HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測試劑性能評價

劉紅敏

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒(HBV)，是目前已知的感染人的最小DNA病毒之一，直徑只有頭發(fā)絲的1/40 000，而它也是最難治愈的病毒之一[1,2]。HHBV雖然是一個雙鏈DNA病毒，但和身為RNA的艾滋病毒(HIV)一樣，其復(fù)制存在著逆轉(zhuǎn)錄的過程，使得病毒基因組可以被整合到機(jī)體中，使得機(jī)體難以將病毒徹底清除，成為潛在致癌的隱患；另外HBV在進(jìn)入肝細(xì)胞后可以轉(zhuǎn)化成cccDNA，并長期潛伏在細(xì)胞核中，具有很強(qiáng)的隱蔽性，即使抗病毒治療也難以徹底清除；而一旦患者長期使用免疫抑制劑或化療、放療導(dǎo)致機(jī)免疫力低下，cccDNA則會跳出轉(zhuǎn)入活躍的復(fù)制狀態(tài)，使得HBV感染長期持續(xù)性存在。因此，HBV在目前醫(yī)療水平上，是一個可以控制但不能徹底清除的病毒[3]。HBV-DNA的檢測和監(jiān)測在預(yù)防和乙型肝炎患者的治療過程中非常重要。參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會頒布的EP系列文[4,5]件及《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[6]和《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》[7]，從精密度、正確度、檢測限(定量檢測下限)、線性范圍分析性能標(biāo)準(zhǔn)操作來評價和評估我們實驗室檢測乙型肝炎病毒的檢測系統(tǒng)[8]。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與檢測試劑 擴(kuò)增儀為美國ABI StepOnePlus；加樣器為賽默飛醫(yī)療器械有限公司提供；高速冷凍離心機(jī)來自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司；檢測試劑盒為艾康生物有限公司提供。

1.2 實驗樣本選擇 精密度實驗所用定值陽性樣本為故城縣醫(yī)院核酸實驗室收集的高濃度的陽性標(biāo)本的混合物，正確度所用參考物質(zhì)為2020年衛(wèi)生部臨檢中心核酸病毒學(xué)室間質(zhì)評標(biāo)本。稀釋用血清為陰性血清(HBV-DNA,HIV,HCV,TP等感染性疾病篩查均為陰性)，且該陰性血清無脂血溶血等異常情況。

1.3 檢測原理 試劑盒選用乙型肝炎病毒保守基因片段設(shè)計特異引物及特異Taqman探針，該探針能與引物擴(kuò)增區(qū)域中間的一段DNA模板發(fā)生特異性結(jié)合，PCR延伸反應(yīng)中，Taq酶的外切酶活性將5’端熒光基團(tuán)從探針上切割下來，使之游離于反應(yīng)體系中，從而脫離了3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，即能接受光刺激而發(fā)出可供儀器檢測的熒光，從而實現(xiàn)在全封閉反應(yīng)體系中對乙型肝炎病毒核酸的全自動化檢測。試劑盒中使用內(nèi)質(zhì)控體系，能夠有效防止假陰性，同時也使用UNG+dUTP防污染措施，能夠有效排除假陽性結(jié)果。

1.4 檢測方法 取待測樣本(血清)，陰陽性質(zhì)控品，定量標(biāo)準(zhǔn)品各200 μl，分別加入200 μl核酸提取液1’振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min；棄上清350 μl，留50 μl；加入50 μl核酸提取液2(內(nèi)含固體沉淀顆粒物，為使顆粒均勻分布，每次取樣時請用吸頭反復(fù)吸打)；加入4 μl乙型肝炎病毒內(nèi)標(biāo)模板，振蕩混勻，100℃水浴或干浴10 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清20 μl加入到20 μl反應(yīng)混合液(HBV反應(yīng)混合液19.5 μl+0.5 μl Taq酶)中，蓋緊反應(yīng)管蓋，轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增檢測區(qū)。將各反應(yīng)管按一定順序放入PCR擴(kuò)增儀上，按擴(kuò)增程序：25℃ 10 min，95℃ 3 min，(94℃ 15 s，58℃ 30 s)45個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性質(zhì)控CT值無數(shù)據(jù)；標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)達(dá)到0.980以上；閾值線以上的熒光曲線應(yīng)當(dāng)是具有明顯S型曲線，否則實驗視為無效，應(yīng)當(dāng)檢查儀器，試劑，擴(kuò)增條件等方面的誤差。

1.5 評估方法 依照《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》等相關(guān)文件及相關(guān)操作規(guī)范中的方法作精密度，正確度，檢測限，線性范圍等的評估檢測。

1.5.1 精密度評估:常用相對偏差(RSD=S/X×100%)表示精密度。批內(nèi)精密度：將準(zhǔn)備好的高濃度和低濃度的陽性定值樣本在同批試劑中分別進(jìn)行20次重復(fù)測定(正向和逆向分別10次)，分別統(tǒng)計2種濃度樣本檢測值(濃度對數(shù)值)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，再計算批內(nèi)相對偏差。批間精密度：將高濃度和低濃度的陽性定值樣本分別進(jìn)行4次重復(fù)測定，連續(xù)檢測5 d，可得到40個數(shù)據(jù)，統(tǒng)計樣本檢測值(濃度對數(shù)值)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，再計算批間相對偏差。判斷標(biāo)準(zhǔn)為RSD<5%。

1.5.2 準(zhǔn)確度評估:準(zhǔn)確度是指在一定的條件下多次測定的平均值與真值相符合的程度，用來衡量系統(tǒng)誤差的指標(biāo)。選用衛(wèi)生部臨檢中2020第一次核酸檢測(病毒學(xué))室間質(zhì)評樣本作為參考品進(jìn)行測定，檢測結(jié)果值與給的靶值和上下限進(jìn)行對比，HBV-DNA檢測結(jié)果與靶值的偏差<±0.4對數(shù)值。即評價結(jié)果成績≥80%，正確度的驗證判定為通過。

1.5.3 檢測限評估:檢測限是指樣品中分析物的最小量，可以在規(guī)定的可能性條件下予以檢出[9]。將陽性定值樣本稀釋至200 U/ml(對數(shù)值為2.3)。重復(fù)檢測20次看是否符合《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》中檢出限的要求(重復(fù)測定20次，按95%的置信限下限，測定為陽性的次數(shù)應(yīng)≥17次)。

1.5.4 線性范圍評估:線性范圍(臨床可報告范圍)是指陽性定值樣本經(jīng)過稀釋或其他預(yù)處理的方式而間接獲得的分析物值的范圍。將高濃度陽性定值樣本進(jìn)行系列梯度稀釋至200 U/ml，對高濃度樣本和稀釋后的樣本進(jìn)行同批次檢測，每個樣本重復(fù)檢測3次，計算相關(guān)系數(shù)R2，如果R2>0.98，則線性范圍評估通過。

1.5.5 實驗過程需要注意事項:實驗過程中嚴(yán)格按照廠商標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)，每次實驗均應(yīng)按照室內(nèi)質(zhì)量控制程序進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，室內(nèi)質(zhì)控在控時，所做的實驗數(shù)據(jù)才可以采用，如出現(xiàn)失控數(shù)據(jù)，則要及時找出原因并予以糾正，重新進(jìn)行檢測[10,11]。實驗樣本要穩(wěn)定，其基質(zhì)組成應(yīng)盡可能與臨床樣本相似。實驗樣品的濃度盡可能選擇與廠商申明性能相近的濃度或接近該項目醫(yī)學(xué)決定水平的濃度[12]。通常選擇穩(wěn)定好的血清基質(zhì)的質(zhì)控物作為試驗品[13]。注意冰凍保存實驗樣品內(nèi)分析物的溫度性[14]。嚴(yán)格控制凍融的時間、混勻的操作手法。在正式實驗前，操作人員應(yīng)熟練掌握儀器的操作程序、校準(zhǔn)程序、保養(yǎng)程序以及檢測程序等，熟悉評價方案。為獲得準(zhǔn)確的測量結(jié)果，由同一操作員按相同的方法、使用相同的檢測設(shè)施、嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行操作[15]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時應(yīng)將濃度值轉(zhuǎn)化成對數(shù)值進(jìn)行計算，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件。進(jìn)行線性范圍驗證時，應(yīng)將實測值和理論值進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 精密度的評價結(jié)果 批內(nèi)相對偏差分別為1.27%和1.32%；批間相對偏差分別為1.6%和2.5%，均<5%。見表1。

表1 精密度評價

2.2 準(zhǔn)確度評估 參照2020年度國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心和河北省臨床檢驗中心核酸檢測(病毒學(xué))室間質(zhì)評結(jié)果。見表2、3。

表2 2020年全國臨床實驗室核酸檢測(病毒)室間質(zhì)評結(jié)果

2.3 檢測下限驗評估結(jié)果 將收集的高濃度臨床陽性標(biāo)本稀釋至200 U/ml，分別用同批次試劑重復(fù)檢測20次，實驗全部檢測出有效數(shù)據(jù)，檢測結(jié)果符合GB/T 37871-2019《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》中檢出限的要求，并且重復(fù)檢測結(jié)果間的系數(shù)CV<20%。見表4。

表3 2020年河北省室間質(zhì)評統(tǒng)計結(jié)果-臨床核酸檢測(病毒學(xué))

表4 檢測下限結(jié)果

2.4 線性范圍評估 將收集到的臨床高濃度樣本梯度稀釋至2.00E+02 U/ml，以檢測樣本的濃度對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，檢測樣本的CT值作為縱坐標(biāo)，得出樣本濃度對數(shù)值與CT值的相關(guān)系數(shù)R2為0.995；檢測樣本濃度對數(shù)值的實測值作為橫坐標(biāo)，預(yù)期濃度對數(shù)值作為縱坐標(biāo)，得出濃度對數(shù)值的實測值與預(yù)期濃度對數(shù)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.999。樣本實測值結(jié)果與預(yù)測值結(jié)果比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在2.00E+02-1.00E+07分析測量范圍線性關(guān)系良好(線性關(guān)系系數(shù)R2=0.99)。檢測結(jié)果符合GB/T 37871-2019《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》中線性范圍的要求：相關(guān)系數(shù)R2≥0.98。見圖1、2。

圖1 實測值與CT值散點

3 討論

乙型肝炎病毒具有頑強(qiáng)的抵抗力：對熱、低溫、干燥、紫外線、一般濃度的化學(xué)消毒劑都能夠耐受，但是HBV怕高熱，如加熱到100℃，只要10 min就可使其失去傳染性。乙型肝炎病毒有明顯的嗜肝性：它侵入人體后就要專門進(jìn)攻肝臟，鉆入肝細(xì)胞，在那兒定居并繁衍后代。大量乙型肝炎病毒集中在肝細(xì)胞內(nèi)，不斷地繁殖、復(fù)制，成熟的乙型肝炎病毒被釋放出肝細(xì)胞，又侵入別的健康的肝細(xì)胞，這樣不斷復(fù)制，不斷侵蝕，最后誘發(fā)肝細(xì)胞的免疫損傷[18]。乙型肝炎病毒攜帶者的感染幾乎都是在胎兒期或幼兒期感染乙型肝炎病毒的，經(jīng)過了十幾年乃至幾十年的感染歷程，乙型肝炎病毒仍然在他們體內(nèi)不消失，但也不發(fā)病。乙型肝炎病毒變異的特性給臨床診斷和治療帶來許多麻煩。癌變的原因可能是乙型肝炎病毒的X基因整合到肝細(xì)胞上，發(fā)生了突變，導(dǎo)致肝癌。早發(fā)現(xiàn)，早阻斷是預(yù)防感染乙型肝炎病毒的重要途徑，所以真實可靠的HBV-DNA檢測結(jié)果不僅是預(yù)防感染乙型肝炎病毒的關(guān)鍵也是監(jiān)測乙型肝炎患者治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)。檢測系統(tǒng)的性能驗證是檢驗工作中保證檢測質(zhì)量的前提。每個檢測項目都應(yīng)該有它自己的性能驗證方案。根據(jù)CANS-CL02-A009:2018《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》要求，性能驗證內(nèi)容至少包含精密度，正確度，檢測限，線性范圍等內(nèi)容[19]。

圖2 實測值與預(yù)期值散點圖

我們實驗室依據(jù)GB/T 37871-2019《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》及CANS-CL02-A009:2018《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》相關(guān)要求對我們實驗室所用乙型肝炎病毒核酸檢測系統(tǒng)的精密度，準(zhǔn)確度，檢測限及線性范圍進(jìn)行評估。評估結(jié)果顯示：高濃度定值陽性樣本E7(1.0E+07)和低濃度定值陽性樣本E3(1.0E+03)，同批次分別重復(fù)檢測20次，計算批內(nèi)精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27%和1.32%；高低濃度陽性樣本每天重復(fù)檢測4次，連續(xù)檢測5 d，計算批間精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.60%和2.50%。2020年度衛(wèi)生部臨檢中心核酸檢測(病毒學(xué))和河北省臨檢中心臨床核酸檢測HBV-DNA室間質(zhì)評我們實驗室均滿分通過。我們實驗室結(jié)合慢性乙型病毒性肝炎防治指南和我們實驗室所用試劑盒檢測限，實驗室設(shè)定HBV-DNA的檢測范圍為2.0*102～1.0*107，最低檢測下限為200 U/ml。將實驗室收集到的臨床高濃度陽性樣本稀釋至200 U/ml，重復(fù)檢測20次，結(jié)果均能被檢測出有效數(shù)據(jù)。再將高濃度陽性標(biāo)本倍比稀釋，計算得到線性相關(guān)系數(shù)R2=0.99，>0.98，現(xiàn)用檢測試劑測量范圍線性關(guān)系良好。

為保證檢測質(zhì)量，更好地為臨床為患者服務(wù)，任何檢測系統(tǒng)在使用前均應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)的性能驗證。特別是在醫(yī)學(xué)臨床檢驗中，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確與否直接影響到患者的健康，嚴(yán)重者會危害到患者生命，所以檢測系統(tǒng)的性能驗證在檢測工作中非常重要。臨床實驗室應(yīng)根據(jù)各自檢測項目的特點制訂一套有效可行的適合自己實驗室的性能驗證方案。