柚皮苷中藥單體調(diào)節(jié)miR-216a基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究

李永慧 王倩林 賈笑強 劉明成 李永芳

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴(yán)重危害人們生命健康[1]。目前結(jié)直腸癌的治療方法是手術(shù)、放化療及靶向治療的綜合治療，患者預(yù)后有顯著改善，但對于存在局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者，預(yù)后仍然很差[2]。因此，尋找有效的結(jié)直腸癌治療方法尤為重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種單鏈小分子RNA，長度約19～22nt，在生物體基因組廣泛存在，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[3,4]。miR-216a是miRNA家族成員，有研究顯示，結(jié)直腸癌中miR-216a表達(dá)降低，miR-216a-3p可直接靶向COX-2和ALOX5抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[5]。柚皮苷是一種主要存在于葡萄柚、柚子、酸橙等果皮和果肉中的天然黃酮類化合物，有抗氧化應(yīng)激、降血糖、抗炎、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性[6-8]。有研究顯示，柚皮苷對前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞生長有抑制作用[9,10]。結(jié)直腸癌中柚皮苷的研究較少，有研究顯示，在化療模型小鼠中，柚皮苷可降低結(jié)直腸癌癌前病變及結(jié)直腸癌重構(gòu)[11]；柚皮苷可防治偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的小鼠慢性結(jié)直腸炎及癌變[12]。柚皮苷對人結(jié)直腸癌細(xì)胞生長影響及機制尚未明確。有研究顯示，柚皮苷可調(diào)控miR126/VCAM1抑制非小細(xì)胞肺癌生長[13]。因此，本研究旨在柚皮苷是否可調(diào)節(jié)miR-216a影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡，以期為結(jié)直腸癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 柚皮苷購自中國藥品生物制品檢定所；RPMI 1640培養(yǎng)基和青鏈霉素均購自美國Gibao公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光液及細(xì)胞凋亡試劑盒均購自中國碧云天；KIAA1199抗體購自美國Abcam公司；脂質(zhì)體2000試劑均購自美國Invitrogen公司；MTT、DMSO均購自美國Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620、LOVO和HCT116及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460均購自美國ATCC。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞。每天換液1次。細(xì)胞達(dá)80%～90%生長密度時進(jìn)行傳代。實驗為生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-216a和KIAA1199基因表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA在260/280吸光度值(OD)，將OD值在1.8～2.0的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計miR-216a和KIAA1199引物，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，所有引物序列如下：miR-216a F 5’-ACACTCCAGCTGGGCATTATTACTTTTGG-3’，R 5’-TGGTGTCGTGGAGTJP2CG-3’；U6 F 5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，R 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；KIAA1199 F 5’-TGCCACGGTCTATTCCATC-3’，5’-TCCTTTACCAACCCCAATG-3’；GAPDH F 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，R 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；以cDNA產(chǎn)物為模板，參照qRT`-PCR試劑盒說明配置20 μl PCR反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)條件，設(shè)置5個復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)所得Ct均值，以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-216a基因和KIAA1199基因的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.4 Western blotting檢測KIAA1199表達(dá) 細(xì)胞中加適量裂解液，4℃反應(yīng)30 min后，離心，移液器吸取管內(nèi)上清液，上清即為提取總蛋白。BCA法定量蛋白。按照1∶4比例將總蛋白及上樣緩沖液混勻，100℃沸水變性5 min。每孔40 μg變性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)PVDF膜后，將轉(zhuǎn)移完成的膜置于TBST中漂洗1次，然后使用5 %的BSA封閉液在室溫條件下封閉膜2 h，TBST洗膜。加1∶1 000稀釋的KIAA1199抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜。加1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h。膜含蛋白一側(cè)滴加ECL顯色液，放入成像儀內(nèi)進(jìn)行曝光處理，成像并保存圖片。Image J軟件分析灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，得出KIAA1199的相關(guān)表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以1×106個/孔接種SW620細(xì)胞于6孔板，每孔2 ml，24 h后細(xì)胞達(dá)60%～70%生長密度時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h換液，在1.5 ml無菌管中配置A液：脂質(zhì)體2 000與無血清及無雙抗的混合液，體積為250 μl；B液：miR-216a mimics及mimics對照(miR-NC)、miR-216a inhibitor及對照(anti-miR-NC)、KIAA1199過表達(dá)載體(KIAA1199組)及空載體(pcDNA3.1組)與脂質(zhì)體2000混合液，體積為250 μl。將A液和B液在室溫條件下放置5 min，輕柔混勻，室溫放置20 min。將復(fù)合物加入6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，換成含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗研究。

1.6 MTT檢測細(xì)胞增殖 以5 000個/孔接種對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L柚皮苷處理細(xì)胞，miR-216a mimics及miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)置5個平行孔。分別在處理的24 h、48 h和72 h收集細(xì)胞，每孔加5 mg/ml的MTT試劑20 μl，常規(guī)孵育4 h，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于振蕩器上震蕩5 min。結(jié)晶溶解充分后，酶標(biāo)儀測定490 nm波長下各組細(xì)胞光密度值(OD值)。實驗重復(fù)3次。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 收集使用0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷及miR-216a mimics處理48 h的SW620細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加250 μl的binding buffer重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。取100 μl細(xì)胞懸液于流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC溶液，室溫避光靜置15 min，然后加10 μl PI溶液，室溫避光靜置5 min。細(xì)胞充分染色后，再加入300 μl的binding buffer溶液，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?在線生物信息學(xué)預(yù)測工具顯示，miR-216a的5’UTR與KIAA1199 的3’UTR有連續(xù)的結(jié)合位點。依據(jù)結(jié)合位點信息構(gòu)建野生型KIAA1199 3’UTR報告載體(KIAA1199-WT)，其后以KIAA1199-WT為模板對其結(jié)合位點進(jìn)行突變，得到突變型KIAA1199 3’UTR報告載體(KIAA1199-MUT)。將KIAA1199-WT及KIAA1199-MUT分別與miR-216a mimics共轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，使用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活力。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-216a基因和KIAA1199基因表達(dá) 以正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460為對照，qRT-PCR檢測三株結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW620、LOVO和HCT116)miR-216a和KIAA1199基因mRNA表達(dá)，Western blotting檢測KIAA1199蛋白表達(dá)，與NCM460細(xì)胞miR-216a和KIAA1199表達(dá)比較，三株結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-216a基因表達(dá)明顯降低，KIAA1199基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。選擇SW620細(xì)胞作為研究對象。見圖1，表1。

圖1 Western blotting檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞KIAA1199蛋白表達(dá)

表1 miR-216a和KIAA1199在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-216a和KIAA1199靶向關(guān)系驗證 生物信息學(xué)軟件顯示miR-216a序列與KIAA1199 3’UTR區(qū)存在連續(xù)的結(jié)合位點。將構(gòu)建的KIAA1199-WT質(zhì)粒和KIAA1199-MUT質(zhì)粒與miR-216a mimics共轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，miR-216a mimics與KIAA1199-WT共轉(zhuǎn)染較其余3組(miR-NC與KIAA1199-WT組、miR-NC與KIAA1199-MUT組、miR-216a mimics與KIAA1199-MUT組)熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，其余3組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示miR-216a與KIAA1199存在靶向關(guān)系。進(jìn)一步證實miR-216a對KIAA1199表達(dá)的影響，通過qRT-PCR將miR-216a mimics/inhibittor轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后KIAA1199基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-216a mimics的SW620細(xì)胞KIAA1199基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低，轉(zhuǎn)染miR-216a inhibittor的SW620細(xì)胞KIAA1199基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。說明miR-216a與KIAA1199存在靶向關(guān)系，miR-216a可負(fù)向調(diào)控KIAA1199的表達(dá)。見圖2，表2、3。

圖2 miR-216a與KIAA1199 3’UTR結(jié)合位點及轉(zhuǎn)染miR-216a mimics/inhibittor的SW620細(xì)胞KIAA1199蛋白表達(dá)

表2 雙熒光素酶報告基因檢測miR-216a和KIAA1199的靶向關(guān)系

表3 SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-216a mimics/inhibittor后KIAA1199 mRNA及蛋白表達(dá)

2.3 miR-216a靶向KIAA1199基因?qū)W620細(xì)胞增殖凋亡的影響 將miR-216a mimics及miR-216a mimics和KIAA1199過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，細(xì)胞增殖及凋亡檢測結(jié)果，與miR-NC組比較，miR-216a組和miR-216a+pcDNA3.1組細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。miR-216a組和miR-216a+pcDNA3.1組細(xì)胞活力及凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與miR-216a+pcDNA3.1組比較，miR-216a+KIAA1199組細(xì)胞活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 miR-216a 靶向KIAA1199對SW620細(xì)胞凋亡的影響

表4 miR-216a 靶向KIAA1199對SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.4 柚皮苷對SW620細(xì)胞增殖凋亡的影響 MTT結(jié)果顯示，0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷處理SW620細(xì)胞后，細(xì)胞活力明顯降低，呈現(xiàn)劑量和時間依賴性(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷處理SW620細(xì)胞48 h，細(xì)胞凋亡率明顯升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 不同濃度柚皮苷對SW620細(xì)胞凋亡的影響

表5 不同濃度柚皮苷對SW620細(xì)胞增殖凋亡的影響

2.5 柚皮苷對miR-216a和KIAA1199基因表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L的柚皮苷處理SW620細(xì)胞48 h，miR-216a 基因mRNA表達(dá)明顯升高，KIAA1199基因mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均明顯降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見表6，圖5。

表6 不同濃度柚皮苷對SW620細(xì)胞miR-216a和KIAA1199基因mRNA表達(dá)的影響

圖5 Western blotting檢測柚皮苷對SW620細(xì)胞KIAA1199蛋白表達(dá)的影響

3 討論

miRNA是一種小分子非編碼RNA，可通過與靶mRNA特異性結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其靶蛋白合成，從而影響細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等過程[14]。結(jié)直腸癌變、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等多個方面，均與miRNA異常表達(dá)有關(guān)，miRNA參與了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的全過程[15]。尋找影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的miRNA及相應(yīng)的致癌或抑癌靶基因?qū)τ谄湓\療具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a在胰腺癌、胃癌、腎癌等多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，其異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[16-18]。本研究檢測了三株結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW620、LOVO和HCT116)中miR-216a基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞中miR-216a表達(dá)最低，因此作為研究對象。過表達(dá)miR-216a可明顯抑制SW620細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示miR-216a與結(jié)直腸癌生長抑制有關(guān)。有研究顯示，miR-216a可通過調(diào)節(jié)KIAA1199/CEMIP抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。KIAA1199是HUGA蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中KIAA家族成員之一，近年來大量研究表明，KIAA1199可影響多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移、粘附等過程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Xu等[20]研究顯示，KIAA1199高表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲、TNM分期及預(yù)后不良有關(guān)；Zhao等[21]研究顯示，KIAA1199可通過PP2A/stathmin促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究使用靶基因預(yù)測軟件及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實KIAA1199是miR-216a的靶基因，進(jìn)一步通過miR-216a mimics/inhibitor證實KIAA1199受miR-216a的調(diào)控。將miR-216a mimics與KIAA1199過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KIAA1199可明顯減弱miR-216a mimics對SW620細(xì)胞增殖、凋亡的影響。提示miR-216a可靶向抑制KIAA1199降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

多項研究指出，柚皮苷有較強的抗癌作用，如Aroui等[22]研究顯示，柚皮苷可通過下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)及p38信號通路抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲和遷移；Raha等[23]研究顯示，柚皮苷通過激活MAPK途徑及下調(diào)PI3K/Akt/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬介導(dǎo)的胃癌 AGS細(xì)胞生長抑制。本研究首先檢測不同濃度柚皮苷對SW620細(xì)胞活力及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)柚皮苷可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與在其他腫瘤中研究結(jié)果一致。通過qRT-PCR檢測柚皮苷對miR-216a和KIAA1199表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度柚皮苷均可上調(diào)miR-216a表達(dá)，下調(diào)KIAA1199表達(dá)。有研究顯示，柚皮苷可通過調(diào)節(jié)miR-19b促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[24]。本研究結(jié)果提示柚皮苷可能通過調(diào)節(jié)miR-216a/KIAA1199影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-216a低表達(dá)，KIAA1199高表達(dá)，miR-216a可通過靶向抑制KIAA1199降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。柚皮苷可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且可上調(diào)miR-216a表達(dá)和下調(diào)KIAA1199表達(dá)。提示柚皮苷可能通過引起miR-216a表達(dá)水平改變進(jìn)而調(diào)控KIAA1199表達(dá)，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡。本研究可能為柚皮苷在結(jié)直腸癌治療及研究中提供了理論基礎(chǔ)。