紫色百香果果皮多酚存在形式及抗氧化活性

譚敏華，廖志強(qiáng)，馮衛(wèi)華，于立梅，陳海光

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225）

百香果又稱西番蓮，有紫果和黃果兩大類，主要集中在巴西、秘魯、智利等地[1]。我國對于百香果的引入已有多年的歷史，在國內(nèi)多個地方都有栽培[2]。目前我國對于百香果的研究主要集中在果肉，而對其果皮的研究比較少[3]。百香果果皮占鮮果重的二分之一，所占比例較大，常造成百香果廢棄果皮資源和環(huán)境污染等問題[4]。

多酚化合物含有一個或多個羥基基團(tuán)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，是百香果中含量最多的生物活性成分[5]。有研究表明，百香果果皮含有多種酚類、生氰和多糖等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)與心血管疾病、高血糖和神經(jīng)性疾病有關(guān)[6-8]。百香果具有抗焦慮、抗氧化和降壓等作用，但其內(nèi)在作用機(jī)理尚不明確[9-13]。試驗(yàn)采用兩項(xiàng)溶劑萃取的方法對干燥的百香果果皮進(jìn)行提取，并對所制備的樣品進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為百香果果皮的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色百香果：產(chǎn)自廣西桂林。

1，1-二苯基-2-苦基肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、無水硫酸鈉、鄰菲羅啉、無水乙醇、硫酸亞鐵、Folin酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸乙酯、無水乙醚、三吡啶基三嗪（tripyridytriazine，TPTZ）、丙酮、氫氧化鈉、抗壞血酸、無水碳酸鈉、六水三氯化鐵、甲醇、結(jié)晶乙酸鈉、正己烷、冰醋酸、濃鹽酸、過氧化氫：廣州一馬生物有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140電熱恒溫干燥箱：上海市百典儀器廠；JJ500電子天平：天津市順諾儀器科技有限公司；DZW-8恒溫水浴鍋：北京眾星偉業(yè)儀器有限公司；MJ-BL25B2粉碎機(jī)：美的集團(tuán)有限公司；XHRE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州豫華儀器制造有限公司；GENEX pH計：上海寶予德科學(xué)儀器有限公司；CXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

選擇大小均勻、無機(jī)械損傷和病蟲害的百香果，取百香果果皮于50℃恒溫烘箱中干燥36 h，使用粉碎機(jī)粉碎后密封于常溫（25℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多酚化合物的提取

1.3.2.1 游離態(tài)多酚的提取

參考Krygier等[14]和肖星凝等[15]的方法并稍作修改。取10.0 g百香果果皮粉末用甲醇、丙酮和水提取液（體積比 7∶7∶6）于常溫（25℃）暗處反應(yīng)，重復(fù) 5 次，抽濾，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃濃縮，所得濃縮濾液用6 mol/L HCl調(diào)pH值至2，抽濾。所得濾液與正己烷按體積比1∶1混合萃取5次，去掉正己烷相，剩下的水相用乙酸乙酯和無水乙醚按體積比1∶1混合，萃取5次，加入無水硫酸鈉，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30℃濃縮干燥，最后加入甲醇定容至25 mL，得到游離態(tài)多酚。

1.3.2.2 酯化態(tài)多酚的提取

將上述抽濾后的殘渣與無水乙醚和乙酸乙酯萃取后的水相混合，加入4 mol/L NaOH避光反應(yīng)4 h并用6 mol/L HCl調(diào)pH值至2，抽濾。所得濾液與正己烷按體積比1∶1混合萃取5次，去掉正己烷相，剩下的水相用乙酸乙酯和無水乙醚按體積比1∶1∶1混合萃取5次，加入無水硫酸鈉，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30℃濃縮干燥，最后加入甲醇定容至25 mL，得到酯化態(tài)多酚。

1.3.2.3 結(jié)合態(tài)多酚的提取

將上述抽濾后的濾渣加入50 mL 4mol/L NaOH避光反應(yīng)4 h,并用6 mol/L HCl調(diào)pH值至2，抽濾。所得濾液與正己烷按體積比1∶1混合萃取5次，去掉正己烷相，剩下的水相用乙酸乙酯和無水乙醚按體積比1∶1∶1混合萃取5次，加入無水硫酸鈉，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀30℃濃縮干燥，最后加入甲醇定容至25 mL，得到結(jié)合態(tài)多酚。

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，將試驗(yàn)得到的3種形式百香果果皮多酚在-20℃密封儲存。

1.3.3 多酚化合物含量的測定

參考 Singleton VL[16]、尚紅梅等[17]和馬士巧等[18]的方法并稍作修改。以沒食子酸（gallic acid）為標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.008 3x+0.003 2（R2=0.998 9），將標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的結(jié)果換算為每克樣品（干質(zhì)量）中所含的多酚相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)，結(jié)果表示為mgGAE/gDW。

1.3.4 體外抗氧化活性測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

參照齊高強(qiáng)等[19]的方法并稍作修改。取0.2 mL百香果果皮提取液，加入4mL 0.1 mmol/L DPPH溶液在常溫（25℃）避光反應(yīng)，從0～1h每隔10min測1次517nm的吸光度A1。以甲醇作為對照，測517nm的吸光度A2。以無水乙醇為空白。DPPH·清除率按如下公式計算。

1.3.4.2 鐵離子還原能力測定

參照楊希娟等[20]的方法并稍作修改。取1 mL TPTZ（10 mmol/L）、1 mL FeCl3·6H2O（20 mmol/L）和 10 mL pH3.6醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L）充分混勻得到鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）溶液，在37℃恒溫鍋中貯藏備用。取3.6 mL FRAP溶液加入0.36 mL蒸餾水和0.12 mL百香果果皮提取液，充分混合后于37℃水浴鍋中避光放置，以蒸餾水代替百香果果皮提取液為空白，從0～1 h每隔10 min測1次593 nm的吸光度。以FeSO4·7H2O為標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.007 2x+0.065 9（R2=0.999 9），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算硫酸亞鐵的濃度（mmol/L）。

1.3.4.3 ·OH清除能力測定

參考周淑儀等[21]的方法。取1 mL鄰菲羅啉溶液（1.865 mmol/L）加入1 mL百香果果皮提取液和2 mL pH7.4磷酸鹽緩沖液，混合后加入1 mL FeSO4溶液（1.865 mmol/L），再次混合后加入1 mL 0.03%的H2O2，在37℃恒溫鍋中反應(yīng)1 h，測536 nm的吸光度A樣。用甲醇代替百香果果皮提取液，測536 nm的吸光度A損。以甲醇代替百香果果皮提取液、蒸餾水代替H2O2為空白，測536 nm的吸光度A空?！H清除率按如下公式計算。

1.4 百香果果皮中多酚化合物組成的檢測

采用電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spe-ctrometry，ESI-MS）檢測百香果果皮中多酚化合物的組成。

質(zhì)譜條件：采用ESI源，負(fù)離子模式，離子掃描范圍：100 m/z～800 m/z；霧化氣壓力：0.28 MPa；干燥氣流速：10.00 L/min；干燥氣溫度：350℃；最大累計時間：200ms；碰撞誘導(dǎo)解離的MS/MS誘導(dǎo)碰撞能量為1.0 V。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均平行3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2010進(jìn)行繪圖；采用SPSS 19.0中單因素方差分析（one-way ANOVA）和鄧肯式多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果果皮中多酚化合物含量

百香果果皮中3種形態(tài)多酚含量見圖1。

圖1 百香果果皮中3種形態(tài)多酚含量Fig.1 Contents of three polyphenols in passion fruit peel

由圖1可知，百香果果皮中游離態(tài)多酚含量最高，為0.641 3 mg GAE/g DW，占總酚的48.45%；酯化酚含量次之，為0.529 0 mg GAE/g DW，占總酚的39.97%；結(jié)合酚含量最少，為0.153 3 mg GAE/g DW，占總酚的11.58%；結(jié)果表明百香果果皮中3種不同形式多酚含量差異極顯著（p＜0.01）。由此可見，百香果果皮中多酚主要為游離酚和酯化酚。

2.2 百香果果皮中多酚的抗氧化能力分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力分析

百香果果皮中3種形態(tài)多酚和混合酚清除DPPH·的動力學(xué)反應(yīng)見圖2，游離酚、酯化酚、結(jié)合酚、混合酚和VC的DPPH·清除能力見圖3。

圖2 百香果果皮中3種形態(tài)多酚和混合酚清除DPPH·的動力學(xué)反應(yīng)Fig.2 Reaction of dynamics of scavenging DPPH free radicals by free phenol，esterified phenol，bound phenol and mixed phenol in passion fruit peel

圖3 百香果果皮中游離酚、酯化酚、結(jié)合酚、混合酚和VC的DPPH·清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of free phenol，esterified phenol，bound phenol，mixed phenol and VCin passion fruit peel

混合酚提取液為等濃度等體積的游離酚、酯化酚和結(jié)合酚提取液的混合液。試驗(yàn)所用各樣品的濃度均為92μg/mL。由圖2可知，百香果果皮中游離酚、酯化酚、結(jié)合酚和混合酚的吸光度隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸減少。樣品中的吸光度越小，說明樣品中的DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。DPPH·清除率隨著反應(yīng)時間的延長而升高，反應(yīng)時間到50 min基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。由圖3可知，百香果果皮中游離酚、酯化酚、結(jié)合酚和混合酚提取液的DPPH·清除率與VC相比差異極顯著（p＜0.01）。相同濃度的5種樣液的DPPH·清除率為VC＞游離酚＞酯化酚＞混合酚＞結(jié)合酚。結(jié)果表明百香果果皮中游離酚和酯化酚的DPPH·清除能力較強(qiáng)。

2.2.2 鐵離子還原能力分析

百香果果皮中游離酚、酯化酚、結(jié)合酚和混合酚FRAP值的動力學(xué)反應(yīng)見圖4，游離酚、結(jié)合酚、酯化酚、混合酚和VC的鐵離子還原能力見圖5。

圖4 百香果果皮中游離酚、酯化酚、結(jié)合酚和混合酚FRAP值的動力學(xué)反應(yīng)Fig.4 Reaction of dynamics of FRAF value of free phenol，esterified phenol，bound phenol and mixed phenol in passion fruit peel

圖5 百香果果皮中游離酚、結(jié)合酚、酯化酚、混合酚和VC的鐵離子還原能力Fig.5 Iron ion reduction ability of free phenol，bound phenol，esterified phenol，mixed phenol and VCin passion fruit peel

由圖4可知，百香果果皮中游離酚、酯化酚、結(jié)合酚和混合酚的吸光度隨著反應(yīng)時間的延長而增加。樣品中的吸光度越大，說明樣品中的鐵離子還原能力越強(qiáng)。FRAP值隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸增大，反應(yīng)時間到50 min基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。由圖5可知，百香果果皮游離酚、酯化酚、結(jié)合酚和混合酚提取液的鐵離子還原能力與VC相比差異極顯著（p＜0.01）。相同濃度的5種樣液的鐵離子還原能力為游離酚＞混合酚＞酯化酚＞結(jié)合酚＞VC。結(jié)果表明百香果果皮多酚中游離酚和酯化酚的鐵離子還原能力較強(qiáng)。

2.2.3 羥基自由基清除能力分析

百香果果皮中游離酚、結(jié)合酚、酯化酚、混合酚和VC的·OH清除能力見圖6。

圖6 百香果果皮中游離酚、結(jié)合酚、酯化酚、混合酚和VC的·OH清除能力Fig.6 ·OH scavenging ability of free phenol，bound phenol，esterified phenol，mixed phenol and VCin passion fruit peel

由圖6可知，百香果果皮酯化酚、結(jié)合酚和混合酚提取液的羥基自由基清除能力與VC相比差異極顯著（p＜0.01）。相同濃度的5種樣液的·OH清除率為VC＞游離酚＞酯化酚＞結(jié)合酚＞混合酚。結(jié)果表明百香果果皮多酚中游離酚和酯化酚的羥基自由基清除能力較強(qiáng)。

通過查閱資料可知，評定一個樣品的抗氧化活性至少需要兩種方法進(jìn)行綜合評定[22-23]。本文通過測定百香果果皮提取液的DPPH·清除能力、FRAP值及·OH清除能力3個指標(biāo)，綜合評定百香果果皮的抗氧化性，結(jié)果表明百香果果皮中游離酚的3個指標(biāo)均比酯化酚高，結(jié)合酚最低。綜上所述，百香果果皮中不同形式多酚的抗氧化能力大小為游離酚＞酯化酚＞結(jié)合酚。

2.3 百香果果皮中游離酚、酯化酚和結(jié)合酚的組分分析

百香果果皮中3種形態(tài)多酚的ESI-MS圖譜見圖7，3種形態(tài)多酚的質(zhì)譜特征見表1。

圖7 百香果果皮游離酚、酯化酚及結(jié)合酚的ESI-MS圖譜Fig.7 ESI-MS spectra of passion phenol，esterified phenol and bound phenol

表1 百香果果皮游離酚、酯化酚和結(jié)合酚的質(zhì)譜特征Table 1 Mass spectral characteristics of free phenol，esterified phenol and bound phenol in passion fruit peel

由圖7可知，百香果果皮游離酚種類豐富，酯化酚、結(jié)合酚種類較少。由表1可知，百香果果皮中游離酚共檢測出5種物質(zhì)，相對分子質(zhì)量分別為158、398、541、660、815，酯化酚檢測出3種物質(zhì)，相對分子質(zhì)量為281、465、581，結(jié)合酚檢測出3種物質(zhì)，相對分子質(zhì)量分別為195、303、581。由此可得出，百香果果皮中酯化酚和結(jié)合酚都檢測出相對分子質(zhì)量為581這個物質(zhì)。綜上所述，百香果果皮中3種形式多酚在種類和組分上存在著很大的差異。

3 結(jié)論

從百香果果皮中提取游離態(tài)、酯化態(tài)及結(jié)合態(tài)3種形態(tài)多酚，分別測定多酚含量和體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)百香果果皮中游離酚、酯化酚和結(jié)合酚的含量分別為 0.641 3、0.529 0、0.153 3 mg GAE/g DW，不同存在形式百香果果皮多酚的含量表現(xiàn)為游離酚＞酯化酚＞結(jié)合酚；百香果果皮中游離酚、酯化酚和結(jié)合酚的DPPH·清除率和FRAP值均與反應(yīng)時間成正比，反應(yīng)時間到50 min時達(dá)到穩(wěn)態(tài)；不同存在形式百香果果皮多酚的抗氧化能力大小表現(xiàn)為游離酚＞酯化酚＞結(jié)合酚。同時，通過對3種形式多酚進(jìn)行成分分析，表明百香果果皮中3種形式多酚在種類和組分上存在著很大的差異。