2和CC6外)降低了土壤CEC，盡管此差異并不顯著(P>0.05)。此發(fā)現(xiàn)不同于先前的研究[13]，它報道了生物炭顯著增加土壤CEC值。造成不同結果的原因可能是由于土壤中含有雞糞堆肥[15]。

圖1 生物炭對土壤pH，土壤有機質(SOM)和陽離子交換量(CEC)的影響Fig.1 The effects of biochars on soil pH, soil organic matter (SOM), and cationic exchange capacity (CEC)

圖2給出了生物炭對土壤中營養(yǎng)元素的影響。與對照組相比，生物炭對土壤TN幾乎沒有影響。

圖2 生物炭對土壤營養(yǎng)元素的影響Fig.2 The effects of biochars on soil nutrients

相反的是，它略微降低了土壤的速效氮(AN)含量(除UCC4、UCS2和UCS6之外)，盡管差異并不顯著(P>0.05)。此結果與之前的研究相一致[16]。對于P來說，CS6、WS2和WS6對土壤TP略有增加，而其他的生物炭則稍微降低了土壤TP含量；生物炭通常減少了土壤中速效磷(AP)的含量，這不同于我們先前的研究[16]。出現(xiàn)這種矛盾的原因可能是本研究的土壤中含有雞糞堆肥造成的。堆肥中含有的P含量一般高于生物炭[5,9]。就土壤C/N而言，CC2、CC4、CS4和WS6增加了土壤C/N比，盡管這個差異不顯著(P>0.05)，而其他的生物炭則對土壤C/N幾乎沒有影響。土壤C/N比增加可能是由于生物炭本身具有較高的C/N比[5]。

2.3 生物炭對土壤酶活性的影響

圖3給出了生物炭對土壤酶活性(蔗糖酶、脲酶、中性磷酸酶和過氧化氫酶)的影響。與對照組相比，生物炭(除了CS4、CC6和WS4外)降低了土壤的蔗糖酶活性，雖然此差異不明顯(P>0.05)。類似地，生物炭降低了土壤中性磷酸酶的活性，UCS2、UCS4、UWS2和UWS6處理的土樣中，其結果差異較顯著(P>0.05)。不同于前兩種酶，生物炭(除WS2外)略微增強了脲酶活性，盡管這個差異沒有顯著性(P>0.05)。先前也有研究報道生物炭處理的土壤，其蔗糖酶活性隨時間的推移而降低，而對脲酶來說，則是剛開始具有增強作用，然后逐漸抑制其活性[17]。生物炭對土壤過氧化氫酶活性幾乎沒有影響(P>0.05)。此結果不同于原先的研究，它報道生物炭可以增強土壤過氧化氫酶活性[18]。有研究報道酶活性與生物炭的H/C原子比之間具有顯著的正相關關系，而與其表面積呈現(xiàn)明顯的負相關性[18]。然而，本研究中冗余(RDA)結果表明(圖4)，生物炭的H/C比與酶活性(除了蔗糖酶)之間呈現(xiàn)強烈的負相關關系，而生物炭的pH、電導率(EC)、SA對土壤脲酶和中性磷酸酶活性具有促進作用。這些不同結果表明土壤中添加生物炭，對其酶活性具有不同的影響。RDA中生物炭處理組與CK組的距離較遠，進一步說明生物炭對土壤中酶活性具有影響。不同生物炭處理組也較為分散，這一結果表明生物炭的差異包括原料來源和熱解溫度對土壤中酶活性的影響不同。

圖3 生物炭對土壤中酶活性的影響Fig.3 The effects of biochars on enzyme activities in soil

圖4 冗余分析生物炭和土壤性質對酶活性的影響Fig.4 Redundancy analysis (RDA) for the effects of biochars and soil properties on enzyme activities in soil

2.4 生物炭對細菌豐度和多樣性指數(shù)的影響

細菌的豐度主要用Chao1和ACE指數(shù)描述。細菌多樣性(均勻度)主要用Shannon和Simpson指數(shù)來描述。與對照組相比(Chao1：3232；ACE：3384)，CC2略有增加Chao1(3278)和ACE(3443)，而其他生物炭普遍減少Chao1(2407～3183，除了WS6)和ACE(3167～3317)。其中CS4使得Chao1和ACE，分別顯著降低了25%和28%。與豐度指數(shù)不同，生物炭對Shannon和Simpson指數(shù)的影響不明顯。這些結果表明，除CC2外，生物炭對土壤中細菌的豐度具有負面影響，對土壤中細菌的多樣性影響不大。Xu等[17]也報道了生物炭在實驗結束時降低了水稻土壤中的細菌豐度。然而，在他們的研究中，生物炭增加了細菌的多樣性，這與本研究的結果不同。Zheng等[8]也報道了生物炭增加了水稻土壤中的細菌多樣性。導致差異的原因很可能與這些研究中不同的生物炭和土壤特性有關。

基于Weighted Unifrac距離進行PCoA分析結果表明(圖5)，PC1和PC2兩個軸分別解釋了48.7%和23.4%的細菌群落變化。不同生物炭處理組在PC1軸上的投影均與對照組在PC1軸上的投影具有一定的距離，表明生物炭對土壤中微生物群落結構產(chǎn)生影響。玉米秸稈(CS)生物炭處理組與核桃殼(WS)生物炭處理組在PC1軸上的投影比較接近，而玉米軸(CC)生物炭處理組在PC1軸上的投影距離較遠。這一結果表明，玉米秸稈和核桃殼生物炭對土壤中微生物群落結構的影響程度更為接近，而與玉米軸(CC)生物炭處理土壤中微生物群落結構相差較大。除了UCC4，其余生物炭處理組在PC2軸上的投影較為接近。這些結果表明生物炭的原料來源是影響微生物群落結構的關鍵因素，而生物炭的熱解溫度對細菌群落結構的影響較小。

圖5 不同處理組微生物群落結構的主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis of microbial community structures in different treatment groups

2.5 生物炭對土壤中細菌組成的影響

許多研究表明，生物炭可以改變微生物群落組成，從而影響土壤中污染物的生物降解[19～21]。為了研究生物炭對細菌群落組成的影響，對門級優(yōu)勢菌進行了分析(圖6)。放線菌在對照和經(jīng)生物炭處理的土壤中都是優(yōu)勢門，占37%～46%。放線菌屬革蘭氏陽性菌，已知在分解纖維素、甲殼素等難降解有機化合物方面發(fā)揮重要作用[8,20]。其次是變形桿菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，分別占20%～22%、11%～15%和10%～11%。其他細菌門低于10%。與對照組相比，除CC2和CC4外，生物炭處理的土壤中，其放線菌豐度略有下降，降幅為5%～15%。我們的結果與Ali等[20]的研究結果相反。Ali等[20]的研究顯示，生物炭顯著增加了高農(nóng)藥污染農(nóng)業(yè)土壤中的放線菌的豐度。然而，我們的結果與Zheng等[8]報道的結果一致，這一發(fā)現(xiàn)歸因于較低的土壤有機質降解率，以及隨后較慢的有機碳轉化率。一般情況下，在生物炭處理的土壤中，伴隨著放線菌的抑制，變形桿菌、酸桿菌和芽單胞菌的豐度略有增加。這一結果表明，生物炭為大多數(shù)細菌提供了良好的生境[9,22]。

圖6 生物炭對土壤中門級細菌群落結構的影響Fig.6 Effects of biochars on bacterial composition at phylum level

2.6 環(huán)境變量與微生物群落組成之間的關系

采用冗余分析法(RDA)來研究生物炭和土壤性質對其混合土壤中微生物群落結構在門水平上的影響。RDA結果顯示(圖7)，RDA的前兩個軸分別表明總變異量的68.37%和19.84%。芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、酸桿菌門和浮霉菌門與生物炭的灰分之間具有正相關性。其他研究也有報道生物炭對酸桿菌門和芽單胞菌門具有相似的影響[17]。生物炭與這些細菌之間的相似關系可能是由于協(xié)同效應[20]。有研究報道酸桿菌門和芽單胞菌門不依賴于生物炭的可利用基質，而與生物炭所提供的適宜生境有關[17,22]。生物炭的灰分中含有Ca2+、Mg2+、K+和P等營養(yǎng)元素，能夠為特定的細菌提供營養(yǎng)物質[23-24]。然而，生物炭中的灰分與放線菌門和厚壁菌門均具有顯著的負相關關系，表明生物炭中的灰分不利于這兩類細菌的生長。變形菌門與土壤中的總氮和可利用氮具有正相關關系。以往的研究已經(jīng)證實了變形菌門的豐度與土壤中有機氮的礦化具有緊密的關系[25]。擬桿菌門與生物炭的(O+N)/C和H/C具有正相關性，表明較低溫度下制備的生物炭能夠為擬桿菌門微生物提供較好的生長環(huán)境。綠彎菌門能夠促進含氯有機物的脫氯反應[26]。生物炭比表面積與綠彎菌門豐度具有正相

圖7 生物炭和土壤性質對微 生物群落結構影響的冗余分析(RDA)Fig.7 Redundancy analysis for the effects of biochar and soil properties on microbial community structures

關關系，這可能是因為生物炭較大的比表面積為綠彎菌門的生長提供了庇護所。以往的研究已經(jīng)報道了某些微生物可以通過以生物炭的孔隙為棲息地來對抗捕食者或競爭對手的威脅，從而使自身受到更好的保護[5]。厚壁菌門和放線菌門與芽單胞菌門、硝化螺旋菌門和酸桿菌門之間具有顯著的負相關關系。變形菌門與浮霉菌門和綠彎菌門之間呈現(xiàn)顯著的負相關性。這些結果表明，土壤中微生物之間具有相互促進(正相關關系)或者相互制約(負相關關系)的關系。

3 結 論

本研究考察不同生物炭對農(nóng)田土壤酶活性和細菌群落結構的影響。結果表明：生物炭對土壤酶活性的影響主要與酶的種類有關；生物炭通常降低了土壤中細菌的豐度，而對細菌多樣性影響較小；與對照組相比，生物炭(除了玉米軸生物炭)使放線菌豐度降低了5%～15%，伴隨著放線菌的減少，變形桿菌、酸桿菌和芽單胞菌的豐度略有增加，表明生物炭改變了土壤中的細菌群落結構。冗余分析(RDA)結果表明，門級細菌群落豐度對生物炭和土壤性質的響應與細菌類型有關。盡管大多數(shù)研究表明生物炭能夠刺激微生物的生長，但是本研究的結果表明生物炭對微生物群落結構的影響受到生物炭類型和微生物類型的影響。因此，在生物炭應用于農(nóng)田土壤時，應充分考慮生物炭對土壤生態(tài)學的影響。